Introduction
Живые клетки банк метаболической энергии в виде жиров и углеводов и использовать эту энергию для биосинтеза, мембранного транспорта и движения. Часть энергии получают в цитозоле путем преобразования пищевых сахаров непосредственно в процессе гликолиза АТФ. Тем не менее, главным источником производства АТФ в клетке задействовать в митохондриях с помощью митохондриальной дыхательной цепи 1. Архитектура митохондрий обеспечивает необходимую пространственную ориентацию для эффективного и действенного АТФ производства. Митохондрии обладают двойную мембрану, разделенные межмембранном пространстве, и вместе с матрицей, самой внутренней митохондриальной отсека, дом компонентов и координировать химических реакций, участвующих в ATP поколения. Внутренняя мембрана содержит ряд мембраносвязанных белковых комплексов, которые включают дыхательную цепь, а также АТФ-синтазы, белкового комплекса, который приносит АДФ и Pi вместе для образования АТФ. Гостиницаэ мембрана сложена в крист и электроны передаются по дыхательной цепи комплексов через цитохром С, растворимого электронного носителя, который движется между комплексами в пределах межмембранном пространстве. Как двигаться электроны, окисление восстанавливающих эквивалентов происходит, и ионы водорода закачивается из матрицы в межмембранном пространстве. Как следствие высокой концентрации ионов в межмембранном пространстве, электрохимического градиента создает в результате чего мембранного потенциала через внутреннюю мембрану митохондрий (Δψ) 2. Кислород является окончательным акцептором электронов в цепи переноса электронов, а ионы водорода течь через синтазы АТФ из межмембранного пространства обратно в матрице, и при этом непосредственно вызвать образование АТФ. Этот процесс, как описано в целом известен как окислительного фосфорилирования. Складки крист увеличить площадь поверхности внутренней мембраны, что позволяет максимально электронного транспорта и производства АТФ вкаждый митохондрии. Белки, ферменты и другие молекулы, участвующие в окислительном фосфорилировании получены из обоих ядерных и митохондриальных генов. Митохондрии содержат свой собственный кольцевой ДНК, кодирование для 13 белков, а также тРНК и мРНК, необходимых для производства АТФ 3. Тем не менее, многие другие белки необходимы, и, таким образом, ядерная закодирован. Большинство из этих атомных кодируемых белков ориентированы в митохондриях по использованию presequences на N-конце белка-предшественника, и их импорта частично вызвано Δψ 4,5.
За вклад в биоэнергетике клетки, митохондрии и влиять на основные метаболические процессы, такие как TCA и бета-окисления, клеточной сигнализации через регулирующего кальция, а также ключевую роль в апоптозе 6. В частности, во время клеточного стресса, Bcl-2 белки семейства, которые находятся на или взаимодействовать в митохондриальной наружной мембраны может вызвать митохондриальнуюВнешняя проницаемость мембраны (MOMP) 7,8. Во MOMP, цитохром с и другие белки высвобождаются в цитозоль, и вместе с несколькими цитозольных белков образуют комплекс под названием Апоптосома 9,10. Апоптосома активирует каспазы, которые выходят на расщеплять клеточных белков и ДНК во время фазы выполнения апоптоза. Как только происходит MOMP, ΔΨ свернут и производство АТФ остановился. Таким образом, как апоптоза инициируется функции митохондрий нарушена, и изменения в ΔΨ могут быть соотнесены с митохондриальной и клеточной здоровья 12. В то время как апоптоз конечная точка во многих моделях болезни, функции митохондрий и изменения ΔΨ также может дать ценную информацию о возникновении заболевания и / или прогрессирования. Например, митохондриальные структурные и функциональные изменения были зарегистрированы в ходе нейродегенеративных заболеваний 13,14.
В первой части протокола, ISOтельства интактных митохондриях, которые сохраняют свою ΔΨ описано. НЕК-293Т клетки подвергали воздействию различных концентраций и комбинаций рекомбинантного TNF-α, β-IL1 и IFN-γ индуцировать апоптоз. Эти цитокины были выбраны потому, что они часто сообщалось, с высоким содержанием первичных проб человека септических 15 и внешнего пути апоптоза могут быть вызваны взаимодействием TNF-α с его рецептором 6. Так есть тонкие различия, необходимые для выделения функционального митохондрии из первичных тканей по сравнению с культивируемых клеток, и из-за много исследований использует животных, протокол также описывает, как изолировать митохондрии из печени и спинного мозга передних боковой склероз (ALS) модель мыши.
Вторая часть протокола была разработана для мониторинга возмущений в митохондриальной мембране потенциала с использованием потенциал-чувствительный флуоресцентный краситель с флуоресцентным планшет-ридере. Разницас между сотовой статуса (например, по сравнению с здоровым здоровья) дифференцируются путем количественного прочность ΔΨ изолированных митохондрий в сочетании с разобщающих агентов, ингибиторов дыхательной цепи, сложные ингибиторов и ионофоров, все из которых вызывают диссипацию митохондриальной мембранного потенциала. Здоровыми митохондрии, тем больше изменение в ΔΨ при обработке митохондриальных ингибиторов, следовательно, реакция митохондрий могут быть использованы в качестве индикатора функции митохондрий (Dys).
Использование изолированных митохондриях, а не в месте оценки функции предлагает окончательное доказательство того, что патология или лечение непосредственно модулирует изменения в органелл 16-18. Хотя существуют методы в литературе, чтобы изолировать митохондрии от культивируемых клеток, они являются неточными 17 и / или использовать специальное оборудование 16. Этот протокол описывает в деталях метод изоляции имогут быть легко адаптированы к другим клеточных линий, в том числе первичной ткани и культур 13,14,19,20. Многие изолированные митохондрии исследования используют одни и те же митохондриальной разобщители и ингибиторы, используемые в данном протоколе, но с электродом Кларка (21 является типичным примером многих работах, описанных в литературе), что опять-таки является очень специфический и специализированный элемент оборудования. Кроме того, этот традиционный способ имеет недостатки, такие как низкая пропускная способность и высокой сложности 22,23 и требует значительного количества митохондрий (~ 500 мкг / реакция). В этом протоколе, флуоресцентный мембраны зондирования потенциал TMRE зонд используют в сочетании с флуоресцентным планшет-ридере, который является стандартным машина во многих лабораторий. TMRE широко известен, поскольку он быстро проникает в клетку и изолированные митохондрии и может быть использован в низких концентрациях 24. Несколько реакции может быть быстро создана в тандеме и партии анализируют с использованием этого протокола. Кроме того, реакцияс требуют много небольшое количество изолированных митохондрий (~ 10 мкг / реакция). К требует меньше материала, меньше, ткани или клеточной культуры образцы могут быть использованы в качестве отправной точки для изоляции митохондрий, более параллельных или реакции могут быть созданы, и достаточно потенциально материал для других изолированных экспериментах митохондрий, таких как производство АТФ, потребление кислорода, или импорта анализы возможно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных соответствовала Национальных Институтов руководящих принципов Здоровья и были одобрены Wake Forest University Уход за животными и использование комитета. Гнездящихся пар для SOD1G93A [B6SJL-Тя (SOD1-G93A) 1Gur] мышиной модели были получены из лаборатории Джексона (Бар Харбор, ME). Нетрансгенных дикого типа (WT) самки и SOD1G93A мужчины [B6SJL-Тя (SOD1-G93A) 1Gur] были выведены для получения SOD1G93A мышей и нетрансгенных однопометными WT, которые были использованы в экспериментах.
1. моделей для исследования
- Клеточная культура
- Поддержание клеток эмбриональной почки человека (НЕК-T293) клеток в среде DMEM, дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллина-стрептомицина и 1% L-глутамина, при 37 ° С в 5% СО 2.
- Рост клеток в Т75 колбы и позволяют им достичь 90% слияния.
- Провести клетки расщепление с помощью обработки трипсином (0,25% трипсин-ЭДТА) в течение 3-5 мин при температуре 37 ° С в 5% СО 2
- Аспирируйте СМИ и ресуспендируют осадок клеток в культуральной среде.
- Семенной клеток в соответствующем колбу или пластины 7 х 10 4 клеток в T75 колбу 48 ч до цитокинов лечение. Это должно дать ~ 70% Плотность во время лечения.
- Сыворотка голодать клетки 24 ч позже аспирации средства массовой информации и заменить его таким же объемом сыворотки среде (DMEM, стерильный).
- Подготовка TNF-α, IL1-β, и IFN-γ, из лиофилизированного порошка с ультра-чистой воды на рабочих концентрациях 5 мкг / мкл, 10 нг / мкл, и 10 нг / мкл, соответственно, и добавить их в лунки / колбы.
- Treat сыворотки голодали клеток путем добавления растворенных цитокинов непосредственно к клеточной культуральной среде в колбах соответствующих. Лечение состояло из отдельных цитокинов, коктейль из всех 3 (именуемые "* 3"), или стерIle воды в качестве контроля (упоминается как "0").
- Выдержите клеток, обработанных 24, 48 или 72 часов до оценки и сбора урожая.
- Оценка жизнеспособности клеток
- Сделать 5 мг / мл раствора 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразоли (МТТ) в 1X PBS.
- Для 12-луночных планшетах, добавить 100 мкл раствора МТТ в каждую лунку и осторожно встряхните, чтобы обеспечить равномерное распределение.
- Планшеты инкубируют в течение 15 мин-1 час при 37 ° С в 5% СО 2, и проверить под микроскопом на наличие фиолетового окрашивания. Если нет фиолетовый не присутствует, вихревой снова и позволить клетки инкубируют в 5-минутными интервалами до фиолетового не наблюдается. Количество времени, необходимого должна быть определена каждым исследователем.
- Использование повторного пипетки, добавьте 700 мкл МТТ растворителе (4 мМ НСl и 0,1% NP40 в изопропаноле) в каждую лунку и рок пластину (ы) при комнатной температуре в течение 5-10 мин, или пока все фиолетовый цвет не оставил клетки , Если фиолетовыйцвет не выходит из клеток, добавить дополнительные 200 мкл растворителя и продолжают циркулировать.
- Для анализа, принимают по 100 мкл из каждой лунки и поместить в 96-луночный планшет и читать на планшет-ридере использованием 570 нм и опорной длине волны 630 нм, 595 нм, однако также допустимо, если показания берутся в соответствии настроек.
- Животной модели ALS
- Все эксперименты на животных соответствовала Национальных Институтов руководящих принципов Здоровья и были одобрены Wake Forest University Уход за животными и использование комитета. Гнездящихся пар для SOD1G93A [B6SJL-Тя (SOD1-G93A) 1Gur] мышиной модели были получены из лаборатории Джексона (Бар Харбор, ME). Нетрансгенных дикого типа (WT) самки и SOD1G93A мужчины [B6SJL-Тя (SOD1-G93A) 1Gur] были выведены для получения SOD1G93A мышей и нетрансгенных однопометными WT, которые были использованы в экспериментах.
- Выполните генотипирование со стандартными праймеров против мутанта SOD1 25.
2. Выделение митохондрий
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы работать быстро и держать все на льду в течение всей процедуры.
- Подготовка митохондриальной буфер для выделения (MIB), спинного буфер для выделения шнур (SC MIB) и экспериментальным буфера (EB)
- Подготовьте следующие растворы загодя для MIB и EB.
- Сделать 1 М Трис / MOPS путем растворения 12,1 г трис-основания в 70 мл H 2 O. Добавить сухие MOPS, чтобы получить рН до 7,4. Регулировка громкости до 100 мл финале. Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° С.
- Сделайте 1 M Kphos путем смешивания 80,2 мл K 2 HPO 4 и 19,8 мл KH 2 PO 4. Хранить при комнатной температуре.
- Сделать 0,2 М Трис / EGTA добавлением 3,8 г EGTA в 10 мл H 2 O. Добавить 1 M Трис / MOPS до полного растворения, ~ 30-40 мл. Отрегулируйте до 50 мл, стерильный фильтр и хранят при комнатной температуре. Обратите внимание, что pH будет ~ 6,7.
- Сделайте 1 М глутамата путем 10 мл1 М раствор глутаминовой кислоты. Фильтр стерилизовать и хранить 4 ° C.
- Сделать 1 М малат, сделав 10 мл 1 М раствора яблочной кислоты. Добавить Трис / MOPS до 50 мм. Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° С.
- Сделать MIB в концентрации 200 мМ сахарозы, 10 мМ Трис / MOPS, рН 7,4, и 1 мМ EGTA / Трис. Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° С.
- Сделать SC MIB в концентрации 250 мМ сахарозы, 20 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl 2, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ EGTA, 1 мМ DTT, и коктейль ингибитора протеазы.
- Сделать EB в концентрации 125 мМ KCl, 10 мМ Трис / MOPS, рН 7,4, 5 мМ глутамата, 2,5 мМ малат, 1 мМ К фосфат, рН 7,4, и 10 мМ EGTA / Трис. Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° С.
- Подготовка до сбора клеток оборудование.
- Промыть небольшие стеклянные судна и гомогенизации пестиком три раза стерильной водой и поставить на лед.
- Соберите необходимые предметы, такие как стандарт дрель, мобильный Госкомиссии по делам религийчел, 1,5 мл, 15 мл и 50 мл пробирок и решений.
- Митохондрии Изоляция
- Культивируемых клетках
- Для каждого типа образца, используйте две T175 колбы клеток.
- Убедитесь, что клетки ~ 90% сливной и использовать в контрольных экспериментах, или пластины и лечения, как описано выше на стадии 1.2.
- На скамье, аспирация СМИ и промыть прилипшие клетки дважды 15 мл 1x PBS каждый раз.
- Аспирируйте буфер и очистить колбы, чтобы удалить прилипшие клетки со дна колбы.
- Добавить 15 мл 1x PBS в каждую колбу, вихря, и передать отдельных 15 мл конические пробирки и поместите на льду.
- После того, как выскабливание делается, центрифуги пробирки в течение 5 мин при 700 мкг, 4 ° C, используя настольную центрифугу с использованием ротора Бакет.
- Вытяжку супернатанты и ресуспендируйте каждый шарик в 1 мл MIB.
- Объединить оба суспензий и трансфер в небольшой стеклянный сосуд для гомогенизации.
- Добавить MIBна судне, пока буфер не достигает первой линии. Перемешать клетки с пестиком, подключенных к дрели на средней скорости в течение трех проходов. Убедитесь, что судно находится на льду во время этого шага, чтобы не удалить над жидкостью пестик и использовать постоянную скорость с непрерывными проходами.
- Передача гомогенизированный раствор до 50 мл коническую трубку.
- Нарисуйте раствор в 3 мл шприц использованием 18 калибра 1 ½ дюйма иглы и изгнать его обратно в коническую пробирку на льду с 27 калибра ½ дюйма иглы. Заботиться, чтобы изгнать решение в отношении внутренней стенке трубки, чтобы использовать эту силу для разрушения клеточной мембраны.
- Повторите шаги шприцев в общей сложности пять раз.
- Переносят раствор в 15 мл коническую трубку и центрифуги в течение 5 мин при 600 мкг, 4 ° C в настольной центрифуге с использованием ротора Бакет.
- Осторожно удалите супернатант и распространять среди трех 1,5 мл пробирки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Mitochondria в надосадочной жидкости после первого, низкой скорости вращения, в то время как клеточные мембраны и цельные клетки осаждали. - Центрифуга трубки в ротор с фиксированным углом в 10 000 мкг, 4 ° С в течение 5 мин.
- Вытяжку супернатанты и объединить гранул в 100 мкл MIB и сразу же поставить на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Митохондрии являются в осадке после этого высокоскоростного вращения. Митохондрии, как правило, поддерживать их мембранный потенциал для ~ 2-3 ионного льда после выделения и наиболее устойчивы в виде концентрированного раствора в MIB.
- Изоляция митохондрий мыши ткани
- Обезболить мышь в соответствии с протоколом IACUC. Установите испаритель на уровне 5,0% для анестезии. Подтвердил, что животное находится под наркозом из-за отсутствия рефлекса для ног крайнем случае или мигают рефлекс, когда глаз приблизился или постукиванием с помощью ватного тампона. Держите мышь под наркозом для всей хирургической процедуры, сохраняя испарителя между 1,5% и 2,0%.
- ОтлISE печени и спинного мозга у каждого животного и места отдельно в ледяной 1x PBS - / -, чтобы смыть любой крови.
- Для печени, передавать ткани на взвешивания блюдо на льду и нарезать на мелкие части с использованием свежей лезвие в течение 1 мин.
- Добавить ткани и соответствующий буфер (MIB для печени или SC MIB для спинного мозга) в сосуд, пока буфер не достигает первой линии. Перемешать ткани с пестиком вручную в течение пяти проходов. Убедитесь, что судно находится на льду во время этого шага, чтобы не удалить над жидкостью пестик и использовать постоянную скорость с непрерывными проходами.
- Трансфер гомогенаты для очистки 15 мл трубки.
- Центрифуга трубки в ротор с фиксированным углом в 750 мкг, 4 ° С в течение 10 мин.
- Сохранить супернатантами в чистые пробирки и поместите их на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Митохондрии находятся в надосадочной жидкости после первого, низкой скорости вращения, в то время как клеточные мембраны и цельные клетки осаждали. - Повторное приостановить позвоночника гранулы шнур яN 500 мкл SC MIB.
- Re-гомогенизации каждые три раза, только заполнении емкости наполовину с SC MIB этот раз.
- Передача нового гомогената в свежую пробирку.
- Центрифуга в роторе с фиксированным углом в 750 мкг, 4 ° С в течение 10 мин.
- Сочетание этих новых супернатантов, которые содержат больше митохондрий, с первого супернатанта от каждого образца.
- Центрифуга трубки в ротор с фиксированным углом в 10 000 мкг, 4 ° С в течение 5 мин.
- Аспирируйте супернатанты и ресуспендируют гранул печени в 500 мкл MIB и спинного мозга гранул в 50 мкл SC MIB и сразу же поставить на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Митохондрии являются в осадке после этого высокоскоростного вращения. Митохондрии, как правило, поддерживать их мембранный потенциал для ~ 2-3 ионного льда после выделения и наиболее устойчивы в виде концентрированного раствора в MIB. - Выполните концентрации белка анализа для оценки концентрации митохондрий в растворе. Следуйте инструкциис по использованием коммерческого набора Protein Assay или подобный метод 26. Типичные концентрации митохондрий являются: 2 T175 колбы дает ~ 2 мг / мл, 1 печень мыши ~ 3-5 мг / мл, и один мыши спинного мозга ~ 1-3 мг / мл.
- Культивируемых клетках
- Цитохром с анализа с использованием R & D Крыса / мышь цитохром С Quantikine ELISA Kit (адаптировано из протокола, предоставленной производителем).
- Непосредственно перед настройке реакции, развести митохондрий 0,5 мг / мл рабочей концентрации с EB и распространять разводненной митохондрии в 1,5 мл пробирки для реакций (как правило, 30-50 мкл митохондрий на пробирку).
- Добавить либо EB или ДМСО, при 1% от общего объема, в разбавленных митохондрий и инкубировать реакции на станке в течение 7-10 мин. Эти реакции являются стабильными в течение 30 мин при комнатной температуре, если более длительный срок не требуется.
- Пелле митохондрии путем центрифугирования в роторе с фиксированным углом в 10 000 мкг, 4 ° С в течение 5 мин и осторожнылы отделить супернатант и поместить каждый в отдельной 1,5 мл пробирки.
Примечание: Трубы могут быть либо замораживали при -20 ° С для анализа позже или использовать сразу. - Определить высвобождение цитохрома с помощью сравнения концентрации цитохрома с в осадок и надосадочную жидкость 27.
- Подготовка образцов путем растворения гранул в первоначальном объеме реакции с 0,5% ТХ-100 в 1x PBS.
- Для каждого образца, подготовить 2 скважин на ELISA пластины, один для теперь растворенного гранул и один для супернатанта из реакции путем добавления 100 мкл цитохрома С, сопряженной (используйте прямо из бутылки) плюс 100 мкл 0,5% Tx- 100 в 1x PBS, а затем все гранулы или надосадочной пробе.
- Осторожно вихрь пластины низкое значение (уровень 2-4) в течение 20 сек для смешивания, крышку и инкубируют в течение 1 ч, 37 & deg; С.
- Далее, мыть пластины четыре раза промывочным буфером разводненной в соответствии с производстИнструкции Эра. Удалите излишки раствора, нажав скважин на бумажном полотенце.
- Затем добавьте 150 мкл 1: 1 + B проявляющего раствора в каждую лунку и инкубируют пластинки в течение 20-30 мин в темноте при комнатной температуре.
- Наконец, добавьте 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку и принять оптической плотности при 540 нм с использованием микропланшет-ридера. Рассчитайте количество цитохрома с из митохондрий путем сравнения количества цитохрома с в осадке против супернатанта для каждой реакции.
3. Оценка функции митохондрий (Dys)
- Непосредственно перед реакции создан, разбавленных митохондрии до 0,5 мг / мл рабочей концентрации в EB и помещают в 1,5 мл пробирки для реакции (обычно 30-50 мкл митохондрий используются на пробирку).
- Митохондриальная лечения
- Добавить соответствующего лечения (контроль Е.Б., 1 мкМ FCCP смешивали с 50 нМ валиномицина, 10 мкМ ротенон, 5 мкМ олигомицин, 2 мМ KCN, или 200 мкМ АДФ, конечные концентрации), чтобы отделить реакции на 1/10 от общего объема разбавленных митохондрий. Инкубируйте реакции на станке в течение 7 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо соблюдать осторожность при обращении с этими веществами, как случайного проглатывания или поглощения через кожу могут быть вредными. - Развести TMRE, восстанавливали в стерильной воде при рабочей концентрации 100 мкМ и хранили при -20 ° С, до 2 мкм и добавить объем, равный митохондриальной реакционного объема.
- Инкубируйте реакции на станке в течение 7 мин.
- Гранул митохондрии центрифугированием в роторе с фиксированным углом в 10 000 мкг, 4 ° С в течение 5 мин.
- Нагрузка половины объема супернатанта каждого образца на 396-луночный планшет с чтения и флуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: возбуждения и эмиссии длин волн TMRE должны быть оптимизированы в соответствии с инструкциями производителя, используя объем и пластину, которая будет использоваться дляАнализ. Использование стандартного 384-а черной пластины с 25 мкл 1 мкМ TMRE (конечная концентрация реакции) получали самый сильный сигнал с использованием длин волн возбуждения / эмиссии 485 нм / 535 нм. - Рассчитать загнутой разницу в флуоресценции между контролем (EB) и каждой обработки путем деления значения относительной флуоресценции (RFU), полученного от считывающего устройства для экспериментального образца РФС от контрольного образца.
- Добавить соответствующего лечения (контроль Е.Б., 1 мкМ FCCP смешивали с 50 нМ валиномицина, 10 мкМ ротенон, 5 мкМ олигомицин, 2 мМ KCN, или 200 мкМ АДФ, конечные концентрации), чтобы отделить реакции на 1/10 от общего объема разбавленных митохондрий. Инкубируйте реакции на станке в течение 7 мин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Лечение НЕК-293Т с 200 мкг / мл TNF-α, 40 нг / мл IL1-β, и 75 нг / мл IFN-γ (* 3) в течение 24-48 ч приводит к прогрессирующему количеств клеточной гибели (фиг.1А ). Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ анализов и последовательно демонстрирует, что составляет ~ 10% снижение жизнеспособности клеток при лечении 24 ч и ~ 20% меньше при лечении 48 ч. Клетки, обработанные с аналогичными концентрации (100 мкг / мл TNF-α, 40 нг / мл IL1-β, и 75 нг / мл IFN-γ) дают аналогичные результаты клеточной гибели в 48 ч, а лечение отдельных цитокинов показывает, что снижение Жизнеспособность в связи с комбинаторной влияет (рисунок 1b). Данные жизнеспособность на рисунке 1b представляют собой среднее +/- стандартное отклонение 3 отдельных экспериментах каждый в трех экземплярах, и герметичность баров ошибок продемонстрировать воспроизводимость данных. Количество цитокинов можно регулировать в этой обработки протокола к дальнейшему elucidatе вклада каждого цитокина на клеточной гибели, а также дополнительные цитокины или другие факторы также могут быть включены, при условии, соответствующие элементы управления выполнены.
Выделение митохондрий из клеток и тканей была описана в литературе 1940-х годов с 28,29. Предпосылка для процедуры является разрушение клеток с последующим дифференциальным центрифугированием, где сырой митохондрии, как известно, гранул при ~ 10000 х г. Многие протоколы, которые используют изолированные митохондрии требуют интактные двойные мембраны, которые могут поддерживать свое мембранного потенциала, и, следовательно, необходимо оценить целостность когда выделение завершена. При разработке протокола изоляции митохондрии из культивируемых клеток НЕК, цитохром с тест был использован, чтобы указать, если были получены интактные митохондрии. Использование имеющихся в продаже цитохром С ELISA комплектов, митохондрии были количественно после выделения и разбавляют в EB, а затем либо EB или ДМСОдобавлен и реакции для инкубации на поверхности стола. Затем, путем разделения митохондрии от окружающих супернатанта, анализ цитохром с содержанием обеих фракций была использована в качестве датчика для митохондриальной мембраны сохранности; Если большинство цитохрома с сохраняется в митохондриальной гранулы затем митохондрии рассматриваются нетронутыми, в то время как, если более 15% от цитохрома с находится в надосадочной жидкости, затем митохондрии считались непригодными для функциональных исследований. Как видно из таблицы 1, протокол, описанный выходы ~ 12% цитохром с высвобождением и ~ 15% при изолированных митохондрий предварительно обрабатывают ДМСО. Подобные результаты были получены ранее для митохондрий, выделенных из других клеточных линий или тканей животных 19,20,27. Кроме того, митохондриальная целостность и может быть оценено с TMRE, который был использован в процессе выделения печени мыши и спинного митохондрий мозга. Во время начальной developme протокола изоляцияNT, испытания оцениваются митохондрии, выделенные из печени и спинного мозга у здоровых, нормальных мышей митохондрий. Для каждого образца, ΔΨ оценивали путем сравнения флуоресцентный сигнал от изолированных митохондрий, обработанных EB тем, инкубировали с FCCP + валиномицина (таблица 2). Соотношение между флуоресценцией обработанных и необработанных митохондрий> 1 использовали в качестве показателя здоровых, неповрежденных митохондрий.
После успешных протоколов изоляции митохондрии были разработаны, митохондрии изолированы от управления, необработанных клетках и * 3 цитокинов клетками, обработанными или были проанализированы нормальные и SOD1 мыши. НЕК митохондрии из обеих групп были обработаны различными разобщителей и ингибиторов и ΔΨ измеренных изменений поглощения TMRE. Кратное различие в контрольной EB лечение митохондрий разобщающий / ингибитор обработанных митохондрии указывает на разницу в силе ΔΨ между двумя группами (репрезентативные данные и калРасчеты, приведенные в таблице 3). Кроме того, процентное снижение из необработанных клеток * 3 обработанные клетки означают, что митохондриальный здоровье влияние цитокинов лечения, подтверждающие данные жизнеспособности клеток (фигура 2). Оценка прочности ΔΨ с помощью поглощения TMRE с помощью митохондрий, выделенных из печени и спинного мозга четырех отдельных мышей в норме, управления по сравнению с четырех БАС мышах показывают, что здоровье тканей также можно оценить, используя этот протокол. Как показано сгиба различий и процентных уменьшается в ΔΨ, сравнение EB-лечения и FCCP + валиномицин обращения митохондрий от контроля и болезни прогрессировал животных значительно отличаются (Таблица 4 см также ссылается 13 & 14).
Рисунок 1: Гибель клеток индуцируютд от * 3 лечения прогрессирует со временем, и больше, чем с отдельными лечения цитокинов. (A) НЕК-293Т клетки обрабатывали в течение 24 или 48 ч и гибели клеток измеряли с использованием МТТ-анализа. Значения были нормализованы к контролю, необработанные образцы и данные представляют трехкратным измерениям при п = 3, +/- стандартное отклонение. (B) НЕК-293Т клетки обрабатывали отдельных цитокинов или коктейль (* 3) в течение 48 ч и гибель клеток начисленных с помощью МТТ-теста. Данные представляют N = 5 для каждого из отдельного цитокина и N = 6 для * 3, +/- стандартное отклонение.
| Пелле (AU) | Супернатант (AU) | % Цитохром с-релиз | |
| 0 | 0,818 | 0,115 | 12,6 ± 2,27 |
| ДМСО | 0,793 | 0,142 | 15,3 ±; 2.23 |
Таблица 1:. Сохранение цитохрома с в изолированных митохондриях из культивируемых клеток Данные представляют собой среднее значение N = 4, +/- стандартное отклонение.
| Печень 1 | Печень 2 | спинного мозга 1 | спинного мозга 2 | ||
| РФС | EB | 97830 | 94132 | 339716 | 290154 |
| F / V | 435188 | 461299 | 385366 | 482480 | |
| соотношение | 4.45 | 4,9 | 1.13 | 1,66 | |
| EB = экспериментальная буфера и F / V = FCCP + валиномицина. | |||||
Таблица 2:. Измерьте ΔΨ из митохондрий, выделенных из нормальных тканей мыши два отдельных животных были использованы для выделения печени и спинного мозга митохондрий в тандеме (например, печени 1 и спинного мозга 1 из того же животного).
| EB | олиго | гниль | KCN | ADP | F / V | ||
| РФС | 0 | 4844 | 12507 | 12734 | 9925 | 10892 | 4844 |
| * 3 | 6517 | 13639 | 12435 | 10235 | 13154 | 6517 | |
| Кратное различие | 0 | Не Доступно | 2.58 | 2.63 | 2.05 | 2,25 | 2.65 |
| * 3 | Не Доступно | 2,09 | 1.91 | 1,57 | 2.02 | 2.18 | |
| % Снижение | 0 против * 3 | 18.94 | 27.41 | 23.35 | 10.24 | 17.67 | |
| EB = экспериментальная буфер; олиго = олигомицин; гнить = ротенон; KCN = цианистый калий, и F / V = FCCP + валиномицин. | |||||||
Таблица 3: исходные данные и расчеты на клетках сulture изолированными митохондриями эксперименты.
Рисунок 2: Митохондрии выделяют из цитокинов обработанных клеток уменьшилось мембранного потенциала. Процент уменьшения ΔΨ при 0 VS. * 3 для каждой обработки по сравнению с контролем, как рассчитано в таблице 2. Данные представляют собой средние значения одинаковых реакций при п = 3 (олигомицин, ротенон, и FCCP / валиномицина) или N = 2 ( KCN и ADP) +/- стандартное отклонение. * = Статистически значимая р-значения, основанные на кратное различие расчетов; р = 0,03, 0,01, и 0,05 для олигомицину, ротеноном и FCCP / валиномицина, соответственно.
| Спинной мозг | Печень | ||
| кратную разницу | Контроль | 1,54 ± 0,48 | 3.20 ± 1.56 |
| SOD1 | 1.10 ± 0.30 | 3.12 ± 1.75 | |
| % Снижение | 28,1 | 2.48 | |
| р-значение | 0,03 | 0,41 |
Таблица 4: Митохондрии выделяют из спинного мозга в SOD1 мышей уменьшились мембранного потенциала по оценке FCCP + валиномицин Данные представляют собой среднее из 4 животных в группе..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Лечение НЕК-293Т с рекомбинантных цитокинов вызывает умеренное количество клеточной смерти в течение 48 ч (рис 1). Количество гибели клеток, индуцированной ФНО-альфа лечения аналогичен ранее опубликованных исследований 30 и жизнеспособность клеток уменьшается после совместного введения нескольких цитокинов, которые больше итоговой суммы с любой цитокин одна также согласуется с литературой 31,32. Возможность регулировать количество и типы цитокинов, лечения, а также сравнение коктейлей до отдельных цитокинов делают эту модель культуры клеток привлекательным для изучения специфических эффектов цитокинов воздействия на клетки почек. Кроме того, результаты очень воспроизводимым и легко достигается (рис 2). Соображения иметь в виду, включают в себя слияние клеток. Например, клетки, обработанные при 100% слияния не реагируют, а на одних и тех же концентраций цитокинов при обработке на 70-80% конфлюенс. Кроме того, количество каналов клетки прошли через должны быть найдены, а клеточный ответ мог быть под влиянием побывав в культуре слишком долго (более 8-12 недель после оттаивания). В то время как обработка культивируемых клеток цитокинами снижение жизнеспособности клеток и впоследствии митохондрий здоровье, это ни в коем случае не модель для сепсиса как таковой. Тем не менее, использование более клинически значимых модели, такие как использование клеток первичной почки, выделенные из мышей и / или лечения с естественным секретируемых цитокинов из стимулированных Thp1 клеток 33, является естественным продолжением этой работы. Учитывая разрыв в понимании почечной недостаточности во время сепсиса, такие модели культуры клеток и оценку митохондрий может обеспечить первоначальное понимание механизмов, а также предварительный платформу для тестирования эффективности фармацевтических соединений, профилактических или вмешательство лечения.
Митохондрии выделяют из культивируемых клеток или тканей животныхсебе способность быстро оценивать влияние клеточных препаратов или прогрессирования заболевания на митохондриальной здоровья. Протоколы изоляции и оценки технически не требуя выполнения, и может быть легко модифицирована для использования с другими клеточных линий или первичных тканей. MIB и EB для каждого типа образца хорошие стартовые рецепты, которые могут быть скорректированы по мере необходимости, если частности клетку или ткань типа имеет различные требования. Например, добавление жирных кислот БСА, как правило, необходим для использования с нейронами, как в комплекте с спинного мозга протокола 15,34. Способ разрушения клеток также может быть изменена с помощью шприца больше высылки или изменение в руки гомогенизации, а не с помощью дрели или наоборот. Кроме того, повторно гомогенизации первого центрифугирования гранулы, как это было сделано в спинного мозга митохондрий процедуры, которые могут потребоваться для получения удовлетворительного количество митохондрий. Хороший индикатор, что протокол изоляции производит жизнеспособные mitochondriявляется использование цитохрома с ELISA. Этот анализ легко и быстро альтернативой западной блот-анализа цитохром с-релизе, а также полезно оценка цитохрома с из митохондрий после лечения митохондрий с пептидами или других соединений 19,27. Кроме того, TMRE могут быть использованы при разработке протокола, но важно, чтобы оценить митохондрии, выделенные из образца, который, как известно, быть здоровым. Кроме того, когда выделения митохондрии из тканей мыши, которые не описаны обычно в литературе, митохондрий печени может служить в качестве положительного контроля, а также использоваться, чтобы установить базовую линию. Например, как в данном протоколе, печень от каждого животного, как во время разработки протокола, а также экспериментов были также вырезали и использовали для выделения митохондрий. Другое соображение для приготовления это количество митохондрий, полученных в конце процедуры выделения. Если концентрация митохондрий составляет 1 мг / мл или менееРезультаты анализа могут оказаться ненадежными (неопубликованные наблюдения VDGM). Либо количество исходного материала, MIB рецепта или метода разрушения должны быть оптимизированы, прежде чем перейти к функциональных анализов. После того, как успешно протокола изоляции достигается, митохондрии могут быть также использованы в других анализах, таких как общего содержания АТФ и АТФ поколения 13,14.
Протокол функция митохондрий описано здесь позволяет косвенного измерения митохондриальной поглощения в TMRE потенциального зондирования красителя с использованием стандартного флуоресцентного планшет-ридер. После митохондрии были выделены и соответствующие химические вещества добавляют, они инкубировали с TMRE а затем осаждали. При обработке целых клеток или животных и выделение митохондрий до ΔΨ оценку, не оправдав такие переменные, как с множественной лекарственной устойчивостью транспорта или потока АТФ избежать. Количество флуоресценции в надосадочной жидкости затем анализируют с пониманием, что здоровее митохондриичем сильнее их ΔΨ и, следовательно, более поглощение TMRE. В результате, количество флуоресценции в надосадочной жидкости должна быть меньше, в здоровых митохондрий и более вредных митохондрий. В том числе в EB-только лечение, кратное различие флуоресценции между этим элементом управления и несвязанных митохондрий может быть вычислена. Еще одним важным управления с каждого набора реакций перспективе является TMRE в одиночку. Результат от этого контроля обеспечивает максимально возможную флуоресцентную чтение. С TMRE добавлено реакций недавно разводили, есть естественной изменчивости. Например, TMRE только для чтения ~ 20000, 25000 и 30000 были достигнуты в разное время в процессе разработки протоколов. Если TMRE только сигнал намного больше, чем любой из обработанных образцов митохондрий и / или, если обработанные митохондрии не отличается от лечения, то изоляция в сочетании митохондрий, скорее всего, не увенчались успехом. Уменьшение ΔΨ как измерено отношение полученногопри следовании этого протокола похож на ранее сообщалось количествах для контроля, здоровых клеток 2,35. Сравнение ΔΨ изменений из митохондрий, выделенных из контроля, необработанных НЕК-293Т и * 3 цитокин-клеток, обработанных показали, что снижение жизнеспособности клеток наблюдается в МТТ анализов приводит к снижению функции митохондрий. Это ридер анализа могут быть легко использованы с митохондриями, выделенными из любого источника и использовали для исследования моделей болезней, таких как БАС, как показано здесь 13,14.
Несколько исследований использовали митохондрии конкретных флуоресцентных красителей для определения MOMP, которые являются важными в возникновении этого ридере анализа. Тем не менее, эти исследования либо использовать целые клетки для скрининга соединений, которые блокируют или вызывают MOMP 35,36, исследовать новые ΔΨ красители зондирования 2 или выявить другие форматы, такие как проточной цитометрии на микрочипе 37. Этот протокол является уникальным в том, что она описывает объявлениеetailed метод, чтобы изолировать и использовать митохондрии быстро исследовать эффекты лечения цельноклеточная через ответ на известных ΔΨ изменяющих соединений. Этот протокол использует различные разобщителей и ингибиторов, и указывает, что любой из них будет вполне подходящим для оценки митохондриальной здоровья. Таким образом, в то время как этот отдельный следственные центры на митохондриальных изменений вследствие клеточного стресса или прогрессирующей клеточной дисфункции, протокол также может быть использован для изучения изменений в митохондриальной метаболизма путем использования конкретных соединений и / или добавлением электронных источников, таких как сукцинат и NADH ,
Важные соображения при выполнении изолированных оценку митохондрий включают последовательность объемов лечения с учетом митохондрий в MIB и разбавления их в EB непосредственно перед процедуры будет создана, и, используя митохондрии в пределах 3 часов изоляции, чтобы обеспечить их ΔΨ еще поддерживается.Выбор TMRE митохондрий по сравнению с другими конкретных флуоресцентных красителей, таких как JC-1 было связано с возможностью использования малых концентраций и простота анализа флуоресценции с использованием только одной длины волны. Этот метод может быть аналогичным образом проведена с использованием флуоресцентной микроскопии 2,38 или проточной цитометрии 37, однако использование в планшет-ридере занимает меньше времени и требует меньше 35 оптимизации. Кроме того, этот протокол гораздо менее технически требовательный, быстрее выполнять, и более легко воспроизводимые по сравнению с использованием Кларка электрод 22 (Del Gaizo Мур, неопубликованные данные). Титрование суммы каждого митохондриальной лечения может обеспечить дальнейшее понимание функции митохондрий и оптимизации концентрации должны быть выполнены. Общий объем митохондриальных реакций можно регулировать номера количество образца, полученного в процессе выделения, а также в ряде реакций, необходимых лечения. Если это возможно, стандартное количество 50 μ; Л используется; Однако, всего лишь 20 мкл митохондрий производит надежные результаты.
В то время как ΔΨ коррелирует с потреблением кислорода, анализ представлены непосредственно не измеряет потребление кислорода. В то время как люминесцентные кислорода зондирования зонд, таких как MitoExpress были разработаны, по-видимому, чтобы избежать некоторых из недостатков использования Кларк электрода упомянутое выше, цена на реакцию и требование больших количеств митохондрий в анализе остаются ограничения. Таким образом, использование TMRE и классических разобщителей ΔΨ или ингибиторов имеет несколько преимуществ. Опять же, партия анализ нескольких образцов или многократных обработок / образец, воспроизводимость, низкое потребление исходного материала и / или меньшим количеством изолированными митохондриями, необходимого на реакции оказывают этот протокол привлекательным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-glutamic acid | Sigma | G1251 | Can use the potassium salt instead. |
| malic acid | Sigma | M8304 | Can use the potassium salt instead. |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Trisma base | Sigma | T6066 | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| CCCP | Sigma | C2920 | Dilute down to 100 μM as a working stock in ethanol and store at -20 °C. |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Make in DMSO and use as a 5 μM working stock. Store at -20 °C. |
| sucrose | Fisher | S5-500 | |
| KCN | Mallinckrodt | 6379 | Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water |
| rotenone | Sigma | R8875 | Highly toxic. Made in ethanol. |
| oligomycin | Sigma | O4876 | Highly toxic. Made in ethanol. |
| ADP | Sigma | A2754 | |
| TMRE | Sigma | 8717-25mg | Dilute 100 μM stock with EB immediatley before use. |
| DMEM | Gibco | 11965-084 | 1x regular (high glucose). |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-155 | |
| L-glutamine | Fisher | SH3002101 | Store aliquots at -20 °C |
| FBS | Lonza | 14-501F | US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20 °C. |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| DMSO | SIgma | D2650 | |
| Protien Assay Dye (5x) | Bio-Rad | 500-0006 | Any protein assay can substitute. |
| BSA | Fisher | BP1600-100 | Make 2 mg/ml stock in water for protein assay. |
| MTT powder | Sigma | M2128 | Filter sterlize 5 mg/ml stock made in PBS. Store aliquots at -20 °C; store at 4 °C for up to 1 week. |
| Tergitol solution (NP-40) | Sigma | NP40S | |
| Recombinant Human IL-1B | Gibco | PCH08014 | Once opened store aliquots at -20 °C |
| Recombinant Human TNF-alpha | Gibco | PHC3015L | |
| Recombinant Human IFN-gamma | Gibco | PHC4031 | |
| Dulbeccos PBS (-/-) | Sigma | D8537 | Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions. |
| Cytochrom c ELISA kit | R&D systems | DTC0 | Human for HEK-293T cells. |
References
- Madeira, V. M. Overview of mitochondrial bioenergetics. Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).
- Sakamuru, S., et al. Application of a homogenous membrane potential assay to assess mitochondrial function. Physiological Genomics. 44, 495-503 (2012).
- Clayton, D. A. Structure and function of the mitochondrial genome. Journal Of Inherited Metabolic Disease. 15, 439-447 (1992).
- Schatz, G. The protein import system of mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 271, 31763-31766 (1996).
- Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. Mitochondrial protein import: reversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane drives partial translocation and unfolding. Cell. 80, 127-137 (1995).
- Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
- Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, a008714 (2013).
- Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404 (2009).
- Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241, 139-176 (1995).
- Wu, C. C., Bratton, S. B. Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 546-558 (2013).
- Kuwana, T., et al. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly. Molecular Cell. 17, 525-535 (2005).
- Joshi, D. C., Bakowska, J. C. Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons. Journal Of Visualized Experiments. , (2011).
- Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3, 335-350 (2013).
- Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part II, results and discussion. Brain and Behavior. 3, 431-457 (2013).
- Rajapakse, N., Shimizu, K., Payne, M., Busija, D. Isolation and characterization of intact mitochondria from neonatal rat brain. Brain research. Brain Research Protocols. 8, 176-183 (2001).
- Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Analytical Biochemistry. 443, 66-74 (2013).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Debatin, K. M., Poncet, D., Kroemer, G. Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway. Oncogene. 21, 8786-8803 (2002).
- Del Gaizo Moore, V., et al. Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737. The Journal of Clinical Investigation. 117, 112-121 (2007).
- Del Gaizo Moore, V., Schlis, K. D., Sallan, S. E., Armstrong, S. A., Letai, A. BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia. Blood. 111, 2300-2309 (2008).
- Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).
- Hynes, J., et al. Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes. Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).
- Papkovsky, D. B. Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses. Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).
- Galluzzi, L., et al. Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis. Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
- Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members. Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
- Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell. The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).
- Marques-Fernandez, F., et al. TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway. Cell Death & Disease. 4, e493 (2013).
- Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors. Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).
- Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 28, 114-127 (1999).
- Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model. Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).
- Brown, M. R., et al. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Wong, A., Cortopassi, G. A. High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader. Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).
- Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader. Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).
- Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry. Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).
- Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion. The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).
