Introduction
生きている細胞は、脂肪や炭水化物の形で代謝エネルギーを銀行と生合成、膜輸送や移動のためにこのエネルギーを使用しています。いくつかのエネルギーは、解糖の間に直接ATPへの栄養糖の変換によって細胞質ゾルが得られる。しかし、細胞内のATP産生の主な供給源は、ミトコンドリア呼吸鎖1を介してミトコンドリア内活かされている。ミトコンドリアのアーキテクチャは、効果的かつ効率的なATP産生に必要な空間的な方向性を提供します。ミトコンドリアは、膜間スペースと一緒にマトリックスと、最も内側のミトコンドリアのコンパートメント、家のコンポーネントで区切って二重膜を有し、ATP生成に関与する化学反応を調整する。内膜は、呼吸鎖ならびにATPシンターゼ、ATPの形成のために一緒にADP及びPiのをもたらすタンパク質複合体を含む膜結合タンパク質複合体のシリーズを含んでいる。宿小胞体膜はクリステに折り畳まれ、電子はシトクロム c、膜間空間内での複合体との間で移動する可溶性電子伝達体を介して呼吸鎖複合体に沿って渡される。電子が移動すると、還元当量の酸化が発生し、水素イオンは、膜間空間にマトリックスからポンピングされる。膜間空間内の高イオン濃度の結果として、電気化学的勾配は、ミトコンドリア内膜（Δψ）2を横切る膜電位をもたらす構築する。酸素は、電子伝達鎖の最終的な電子受容体であり、水素イオンがバックマトリックス間腔からATPシンターゼを流れ、そうすることによって、直接ATPの形成を引き起こす。その全体が説明されているように、このプロセスは、酸化的リン酸化として知られている。クリステのひだは、最大電子輸送及び内ATP生産を可能にする、内膜の表面積を増加させる各ミトコンドリア。タンパク質、酵素、および酸化的リン酸化に関与する他の分子は、核およびミトコンドリアの両方の遺伝子に由来する。ミトコンドリアは、自分の環状DNA、13タンパク質のためのコード化だけでなく、ATP産生3のために必要なtRNA及びmRNAを含んでいます。しかし、より多くのタンパク質が必要とされ、従って符号化された核である。これらの核コードタンパク質の大部分は、前駆体タンパク質のN末端 プレ配列を用いることにより、ミトコンドリアマトリックスに標的化され、それらのインポートはΔψ4,5によって部分的に駆動される。
細胞の生体エネルギーに寄与超えて、ミトコンドリアはまた、TCAおよびβ酸化、カルシウムの調節を介して細胞内シグナル伝達、ならびにアポトーシス6において重要な役割のような主要な代謝プロセスに影響を及ぼす。具体的には、細胞ストレスの時代に、上に存在するか、または、BCL-2ファミリータンパク質は、ミトコンドリアを引き起こす可能性がミトコンドリア外膜に対話外膜透過（MOMP）7,8。 MOMP中は、 シトクロム cおよび他のタンパク質が細胞質ゾル中に放出され、一緒にいくつかの細胞質のタンパク質との複合体が、アポトソーム9,10と呼ばれる形成する。アポトソームは、アポトーシスの実行段階中に細胞タンパク質とDNAを切断するために行くカスパーゼを活性化させる。 MOMPが発生するとすぐに、ΔΨが崩壊され、ATP産生が停止。アポトーシスが開始されるように、このように、ミトコンドリアの機能が損なわれ、ΔΨの変化はミトコンドリアおよび細胞の健康12と相関させることができる。アポトーシスは、多くの疾患モデル内のエンドポイントであるが、ΔΨのミトコンドリア機能および変更はまた、疾患の発信および/または進行に関する貴重な情報を得ることができる。例えば、ミトコンドリアの構造的および機能的変化は、神経変性疾患13,14の過程で記録されている。
プロトコルの最初の部分では、ISO彼らのΔΨを保持無傷ミトコンドリアの設置とが記載されている。 HEK-293T細胞は、アポトーシスを誘導するために、異なる濃度の組換えTNF-α、IL1-βおよびIFN-γの組合せに曝露した。それらはしばしば、その受容体6への結合TNF-αとの相互作用によって誘発され得る初代ヒト敗血症サンプル15およびアポトーシスの外因性経路において高いことが報告されているので、これらのサイトカインは、選択された。培養した細胞と比較して、一次組織から機能的ミトコンドリアを単離するために必要な微妙な変化があるため、多くの研究は、動物を使用しているため、そして、プロトコルは、肝臓及び側索硬化症（ALS）マウスモデルを前方の脊髄からミトコンドリアを単離する方法を記載している。
プロトコルの第2の部分は、蛍光プレートリーダーを用いて電位感受性蛍光色素を使用して、ミトコンドリア膜電位摂動をモニターするために開発した。違い細胞状態（不健康対すなわち 、健常）との間の、ミトコンドリア膜電位の損失を引き起こす全てが脱共役剤、呼吸鎖阻害剤複合体の阻害剤およびイオノフォアと併せて単離されたミトコンドリアのΔΨの強度を定量することによって区別される。ミトコンドリア健康な、ミトコンドリア阻害剤で処理するとΔΨの変化が大きいので、ミトコンドリアの応答は、ミトコンドリア（DYS）機能の指標として用いることができる。
むしろ機能のその場評価に比べて単離されたミトコンドリアの使用は、病状または治療が直接細胞小器官16-18への変更を調節することを決定的な証拠を提供しています。培養細胞からミトコンドリアを単離するための文献中に記載された方法があるが、それらは17曖昧であり、および/ または特殊な装置16を利用する。このプロトコルは、具体的に単離方法を記載している一次組織および培養13,14,19,20を含む他の細胞株に容易に適合。多くの単離されたミトコンドリアの研究は再び機器の非常に具体的かつ専門的な部分である、（21文学の多くの論文の代表例である）、このプロトコルではなく、クラーク電極を使用したのと同じミトコンドリアの脱共役剤および阻害剤を利用する。さらに、この伝統的な方法は、低いスループットと高い複雑22,23として制限があり、ミトコンドリアのかなりの量（〜500μgの/反応）が必要です。このプロトコルでは、蛍光膜電位感知プローブTMREは多くの研究所において標準機で蛍光プレートリーダーと一緒に使用される。それはすぐに細胞および単離されたミトコンドリアに入り、低濃度24で使用することができるので、TMRE広くみなされている。複数の反応が迅速にタンデムに設定することができ、バッチは、このプロトコルを使用して分析した。また、反応Sは、単離されたミトコンドリア（〜10μgの/反応）の多くは、少量を必要とする。より少ない材料を必要とすることによって、より小さな組織または細胞培養試料がミトコンドリアの単離のための出発点として利用することができ、より多くの複製または反応をセットアップすることができ、そのようなATPの生産、酸素消費量、またはインポートのような他の単離されたミトコンドリアの実験のために潜在的に十分な材料アッセイが可能である。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての動物実験は、健康ガイドラインの国立研究所に適合し、ウェイクフォレスト大学動物実験委員会によって承認された。 SOD1G93A [B6SJL-TGN（SOD1-G93A）1Gur]マウスモデルの繁殖ペアは、ジャクソン研究所（バーハーバー、ME）から入手した。野生型（WT）雌SOD1G93A雄非トランス[B6SJL-TGN（SOD1-G93A）1Gur] SOD1G93Aマウスおよび実験に使用した非トランスジェニックWT同腹子を生成するために飼育した。
調査のための1.モデル
- 細胞培養
- 5％CO 2中、37℃でヒト胚性腎細胞（HEK-T293）を10％熱不活性化ウシ胎児血清、1％ペニシリン-ストレプトマイシン、および1％L-グルタミンを補充したDMEM中で細胞を維持する。
- T75フラスコ中で細胞を増殖し、それらが90％コンフルエンスに到達させる。
- 5％CO 2中37℃で3〜5分間トリプシン処理（0.25％トリプシン-EDTA）を介して細胞分裂を行ってください
- 培地を吸引除去し、培養培地中で細胞ペレットを再懸濁します。
- T75に適切なフラスコまたはプレート7×10 4細胞における種子細胞が治療サイトカインの前に48時間をフラスコ。これは〜処理時の70％の密度を与える必要があります。
- 血清飢餓細胞を24時間後に、メディアを吸引し、無血清培地を同じ体積（DMEM、無菌）で置換することができる。
- 5 PG /μL、10 ng /μLでの作業濃度で超純水を用いて凍結乾燥粉末からのTNF-α、IL1-β、およびIFN-γを、準備、および10 ng /μLで、それぞれ、ウェルに追加/フラスコ。
- 直接適切なフラスコの細胞培養培地に可溶化されたサイトカインの添加により、血清飢餓細胞を治療する。治療は、個々のサイトカインの全3（「* 3」ともいう）、またはアイドルマスターのカクテルからなった（「0」と呼ばれる）、対照としてリル水。
- 評価と収穫前に24、48または72時間処理した細胞をインキュベートする。
- 細胞生存率を評価
- 1×PBS中の3- 5mg / mlの溶液（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）を作る。
- 12ウェルプレートは、各ウェルにMTT溶液100μlを追加し、穏やかに均一な分布を保証するために旋回。
- 5％、37℃で15分〜1時間、CO 2用プレートをインキュベートし、紫色の存在について顕微鏡下でチェックする。紫色のが存在しない場合は、再び旋回し、紫色が観察されるまで細胞は5分間隔でインキュベートすることを可能にする。必要な時間は、各研究者によって決定されるべきである。
- 反復ピペッターを使用して、各ウェルにMTTの溶媒（4mMのHClおよびイソプロパノール中の0.1％NP40）700μlを添加し、5〜10分間室温でプレート（複数可）を揺する、またはすべての紫色は、細胞を左まで。紫色の場合、色は、細胞から出てくる溶剤の追加の200μlのを追加し、旋回し続けない。
- 分析のために、各ウェルから100μlのを取り、96ウェルプレートに配置し、570nmのを使用して、プレートリーダーを630nmの参照波長で読み取り、しかし595nmでの読み取り値は、一貫性のある設定で採取されることもあれば良い。
- ALSの動物モデル
- すべての動物実験は、健康ガイドラインの国立研究所に適合し、ウェイクフォレスト大学動物実験委員会によって承認された。 SOD1G93A [B6SJL-TGN（SOD1-G93A）1Gur]マウスモデルの繁殖ペアは、ジャクソン研究所（バーハーバー、ME）から入手した。野生型（WT）雌SOD1G93A雄非トランス[B6SJL-TGN（SOD1-G93A）1Gur] SOD1G93Aマウスおよび実験に使用した非トランスジェニックWT同腹子を生成するために飼育した。
- 変異SOD1 25に対して標準プライマーを用いて遺伝子型判定を行います。
ミトコンドリアの2の分離
注：それはすぐに作業し、作業中は氷の上のすべてを維持することが重要である。
- ミトコンドリアの分離バッファ（MIB）の調製、脊髄分離バッファ（SCのMIB）と実験バッファ（EB）
- 先にMIBとEBのための時間の以下のストック溶液を準備します。
- H 2 O 70ml中のトリス塩基12.1gを溶解させることにより1 Mトリス/ MOPSを作るpHを7.4に取得するためにドライMOPSを追加します。最後の100ミリリットルにボリュームを調整します。フィルター滅菌し、4℃で保存する。
- KH 2 PO 4のK 2 HPO 4の80.2ミリリットルと19.8ミリリットルを混合して1 M Kphosを行います。室温で保管してください。
- H 2 O 10mlにEGTAを3.8g添加することによって0.2 M EGTA /トリス作る溶解し、〜30〜40ミリリットルまでの1Mトリス/ MOPSを追加します。 50ミリリットル、室温で滅菌フィルターとストアに調整します。 pHが〜6.7になることに注意してください。
- 10mlをすることにより1 Mグルタミン酸を作るグルタミン酸の1M溶液。フィルター滅菌し、店舗、4℃。
- リンゴ酸の1M溶液10ミリリットルを行うことで、1 Mマラテを行います。 50 mMまでのトリス/ MOPSを追加します。フィルター滅菌し、4℃で保存する。
- 200mMのスクロース、10mMのトリス/ MOPS、pHが7.4、および1mM EGTA /トリスの濃度でMIBを確認します。フィルター滅菌し、4℃で保存する。
- 250mMのスクロース、20mMのHEPES-KOH pH7.5の、10のKCl、1.5のMgCl 2、1mMのEDTA、1mMのEGTA、1mMのDTT、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルの濃度でSCのMIBを作る。
- 125のKClの濃度でEBを行い、10mMトリス/ MOPS、pH7.4の5mMのグルタミン酸塩、2.5mMのリンゴ酸塩、1 mMのリン酸カリウム、pH7.4で、10mMのEGTA /トリス。フィルター滅菌し、4℃で保存する。
- 細胞を回収する前に、機器の準備。
- 小さなガラス容器と均質化乳棒を、滅菌水で3回すすぎ、氷上に置きます。
- そのような標準的なドリル、セルSCRA、必要に応じてアイテムを収集PERS、1.5ミリリットル、15ミリリットルと50ミリリットルチューブとソリューション。
- ミトコンドリアの単離
- 培養細胞
- 各サンプルタイプのために、細胞の2 T175フラスコを使用しています。
- 細胞であることを確認してください〜90％のコンフルエントと対照実験、またはプレートに使用し、ステップ1.2で上記のように扱う。
- 作業台の上に、吸引メディアとの1X PBS各15mlで2回付着細胞を洗う。
- 緩衝液を吸引し、フラスコの底から接着細胞を除去し、フラスコをこすり。
- 氷の上円錐管と場所を、各フラスコに1×PBSの15ミリリットルを追加スワール、および個々の15ミリリットルに転送。
- スクレイピングは、スイングバケットローターを用いて、卓上遠心分離機を用いて、700×gで、4℃で5分間、遠心管を完了すると。
- 吸引し上清とMIBの1ミリリットルの各ペレットを再懸濁。
- 均質化のための小さなガラス容器に懸濁液および転送の両方を兼ね備えています。
- MIBを追加容器にバッファが最初の行に到達するまで。 3つのパスのために中程度の速度でドリルに装着乳棒で細胞をホモジナイズする。容器は、液体の上乳棒を削除するには、連続パスで安定した速度を使用しないように、このステップの間に氷の上にあることを確認します。
- 50ミリリットルコニカルチューブに均質化されたソリューションを転送します。
- 18ゲージ1½インチの針を用いて3ミリリットル注射器にソリューションを描画し、27ゲージ1/2インチの針を氷上に戻って円錐管にそれを追放。細胞膜破壊のためにその力を利用するように、管の内壁に対してソリューションを追放するように注意してください。
- 5回の合計のための注射器の手順を繰り返します。
- スイングバケットローターを使用して、テーブルトップ遠心機で600×gで、4℃で5分間15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に溶液を移す。
- 注意深く上清を除去し、3 1.5ミリリットルのチューブの間で分配する。
注：Mitocho細胞膜および未破壊細胞をペレット化している間ndriaは、この最初の低速回転後の上清中にある。 - 万XG、5分間、4℃で固定角ローターで遠心管。
- 吸引し上清と100μlのMIBにペレットを組み合わせて、すぐに氷上に置きます。
注：ミトコンドリアは、この高速スピンした後のペレットである。ミトコンドリアは、典型的には、単離後2-3イオン氷〜のためのそれらの膜電位を維持し、MIB中の濃縮ストック溶液として最も安定しているであろう。
- マウス組織からミトコンドリア単離
- IACUCプロトコルに従って、マウスを麻酔。麻酔を誘導するために5.0％で気化器を設定します。目に近づいたり、綿棒でタップされると動物が足のピンチまたは点滅反射のために反射の欠如によって麻酔をかけていることを確認した。 1.5％と2.0％の間で気化器を保つことによって全体の外科的処置のために麻酔下でマウスを保管してください。
- EXC氷の中に個別に各動物と場所から肝臓および脊髄冷たい1×PBS ISE - / - すべての血液を洗い流すために。
- 肝臓は、氷上で計量皿に組織を転送し、1分間新鮮カミソリの刃を使用して細かく切る。
- バッファは最初の行に到達するまで容器に組織し、適切なバッファー（脊髄のために肝臓またはSC MIBのMIB）を追加します。 5パス手で乳棒で組織をホモジナイズする。容器は、液体の上乳棒を削除するには、連続パスで安定した速度を使用しないように、このステップの間に氷の上にあることを確認します。
- ホモジネートを15 mlチューブをきれいに転送します。
- 750×gで固定角ローター中で遠心管、4°Cで10分間。
- きれいなチューブに上清を保存して、氷の上に置きます。
注：細胞膜および未破壊細胞をペレット化しながらミトコンドリアは、この最初の低速回転後の上清中にある。 - 脊髄ペレットを再懸濁ISC MIBのN 500μL。
- 唯一のSC MIBと血管ハーフウェイこの時間を埋める、各3回を再均質化する。
- 新しいチューブに新しいホモジネートを転送します。
- 遠心機750×gで固定角ローターで、4℃、10分間。
- 各サンプルからの最初の上清と、より多くのミトコンドリアが含まれているこれらの新しい上清を、結合します。
- 万XG、5分間、4℃で固定角ローターで遠心管。
- 吸引し上清と500 MIBのμLと50μlのSC MIBの脊髄ペレットに肝臓ペレットを再懸濁し、直ちに氷上に置きます。
注：ミトコンドリアは、この高速スピンした後のペレットである。ミトコンドリアは、典型的には、単離後2-3イオン氷〜のためのそれらの膜電位を維持し、MIB中の濃縮ストック溶液として最も安定しているであろう。 - 溶液中のミトコンドリアの濃度を推定するためのタンパク質濃度のアッセイを行う。指示に従う商業的タンパク質アッセイキット又は類似の方法26を使用するための。ミトコンドリアの典型的な濃度は以下のとおりです。2 T175フラスコの収量〜2 mg / mlの、1マウス肝臓〜3-5 mg / mlの、そして1マウス脊髄〜1-3 mg / mlの。
- 培養細胞
- （製造業者によって提供されたプロトコルから適応）のQuantikine ELISAキットC R＆Dラット/マウスチトクロームを使用してシトクロム cアッセイ。
- すぐに反応をセットアップする前に、EBと0.5 mg / mlの作業濃度にミトコンドリアを希釈し、反応（チューブあたりミトコンドリアの一般的に30〜50μl）を1.5 mlチューブに希釈したミトコンドリアを配布。
- 希釈されたミトコンドリアに、全体積の1％で、EBまたはDMSOのいずれかを追加し、7〜10分間、ベンチトップでの反応をインキュベートする。より長い時間枠が必要な場合、これらの反応は、室温で最大30分間安定である。
- ペレットを10,000×gでの固定角ローターで遠心分離によるミトコンドリア、4℃で5分間、慎重LY上清を分離し、独立した1.5ミリリットルのチューブにそれぞれ配置します。
注意：チューブのいずれか後の分析のために-20℃で凍結するか、または直ちに使用することができる。 - ペレットおよび上清27にシトクロムc の濃度を比較することにより、シトクロムc の放出を決定します。
- 1×PBS中0.5％のTx-100との反応の元のボリュームでペレットを可溶化することにより、サンプルを準備します。
- 各サンプルについて、 シトクロム cジュゲートの100μlの（直ボトルから使用）プラス0.5％TX-100μlを添加することによって反応をELISAプレート上に2つのウェル、現在可溶化ペレット用と上清のための1つを準備する1×PBSで100、その後、すべてのペレットまたは上清サンプルの。
- 静かに、カバーを混ぜ、1時間、37℃でインキュベートする20秒間プレートを低く設定（レベル2-4）ボルテックス。
- 次に、機械製造に応じて希釈した洗浄緩衝液でプレートを4回洗浄ER者の説明。ペーパータオル上のウェルをタップして余分な溶液を除去。
- 各ウェルに1 A + B現像液、室温、暗所で20〜30分間静置します：次に、1の150μlを添加する。
- 最後に、各ウェルに50μlの停止溶液を追加し、マイクロプレートリーダーを用いて540nmでの吸光度の読み取りを行う。各反応の上清対ペレット中のシトクロムcの量を比較することによって、 シトクロム c の放出の量を計算する。
ミトコンドリアの3。評価（DYS）関数
- 反応は、（通常はミトコンドリアの30〜50μlのチューブごとに使用されている）、セットアップEBと0.5 mg / mlの作業濃度にミトコンドリアを希釈し、反応のために1.5ミリリットルチューブ内に配置されます直前。
- ミトコンドリア治療
- 50 nMのバリノマイシンと混合FCCP適切な治療法を追加します（EB制御、1μM、10μMロテノン、5μMのオリゴマイシン、2 mMのKCN、または200μMのADP、最終濃度）が希釈されたミトコンドリアの総容量番目の 1/10での反応を分離する。 7分間、ベンチトップでの反応をインキュベートします。
注：有害である可能性があり、皮膚を通して誤飲や吸収などのこれらの物質を取り扱う場合は注意が必要です。 - 100μMの作業濃度で滅菌水で再構成し、2μMに、-20℃で保存し、TMREを希釈し、ミトコンドリアの反応容量に等しいボリュームを追加。
- 7分間、ベンチトップでの反応をインキュベートします。
- 万XG、5分間、4℃で固定角ローターでの遠心分離によってペレットのミトコンドリア。
- 負荷396ウェルプレート上の各サンプルの上清容量の半分と蛍光を読み取る。
注：TMREの励起および発光波長は、のために使用されるボリュームとプレートを用いて、製造者の指示に従って最適化されるべきであるアッセイ。励起/発光波長を用いて、1μMTMREを25μlを標準384ウェル黒色プレート（最終反応濃度）最も強い信号が得られたを使用して 485ナノメートル/ 535 nmの。 - コントロール（EB）と対照サンプルからRFUによる実験サンプルのためのプレートリーダーから得られた相対蛍光値（RFU）で割ることにより、各治療の間の蛍光の倍率差を計算する。
- 50 nMのバリノマイシンと混合FCCP適切な治療法を追加します（EB制御、1μM、10μMロテノン、5μMのオリゴマイシン、2 mMのKCN、または200μMのADP、最終濃度）が希釈されたミトコンドリアの総容量番目の 1/10での反応を分離する。 7分間、ベンチトップでの反応をインキュベートします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
200 pg / mlでTNF-α、40 / mlのIL1-β、および75 / mlのIFN-γとHEK-293T細胞の処理（* 3）24〜48時間、細胞死の進行量（ 図1Aにつながる）。細胞生存率はMTTアッセイを用いて評価し、一貫〜24時間の処理による細胞生存率の10％減少し、48時間の処理で〜20％の減少があることを実証した。同様な濃度で処理した細胞（100 pg / mlでTNF-α、40 / mlのIL1-β、および75 / mlのIFN-γ）48時間で同様の細胞死の結果が得られ、そして個々のサイトカインでの治療はの減少することを明らかにし生存率は、組み合わせに起因していること（ 図1B）に影響を与える。 図1Bにおける生存率のデータは、3回の別々の実験を三連にて各ランの平均+/-標準偏差を表し、エラーバーの気密性 は、データの再現性を実証する。サイトカインの量をさらにelucidatこの治療プロトコルを調整することができる電子細胞死に対する各サイトカインの寄与、およびさらなるサイトカインまたは他の因子もまた限り、適切なコントロールが実行されるように、含まれ得る。
細胞および組織からのミトコンドリアの単離は、1940年代以来28,29文献に記載されている。手続きのための前提は、原油ミトコンドリアは〜万×gでペレット化することが知られている分画遠心分離、続いて細胞破壊である。単離されたミトコンドリアを利用する多くのプロトコルは、膜電位を維持することができる無傷の二重膜を必要とするので、それは、分離が完了すると、整合性を評価する必要がある。培養されたHEK細胞からミトコンドリア単離プロトコールの開発中に、 シトクロム cアッセイは、無傷ミトコンドリアが得られたかどうかを示すために使用された。 ELISAキットC市販のシトクロムを使用して、ミトコンドリアはその後、分離後に定量とEB中で希釈し、そしていずれかであったEBまたはDMSO加えて、反応がベンチの上にインキュベートする。その後、上澄み液を周囲からミトコンドリアを分離することにより、両方の画分のチトクロム c含有量の分析は、ミトコンドリア膜の完全性のための尺度として使用した。 シトクロム cの大部分は、ミトコンドリアペレット内に保持された場合のシトクロムcの15％以上を上清中に見出される場合、ミトコンドリア機能研究には適さないと考えられていたしながらミトコンドリアは、インタクト考慮される。 表1に見られるように、単離されたミトコンドリアは、DMSOで前処理された場合、プロトコルは、収率~12％のシトクロム c放出および〜15％を説明した。同様の結果が他の細胞株から単離されたミトコンドリアまたは動物組織19,20,27について以前に報告されている。代替的に、ミトコンドリアの完全性は、マウスの肝臓および脊髄ミトコンドリアの単離の際に使用したTMREを用いて評価することができる。最初の単離プロトコルdevelopme間、NT、試験は肝臓と健康、正常なマウスのミトコンドリアの脊髄から単離されたミトコンドリアを評価した。各サンプルについて、ΔΨはFCCP +バリノマイシン（ 表2）でインキュベートしたものとEBで処理された単離されたミトコンドリアからの蛍光シグナルを比較することによって評価した。 > 1の処理および未処理ミトコンドリアの間の蛍光の比は健康な、無傷のミトコンドリアの指標として用いた。
一度成功したミトコンドリア単離プロトコルは、コントロールから単離したミトコンドリアを開発し、未処理細胞及び* 3サイトカイン処理した細胞、または正常およびSOD1マウスを分析した。両グループからHEKミトコンドリアはTMREの取り込みに変化によって測定様々な脱共役剤および阻害剤とΔΨで処理した。 /阻害剤治療ミトコンドリアを脱共役するための制御EB治療ミトコンドリアにおける倍数差は代表的なデータとCAL（両群間ΔΨの強さの差を示す表3のculations）。また、* 3処理した細胞への未処理細胞からのパーセント減少は、ミトコンドリアの健康が（ 図2）細胞生存率のデータを裏付け、サイトカイン治療の影響を受けたことを意味する。 4 ALSマウスと比較して、肝臓および4つの個々の正常対照マウスの脊髄から単離したミトコンドリアを用いたTMRE取り込みを介してΔΨ強度の評価は、組織の健康は、このプロトコルを使用して評価することができることを示している。 ΔΨにおける倍差および割合が減少することによって示されるように、EB処理とFCCP +対照と疾患が進行した動物からのミトコンドリアのバリノマイシン処理の比較は有意に異なっている（ 表4;も参照13および14を参照）。
図1：細胞死は誘導* 3処理によりdは、経時的進行性個々のサイトカイン治療と比べて大きくなっている。（A）HEK-293T細胞を24時間または48時間処理し、細胞死をMTTアッセイを用いて測定した。値は、未処理サンプルとデータは、n = 3のための3回の測定を表す、コントロールに対して標準化した+/-標準偏差（B）HEK-293T細胞を、個々のサイトカインまたはカクテルで処理した（* 3）48時間および細胞死を評価MTTアッセイを経由。データを表し、nは個々のサイトカインであり、n = 3 * 6のそれぞれについて、5 +/-標準偏差。
| ペレット（AU） | 上清（AU） | ％ シトクロム c の放出 | |
| 0 | 0.818 | 0.115 | 12.6±2.27 |
| DMSO | 0.793 | 0.142 | 15.3±。 2.23 |
表1：培養細胞から単離されたミトコンドリアにおいてシトクロム cの保持データは、n = 4の平均+/-標準偏差を表す。
| 肝臓1 | 肝臓2 | 脊髄1 | 脊髄2 | ||
| RFU | EB | 97830 | 94132 | 339716 | 290154 |
| F / V | 435188 | 461299 | 385366 | 482480 | |
| 比 | 4.45 | 4.9 | 1.13 | 1.66 | |
| EB =実験的なバッファーとF / V = FCCP +バリノマイシン。 | |||||
表2：つの別々の動物をタンデムに肝臓および脊髄ミトコンドリアを単離するために使用された正常なマウス組織から単離したミトコンドリアのΔΨの測定 （ 例えば 、肝臓1および脊髄1は、同じ動物からのものである）。
| EB | オリゴ | 腐敗 | KCN | ADP | F / V | ||
| RFU | 0 | 4844 | 12507 | 12734 | 9925 | 10892 | 4844 |
| * 3 | 6517 | 13639 | 12435 | 10235 | 13154 | 6517 | |
| 倍の差 | 0 | NA | 2.58 | 2.63 | 2.05 | 2.25 | 2.65 |
| * 3 | NA | 2.09 | 1.91 | 1.57 | 2.02 | 2.18 | |
| ％減少 | 0対* 3 | 18.94 | 27.41 | 23.35 | 10.24 | 17.67 | |
| EB =実験的なバッファと、オリゴ=オリゴマイシン。腐敗=ロテノン。 KCNは、シアン化カリウム、及びF / V = FCCP +バリノマイシンを=。 | |||||||
表3：セルCからの生データと計算ultureはミトコンドリア実験を単離した。
図2：ミトコンドリアは、サイトカイン処理した細胞から単離された膜電位が低下している 。 表2で計算した各処理のために0対* 3ΔΨの減少率は、対照と比較した。データは、またはn = 2（= 3（オリゴマイシン、ロテノン、およびFCCP /バリノマイシン）nの重複反応の平均を表すKCNおよびADP）+/-標準偏差。倍の差の計算に基づいて、* =統計的に有意なp値。 P = 0.03、それぞれオリゴマイシン、ロテノンとFCCP /バリノマイシン、0.01、および0.05。
| 脊髄 | 肝臓 | ||
| の違いを折る | コントロール | 1.54±0.48 | 3.20±1.56 |
| SOD1 | 1.10±0.30 | 3.12±1.75 | |
| ％減少 | 28.1 | 2.48 | |
| p値 | 0.03 | 0.41 |
表4：FCCP +バリノマイシンによって評価されるようにミトコンドリアは、SOD1マウスの脊髄から単離された膜電位が低下しているデータは群あたり4匹の動物の平均を表す。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
組換えサイトカインとHEK-293T細胞の治療は、48時間（ 図1）を介して細胞死の程度の量を引き起こす。 TNF-α処理により誘導される細胞死の量は、以前に報告された研究30と同様であり、細胞の生存率は、単独でも、文献31,32と一致する任意のサイトカインと総括量よりも大きい複数のサイトカインの同時投与後に減少する。サイトカイン治療の量およびタイプを調整するだけでなく、個々のサイトカインのカクテルを比較する能力は、腎臓細胞に対するサイトカインの曝露の特定の効果を研究するために、この細胞培養モデルは魅力的である。さらに、結果は、非常に再現性であり、容易に（ 図2）を達成した。心に留めておくべき検討事項は、細胞の合流が含まれています。 70〜80％のコンで処理した場合、例えば、100％コンフルエンスで処理した細胞は、サイトカインの同じ濃度に同様に応答しないフルエンス。細胞応答は、おそらく（解凍以来超える8-12週間）が長すぎるために培養液中でされていた影響を与えることができたようにさらに、細胞が介して行っているの通路の数は、追跡されるべきである。サイトカインとともに培養された細胞の処理は細胞生存率およびその後ミトコンドリアの健康を減少が、それは決して敗血症自体のモデルである。しかし、このような刺激THP1細胞33から自然に分泌されたサイトカインでマウスおよび/ または治療から単離された初代腎臓細胞を用いた、より臨床的に関連するモデルの使用は、この作業の自然な拡張である。敗血症時の腎不全の理解のギャップを考えると、そのような細胞培養モデルおよびミトコンドリアの評価は、メカニズムへの最初の洞察ならびに予防または介入治療の医薬化合物の有効性を試験するための予備的なプラットフォームを提供することができる。
培養細胞又は動物組織から単離されたミトコンドリア急速にミトコンドリアの健康上の細胞の処置または疾患の進行の影響を評価する能力を与える。単離および評価プロトコルは、技術的に実行するように要求しておらず、容易に他の細胞株または一次組織との使用のために改変することができる。各サンプルタイプに使用されるMIBとEBは、特定の細胞または組織タイプは、異なる要件を有している場合、必要に応じて調整することができる良好な開始レシピである。脊髄プロトコル15,34に含まれるものとして、たとえば、脂肪酸フリーのBSAの添加は、ニューロンとの使用のために通常必要である。細胞破壊の方法は、よりシリンジ追放を使用して、または手の均質化に変更する代わりに、ドリルまたはその逆を使用することによって変更することができる。さらに、最初の遠心分離ペレットの再均質化、脊髄ミトコンドリア手順で行われるように、ミトコンドリアの満足な量を得るために必要であり得る。アイソレーションプロトコルが実行可能なmitochondriを生成することを示す良い指標チトクロームc ELISAの使用である。このアッセイは、 シトクロム c放出のウェスタンブロット分析を迅速かつ容易に代替され、また、ペプチドまたは他の化合物19,27によるミトコンドリアの処理後、シトクロム c放出の有用な評価である。あるいは、TMREは、プロトコルの開発中に使用することができるが、それは健康であることが知られているサンプルから単離されたミトコンドリアを評価することが重要である。日常的に、文献に記載されていないマウス組織からミトコンドリアを単離する場合さらに、肝臓のミトコンドリアは、陽性対照としての役割を果たすだけでなく、ベースラインを設定するために使用することができる。例えば、このプロトコルのように、すべての動物から、両方のプロトコル開発ならびに実験中の肝臓はまた、切除し、ミトコンドリアの単離のために使用。調製のための別の考慮事項は、単離手順の最後に得られたミトコンドリアの量である。ミトコンドリアの濃度は、その後の1mg / ml以下である場合検定結果は信頼できない（未発表の観察VDGM）を証明することがあります。出発物質の量は、MIBレシピまたは破壊法は、機能アッセイに移動する前に最適化されるべきであるいずれか。成功した分離プロトコルが達成されると、ミトコンドリアはまた、総ATP含量およびATP生成13,14のような他のアッセイに使用することができる。
ここで説明するミトコンドリア機能プロトコルは、標準的な蛍光プレートリーダーを使用して、潜在的なセンシング色素TMREのミトコンドリアの取り込みの間接的な測定を可能にする。ミトコンドリアを単離し、適切な化学物質が追加された後、それらをTMREとともにインキュベートした後、ペレット化する。そのような多剤耐性輸送またはATPフラックスなどの変数を交絡、全細胞または動物を治療し、評価をΔΨ前のミトコンドリアを単離することによって回避される。上清中の蛍光の量を、ミトコンドリア健康なことを理解した上で分析する強く彼らのΔΨとTMREのため、より摂取。その結果、上清中の蛍光量は、不健康なミトコンドリアで健康的なミトコンドリアにおける以下、よりにする必要があります。 EB-のみ処理を含むことにより、この制御及び非結合ミトコンドリアの間の蛍光の倍の差を計算することができる。実行反応のすべてのセットともう一つの重要な制御だけではTMREです。このコントロールからの結果は、可能な最大蛍光読みを提供しています。 TMREを反応物に添加しているので新たに希釈され、固有の変動がある。たとえば、〜20,000 25,000 30,000 TMREのみの測定値は、プロトコルの開発中に様々な時間で達成された。処理されたミトコンドリアは、未処理とは有意に異なっていない、および/または場合TMREのみの信号が処理されたミトコンドリアサンプルのいずれよりもはるかに大きい場合には、結合されたミトコンドリアの単離に成功し、最もありそうでなかった。 ΔΨの減少が得られた比率によって測定されるこのプロトコルを以下のときは、コントロールのために以前に報告された金額、健康な細胞2,35に似ています。コントロールから単離したミトコンドリアを、未処理のHEK-293T細胞及び* 3、サイトカイン処理した細胞からΔΨの変化の比較は、MTTアッセイで観察された細胞生存率の減少は、ミトコンドリア機能の低下に変換されることを実証した。このプレートリーダーアッセイは、容易に任意の供給源から単離されたミトコンドリアを使用13,14は、ここで示されたように、ALSなどの疾患モデルを検査するために使用することができる。
いくつかの研究は、このプレートリーダーアッセイの発生に重要であったMOMPを検出するために、ミトコンドリア特異的蛍光色素を利用している。しかし、これらの研究のどちらか遮断する化合物をスクリーニングまたはMOMP 35,36を誘導するために細胞全体を使用し、染料2またはそのようなマイクロチップ37にフローサイトメトリーなどの他の形式を識別を感知新しいΔΨを探る。それは広告を記述した中でこのプロトコルはユニークです急速に知らΔΨ-変える化合物に対する応答を介して全細胞治療の効果を調査するために、ミトコンドリアを分離して使用するetailed方法。このプロトコルは、脱共役剤および阻害剤の様々な利用、およびそれらのいずれかは、ミトコンドリアの健康を評価するのに適しているであろうことを示している。したがって、による細胞ストレスまたはプログレッシブ細胞機能障害に対するミトコンドリアの変更に関するこの特定の研究センターは、プロトコルは、特定の化合物および/またはコハク酸およびNADHなどの電子源の添加を使用することによりミトコンドリアの代謝の変化を調査するために使用することができる一方。
単離されたミトコンドリアアセスメントを実施する重要な考慮事項は、治療量の一貫性、MIBのミトコンドリアを維持し、治療がセットアップされようとしている直前にEBでそれらを希釈し、そして彼らのΔΨがまだであることを確認するために、分離の3時間以内にミトコンドリアを使用して含まれる維持されている。ザ·そのようなJC-1などの他のミトコンドリア特異的蛍光色素TMRE上の選択は、低濃度の、唯一の波長を用いて蛍光を分析の単純さを使用する能力によるものであった。この方法は、同様に、蛍光顕微鏡2,38を用いて行うこと、またはフローサイトメトリー37を流すことができ、ただし、プレートリーダーの使用は、より少ない時間がかかり、より少ない最適化35が必要である。また、このプロトコルは、実行するために迅速にあまり技術的な要求であり、より容易に再現クラーク電極22（デルGaizoムーア、未発表の観察）を使用する場合と比較して。各ミトコンドリア治療の量を滴定すると、ミトコンドリア機能および濃度の最適化へのさらなる洞察を提供することが行われるべきである。ミトコンドリアの反応の総容量は、分離中に得られた試料の量と同様に必要な治療反応の数に合った調節することができる。 50μの可能な場合は、標準量; Lが使用されている。しかし、ミトコンドリアのわずか20μlのは、信頼性の高い結果が得られます。
ΔΨは、酸素消費量と相関するが、このアッセイは、直接酸素消費量を測定しない提示。そのようなMitoExpressの蛍光酸素センサプローブが開発されてきたが、おそらくクラーク電極は、上記で引用使用downfallsのいくつかを回避するために、反応当たりの価格およびアッセイ当たりミトコンドリアの多量の要件は制限残る。したがって、TMREと古典のΔΨ脱共役剤または阻害剤の使用は、いくつかの利点がある。再び、複数のサンプルまたは複数の治療/サンプル、再現性、低い出発材料要件および/または反応当たりに必要な単離されたミトコンドリアのより少量のバッチ分析が、このプロトコルは、魅力的なレンダリング。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-glutamic acid | Sigma | G1251 | Can use the potassium salt instead. |
| malic acid | Sigma | M8304 | Can use the potassium salt instead. |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Trisma base | Sigma | T6066 | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| CCCP | Sigma | C2920 | Dilute down to 100 μM as a working stock in ethanol and store at -20 °C. |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Make in DMSO and use as a 5 μM working stock. Store at -20 °C. |
| sucrose | Fisher | S5-500 | |
| KCN | Mallinckrodt | 6379 | Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water |
| rotenone | Sigma | R8875 | Highly toxic. Made in ethanol. |
| oligomycin | Sigma | O4876 | Highly toxic. Made in ethanol. |
| ADP | Sigma | A2754 | |
| TMRE | Sigma | 8717-25mg | Dilute 100 μM stock with EB immediatley before use. |
| DMEM | Gibco | 11965-084 | 1x regular (high glucose). |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-155 | |
| L-glutamine | Fisher | SH3002101 | Store aliquots at -20 °C |
| FBS | Lonza | 14-501F | US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20 °C. |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| DMSO | SIgma | D2650 | |
| Protien Assay Dye (5x) | Bio-Rad | 500-0006 | Any protein assay can substitute. |
| BSA | Fisher | BP1600-100 | Make 2 mg/ml stock in water for protein assay. |
| MTT powder | Sigma | M2128 | Filter sterlize 5 mg/ml stock made in PBS. Store aliquots at -20 °C; store at 4 °C for up to 1 week. |
| Tergitol solution (NP-40) | Sigma | NP40S | |
| Recombinant Human IL-1B | Gibco | PCH08014 | Once opened store aliquots at -20 °C |
| Recombinant Human TNF-alpha | Gibco | PHC3015L | |
| Recombinant Human IFN-gamma | Gibco | PHC4031 | |
| Dulbeccos PBS (-/-) | Sigma | D8537 | Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions. |
| Cytochrom c ELISA kit | R&D systems | DTC0 | Human for HEK-293T cells. |
References
- Madeira, V. M. Overview of mitochondrial bioenergetics. Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).
- Sakamuru, S., et al. Application of a homogenous membrane potential assay to assess mitochondrial function. Physiological Genomics. 44, 495-503 (2012).
- Clayton, D. A. Structure and function of the mitochondrial genome. Journal Of Inherited Metabolic Disease. 15, 439-447 (1992).
- Schatz, G. The protein import system of mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 271, 31763-31766 (1996).
- Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. Mitochondrial protein import: reversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane drives partial translocation and unfolding. Cell. 80, 127-137 (1995).
- Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
- Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, a008714 (2013).
- Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404 (2009).
- Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241, 139-176 (1995).
- Wu, C. C., Bratton, S. B. Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 546-558 (2013).
- Kuwana, T., et al. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly. Molecular Cell. 17, 525-535 (2005).
- Joshi, D. C., Bakowska, J. C. Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons. Journal Of Visualized Experiments. , (2011).
- Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3, 335-350 (2013).
- Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part II, results and discussion. Brain and Behavior. 3, 431-457 (2013).
- Rajapakse, N., Shimizu, K., Payne, M., Busija, D. Isolation and characterization of intact mitochondria from neonatal rat brain. Brain research. Brain Research Protocols. 8, 176-183 (2001).
- Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Analytical Biochemistry. 443, 66-74 (2013).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Debatin, K. M., Poncet, D., Kroemer, G. Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway. Oncogene. 21, 8786-8803 (2002).
- Del Gaizo Moore, V., et al. Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737. The Journal of Clinical Investigation. 117, 112-121 (2007).
- Del Gaizo Moore, V., Schlis, K. D., Sallan, S. E., Armstrong, S. A., Letai, A. BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia. Blood. 111, 2300-2309 (2008).
- Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).
- Hynes, J., et al. Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes. Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).
- Papkovsky, D. B. Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses. Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).
- Galluzzi, L., et al. Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis. Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
- Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members. Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
- Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell. The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).
- Marques-Fernandez, F., et al. TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway. Cell Death & Disease. 4, e493 (2013).
- Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors. Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).
- Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 28, 114-127 (1999).
- Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model. Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).
- Brown, M. R., et al. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Wong, A., Cortopassi, G. A. High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader. Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).
- Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader. Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).
- Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry. Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).
- Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion. The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).
