Dra nytta av Minskad Droplet-yta Interaktion att optimera Transport av Bioanalytes i digitala Mikrofluidik

Introduction

Den miniatyrisering av produkter som fungerar med vätska är av största vikt för utvecklingen av "lab-on-a-chip" plattformar. I denna riktning, har de senaste två decennierna upplevt en betydande framsteg inom mikrofluidik, med en mängd olika applikationer. ^1-5 Kontrasterande med transport av vätska i slutna kanaler (kanal mikrofluidik), DMF manipulerar droppar på kedjor av elektroder. En av de mest attraktiva fördelarna med denna teknik är avsaknaden av rörliga delar för att transportera vätskor, och rörelsen omedelbart stoppas genom att stänga av elektriska signaler.

Dock är dropp rörelse beroende av dropp innehåll, förvisso en oönskad egenskap för en universell "lab-on-a-chip" plattform. Droppar som innehåller proteiner och andra analyter hålla sig till enhetsytor, blir orörlig. Vågar jag påstå, har detta varit den största begränsningen för att bredda omfattningen av DMF-program, ^6-8alternativ för att minimera ytan påväxt oönskade bära tillägg av ytterligare kemiska ämnen till droppen eller dess omgivning, vilket potentiellt kan påverka dropp innehåll.

Tidigare vår grupp utvecklat en enhet för att tillåta transporter av celler och proteiner i DMF, utan extra tillsatser (Områdes DW enheter). ⁹ Detta uppnåddes genom att kombinera en yta baserad på ljus sot, ¹⁰ med en anordning geometri som gynnar dropp rullande och leder till en uppåtriktad kraft på den lilla droppen, vilket ytterligare minskar interaktionen droppytan. I detta tillvägagångssätt är dropp rörelse inte förknippas med ytvätning. ¹¹

Målet med den detaljerade metod som beskrivs nedan, är att producera en DMF-anordning med förmåga att transportera små droppar innehållande proteiner, celler och hela organismer, utan extra tillsatser. The Field-DW-enheter banar väg för helt kontrollerade plattformar arbetar till stor del oberoende av dropp kemistry.

Här har vi också närvarande simuleringar som visar att, trots den höga spänning som krävs för enhetens funktion, är spänningsfallet över droppen en liten fraktion av den pålagda spänningen, vilket indikerar försumbara effekter på bioanalytes inuti droppen. Faktum är att preliminära tester med Caenorhabditis elegans (C. elegans), en nematod som används för en mängd olika studier i biologi, visar att maskar simma ostört som spänningar appliceras.

Protocol

OBS: I de förfaranden som beskrivs nedan, måste riktlinjer laboratoriesäkerhets alltid följas. Av särskild betydelse är säkerheten vid hanteringen av hög spänning (> 500 V) och hantering av kemikalier.

1. Beläggning av ett ledande substrat med Candle Soot

1. Skär kopparmetall i rektanglar (75 x 43 mm, 0,5 mm tjock). Rengöra varje kopparsubstrat genom nedsänkning i koppar etsmedel i ungefär 30 sekunder, tvätta med kranvatten i ungefär 20 sekunder, och torka med papperet.
   OBS: Om du använder metod 1 nedan, ändra måtten till 75 x 25 mm för att passa in i maskinen.
2. Sopa en tänd paraffinljus under kopparsubstrat för 30-45 sekunder, för att erhålla en i huvudsak konstant sot beläggning (cirka 40 pm tjock). Hålla substratet vid ~ 1 cm in i lågan. Rör inte den bräckliga sot ytan.

2. Skydda Soot Layer med beläggning

OBS: Det sot Skiktet är mycket bräckligOch måste beläggas för skydd. Två enkla alternativ (metoder 1 och 2 nedan) föreslås här, men mer robusta protokoll är under utveckling.

1. Metod 1
   1. Ladda provet i metall förångare eller förstoftningssystem. Efter drift förfarandena i systemet, evakuera kammaren och börja kontrollerad deponering av guld på sot skiktet (150-200 nm). Låt anordningen svalna till rumstemperatur.
   2. Dip-belägga metalliserade substrat i en 1-dodekantiol lösning (1% v / v, i 95% etanol, ACS / USP-kvalitet), i 10 min i en kemisk huva. Sedan håller enheten i en vinkel nära 60 °, försiktigt tvätta ytan med flera droppar av enbart etanol. Låt anordningarna torr, över natt.
2. Metod 2
   1. I en kemisk huv, omedelbart efter beläggning av substratet med sot och medan substratet fortfarande är varm från ljuslåga, deponera några droppar av fluorerad vätska på en sida avsubstrat, och luta substratet till en vinkel nära 90 °. Sätt in fler droppar, och låt dem rulla över hela sot ytan.
      OBS! När droppen faller på en plats, kommer sot att tvättas bort från det området. Låt de små dropparna av fluorerad vätska sprids så mycket som möjligt.
   2. Bake substratet på en värmeplatta (160 ° C under 15 min) inuti ett dragskåp.
   3. Låt underlaget stå över natten i rumstemperatur före användning. Förvara på obestämd tid.

3. Tillverkning av Top elektroder (Anpassat från Abdelgawad et al. ¹²⁾

1. Rita elektrod använder grafisk design mjukvara. Varje elektrod är 2 mm lång, 0,3 mm bred, och gapet mellan elektroderna är 0,3 mm. Gapet mellan kontakter (att snäppa i kontakten, se nedan) är 2,3 mm (figur 1).
2. Trimma en flexibel kopparlaminat (35 ^ m tjock) i Monarch-format (3,87 x 7,5 inches). Använd andra storlekar if kompatibla med skrivaren. Ladda laminatet i det manuella inmatningsfacket på en färgskrivare.
3. Se till att använda "rika svarta", eller "registreringen black", vid utskrift på kopparplåten (se Abdelgawad et al. ¹² för detaljer) för att möjliggöra en tätare lager av svart bläck på kopparsubstrat, skyddar det tryckta mönstret under etsning . Låt det tryckta substratet torka helt över natten.
4. Inne i en kemisk huv, värma upp (40 ° C) i en bägare med 50 ml koppar etsmedel. Doppa tryckta laminat i bägaren, och skaka den försiktigt i lösningen i ca 10 min. Etsningstiden beror på kopparetsningslösning. Med några minuter, kontrollera korrosion och se om mönstret är intakt.
5. Tvätta omsorgsfullt laminat med vatten, och ta bort beläggning med aceton och etanol i dragskåp. Tvätta en gång, och att försiktigt torka laminatet med pappershandduk.
6. Kläm fast laminatet med elektroder till en glass slide (75 x 25 mm, ~ 1 mm tjock), med hjälp av dubbelhäftande tejp. Undvik luftfickor.
7. Bifoga en film av perfluoroalkoxi PFA till elektroderna som använder tejp. Detta tjänar till att förhindra oavsiktlig kontakt mellan elektroderna med droppen, som skadar topp elektroder på grund av kortslutning.

4. Elektronisk Interface (Circuit i Figur 2)

1. Löd reläer och kondensatorema C till en universell kretskort.
2. Montera resten av de 10 relä drivrutiner på ett lödfritt kopplingsdäck för elektroniska kretsar.
3. Wire varje relä förarens input till en kanal i styrkortet.
4. Försiktigt knäppa de bästa elektroder i ett kontaktdon (Figur 3). Wire varje relä förarutgång till en övre elektrod, såsom visas i figuren. Observera att det finns en jordad kontakt-kontakt mellan ett par av trådar från reläerna, för att minimera elektriska störningar.
   OBS: Kontakten sitter på en justerbar plattform för att styra tHan avstånd (0,1-0,5 mm) mellan topp och botten (sot-belagt) substrat.
5. Använd ett program för att styra tidpunkten för högspänning (HV) ansökan (ca 0,8 sek) till 4 elektroder samtidigt, flytta 1 elektrod i rörelseriktningen (dvs under 0,8 sekunder, manövrera 1234, sedan 2345, 3456, osv ., 0,8 sekunder för varje grupp, och sedan bakåt, så dropp rör sig i motsatt riktning också).

5. Dropp Visualisering och hantering

1. För att spela in dropp rörelse, använder visualiseringssystem, som består av ett 24X - 96x förstoring enhet i kombination med en CCD-kamera. Anslut videobandspelaren till kameran med hjälp av S-video.
2. Pipettera en 4 pl droppe innehållande C. elegans i media på botten av sot belagda substratet.
3. Bringa de bästa elektroderna till ~ 0,3 mm ovanför droppen. Droppen ska vara nära mitten, precis under den femte elektroden, för enklare drift.
4. Slå på elektroniska gränssnitt och hög spänning (500 V _RMS), och justera den övre elektrodavståndet till droppen tills den börjar röra sig. Låt inte de bästa elektrod röra droppen.
5. Samla in data genom att registrera antalet framgångsrika dropp överföringar på enheten som svar på elektriska pulser. Ett lyckat experiment kännetecknas av minst 700 droppöverföringar, dvs en överföring efter varje elektrisk puls.
6. Samla in data kontinuerligt, tills droppen inte rör sig längre svar på 5 till 10 pulser.
   OBS: När ytan börjar brytas ned, kan rörelse återställas genom att de bästa elektrod närmare droppen.

Representative Results

Tidigare har vi använt Field-DW-enheter så att rörelsen av proteiner i DMF. I synnerhet kan små droppar med bovint serumalbumin (BSA) förflyttas i en koncentration 2000 gånger högre än vad som tidigare rapporterats av andra författare (utan tillsatser). Detta berodde på den minskade samspelet mellan droppen och ytan; Figur 4 visar en droppe innehåller fluorescerande-märkta BSA (se Freire m fl ⁹ för mer information om experimenten.). Den första bilden till vänster visar den lilla droppen sitter på sot-belagd yta; mitten en, effekten av det elektriska fältet, vilket, förutom att producera dropp rullande, gäller också en uppåtriktad kraft på den lilla droppen, vilket ytterligare minskar interaktionen med ytan. Notera den skjuvning kontrast (till höger) till ett vanligt alternativ används i DMF, som är en yta belagd endast med fluorerad vätska (utan ljus sot); den starka växelverkan med ytan, som visas med den nedre kontakt enOPIC, hindrar ofta rörelse.

Här använder vi den experimentella uppställningen (Figur 3) för att fortsätta försöken med dessa enheter, nu transportera droppar som innehåller större organismer, masken C. elegans, en nematod som används i en mängd olika biologiska analyser.

Droppar med maskar framgångsrikt aktiveras på sot-substrat. Särskilt Film 1 visar en droppe flyttar som svar på varje spänningspuls (~ 0,8 sek intervall) (observera att vätskefraktionen, hållit sig till en plats utan sot, är ur dropp vägen). Inspektion efter experimenten visade att inga maskar, skräp eller flytande rester, var kvar på droppar vägar efter experimenten, vilket tyder på minskad interaktion mellan droppen och ytan.

Det elektroniska gränssnittet (figur 2) tillåter automatisering och bättre kontroll av rörelse, eftersom samtidig aktivering av grupper av elektroder (Figur 1) Ökar den uppåtriktade kraften, vilket ytterligare minskar interaktionen med ytan.

Olika försök har visat att maskar simma ostört som dropp rör (20 min total aktivering tid), vilket indikerar att den höga spänningen (~ 500 V _RMS) som krävs för enhetens funktion är inte skadligt för den biologiska arter som transporteras. Detta stöds av simuleringar, som har visat att spänningsfallet över droppen är en obetydlig bråkdel (10 ^-6%) av den spänning som krävs för drift (figur 5, potentialskillnad mellan en punkt på toppen och botten av det plan i mitten av droppen); i själva verket, i droppar innehållande Jurkat T-celler, tidigare studier som gjorts av andra författare ¹³ tyder på att sådana minimala spänningsfall inte påverkar cellens livskraft, tillväxt och biokemi. För ytterligare validering, men vi är nu i färd med att utforma experiment för att utvärdera långtidseffekterav spänningen på C. elegans. För de simuleringar som beskrivs här, var en ~ 2 ^ il droppe antas vara av PBS (fosfatbuffrad saltlösning), som sitter på en 30 ^ m tjockt skikt av sot. Den övre och undre elektroder modellerades som koppar, och den pålagda spänningen är lika med 500 V _RMS (Mer information om simuleringarna, se Freire et al. ^9).

Figur 1:. Bild av toppelektroder Varje ett av de 10 är 2 mm lång och 0,3 mm bred. Gapet mellan 2 elektroder är också 0,3 mm, och gapet mellan kontakterna (nederst) är 2,3 mm.

Figur 2:. Skiss över styrsystem för de bästa elektroder, detalj 1 av de 10 relä drivrutinerna Varje toppelektroden is antingen utsätts för spänning eller ansluten till en kondensator. Till höger en bild på kortet med reläerna. Notera att den höga spänningen som krävs för drift hålls borta från styrkortet (vit bas) till vänster. Dropp diagram (Mellanöstern) är anpassad med tillstånd från Freire et al. ⁹ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Vy över försöksuppställningen. Avståndet mellan topp och botten (sot-belagt) substrat är justerbar. Kontakterna från ledande elektroder snäpps in i en kontakt. Ledningarna från reläer (som visas här bara 1, 2 och 3 av de 10 trådar) löds till kontakten, vilket framgår av diagrammet till höger. Observera att det finns en kontakt jordad kontakt (t.ex. anslutningskontakter 2 eller 4) mellan ett par trådar från reläer (t.ex. 1 eller 3), för att minimera elektriska störningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4:. Droppar (4 ul) med Fluorescerande-märkta BSA (10 g / L) Vänster, sittande på en sot baserat substrat; mitten, är en av effekterna av det elektriska fältet att applicera en uppåtriktad kraft på den lilla droppen, vilket ytterligare minimerar interaktion med substratet; höger, liten droppe på en yta belagd endast med fluorerad vätska (inget sot). Anpassad med tillstånd från Freire et al. ⁹

-6%) av spänning för önskad drift.

Film 1 . Droplet med C. elegans på en fält DW-enhet, flyttar som svar på varje spänningspuls (~ 0,8 sek intervall). Den flytande fraktionen som visas längst ned till vänster i videon är inte i droppvägen.

Discussion

Det mest kritiska steget i protokollet är att skydda sot skiktet, direkt förknippade med framgång i rörliga droppar. Metallisera sotet skiktet (metod 1 ovan) tillåter nära 100% av fabrikation framgång. Emellertid är den maximala driftstiden ca 10 min; möjligen är dropp fraktioner blöta sot genom hål i metallskiktet. Beläggning av sot lager med den fluorerade vätskan är det enklaste och snabbaste alternativet, och kräver ett minimum av resurser, men bara 40-50% av (min högst 20) fabricerade substraten arbete - och beläggningen är inte enhetlig. I själva verket är det sot skiktet mycket bräcklig, och de viskösa fluorerade flytande lätt skadar det. Vi arbetar för närvarande med mer robusta alternativ för att skydda sot skiktet, vilket skulle öka drifttiden för anordningen. Emellertid är adsorptionen av dropp innehåll till ytan en viktig aspekt. Tidigare ⁹ vi kvantifierat mängden protein som att-ached till ytan under anordningens drift, och en korrelation mellan fortsatt rörelse och reducerad yta adsorption av bovint serumalbumin (BSA). Trots, är biologisk förorening en komplicerad fråga, och vissa Författarna föreslår även att det kan vara omöjligt att fullständigt undertrycka effekten; i teorin, om bara ett enda protein fäster vid en yta, fler kommer att lockas till denna webbplats. Faktum är att den maximala driftstiden rapporteras för digitala mikrofluidikanordningar (av andra författare ⁶⁾ var ca 40 minuter. Därför är robustheten i ytan en punkt av stor betydelse och fortfarande ett pågående arbete.

Notera att i electrowetting, tillämpningen av spänningen sprider ofta droppen med analyter på ytan, helt hindrar rörelsen, om inte tillsatser används. Dock kan vissa tillsatser vara toxiska, eller kan endast arbeta inom ett intervall av analytkoncentrationen i droppen. Fält-DW-enheter tillåter transport av analyter sträcker from proteiner till enskilda celler och hela organismer, utan extra tillsatser. Dessutom anordningsegenskaper är till stor del oberoende av tjocklek, likformighet och elektriska egenskaper hos sotet skiktet (se Freire et al. ⁹ för ytterligare information).

Därför är betydelsen av den metod som beskrivs här att det utvidgar tillämpningsområdet för ansökningar om DMF, vilket banade väg för utvecklingen av helt kontrollerade lab-on-a-chip-plattformar att fungera i stort sett oberoende av dropp kemi.

Måtten på översta elektroder är kompatibla med skrivarens upplösning, och är inte unikt; smalare och närmare elektroder kan också fungera. I själva verket kan andra metoder för tillverkning av tryckta kretskort i elektronik likaväl användas. Det viktiga är att den lilla droppen utsätts för en olikformig elektriskt fält, och det kommer att röra sig i riktning mot det område där fältet är mer intensiv. Emellertid bör försiktighet iakttas föri konstruktionen för att hålla det elektriska fältet mellan spänningssatta och flytande elektroder under 3 MV / m för att förhindra gnistbildning; Här är fältet ca 1,7 MV / m, utan vassa kanter.

Driften av de elektroniska kretsarna är som följer. Varje övre elektrod, genom en reläkontakt, är antingen ansluten till utgången av en högspänningsförstärkare, eller till en kondensator (C), för att minimera elektriska störningar. Transistorn T tillåter den låga ström som läggs ut av styrkortet, genom motståndet R och kondensatorn C _1, för att styra större ström erfordras för reläspolen för att fungera. Dioden D förhindrar krets skador på grund av den variabla strömmen i spolen (se materiallista för listan över komponenter). Endast en styrkort möjliggör individuell adressering av alla elektroder, och endast en HV strömförsörjning behövs (Figur 2), vilket utspänningar (8-18 kHz, 500-660 V _RMS) efter förstärkning sinusvågen från ett geneator. Observera att HV hålls så långt bort som möjligt från styrsystemet, för att minimera buller och eventuell krets fel.

Analyserna som redovisas här används 4 pl droppar, helt enkelt på grund av att mindre droppar innehållande C. elegans är svårare att pipett. Kulturen i C. elegans kommer inte att diskuteras här, och läsaren ska leta efter protokollen på annat håll (t.ex.., Brenner ^14).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraffin candle			Any paraffin candle
Sputtering system	Denton Vacuum, Moorestown, NJ		Sputter coater Desk V HP equipped with an Au target.
1-dodecanethiol	Sigma-Aldrich	471364
Teflon	Dupont	AF-1600
Fluorinert FC-40	Sigma-Aldrich	F9755	Fluorinated liquid: Prepare Teflon-AF resin in Fluorinert FC-40, 1:100 (w/w), to create the hydrophobic coating.
Graphic design software -Adobe Illustrator	Adobe Systems		Other softwares might be used as well.
Copper laminate	Dupont	LF9110
Laser Printer	Xerox	Phaser 6360 or similar	Check for the compatibility with "rich black" or "registration black" (see text).
Copper Etchant	Transene	CE-100
Perfluoroalkoxy (PFA) film	McMaster-Carr	84955K22
Breadboard	Allied Electronics	70012450 or similar	Large enough to allow the assemble of 10 drivers.
Universal circuit board	Allied Electronics	70219535 or similar
Connector	Allied Electronics	5145154-8 or similar
Control board and control program (LabView software)	National Instruments	NI-6229 or similar
High-voltage amplifier	Trek	PZD700
Capacitors C and C1, 100 nF, 60 V	Allied	8817183
Transistor T, NPN	Allied	9350289
Diode D, 1N4007	Allied	2660007
Relay	Allied	8862527
Visualization system	Edmund Optics	VZM 200i or similar	System magnification 24X – 96X. It is combined with a Hitachi KP-D20B 1/2 in CCD Color Camera.
Recorder	Sony	GV-D1000 NTSC or similar	It is connected to the camera by an S-video cable.
Simulations	COMSOL Multiphysics	V. 4.4