Introduction
La miniaturizzazione dei dispositivi che funzionano con i liquidi è di fondamentale importanza per lo sviluppo di piattaforme "lab-on-a-chip". In questo senso, gli ultimi due decenni hanno visto un significativo progresso nel campo della microfluidica, con una varietà di applicazioni. 1-5 contrasto con il trasporto di liquido nei canali chiusi (microfluidica canale), DMF manipola goccioline su array di elettrodi. Uno dei meriti più interessanti di questa tecnica è l'assenza di parti mobili per il trasporto di fluidi, e il movimento è immediatamente fermato spegnendo segnali elettrici.
Tuttavia, il movimento delle gocce dipende contenuti gocciolina, certamente una caratteristica indesiderabile per una piattaforma universale "lab-on-a-chip". Goccioline contenenti proteine e altri analiti aderire alle superfici dei dispositivi, diventando inamovibile. Probabilmente, questo è stato il limite maggiore per ampliare la gamma di applicazioni DMF; 6-8alternative per ridurre al minimo la formazione di incrostazioni di superficie indesiderato comportano l'aggiunta di specie chimiche in più per la goccia o dei suoi dintorni, che potrebbe potenzialmente influenzare il contenuto delle gocce.
In precedenza, il nostro gruppo ha sviluppato un dispositivo per consentire il trasporto di cellule e proteine in DMF, senza additivi aggiunti (dispositivi di campo-DW). 9 Ciò è stato ottenuto combinando una superficie basata sulla candela fuliggine, 10 con una geometria dispositivo che favorisce goccia di rotolamento e conduce ad una forza verso l'alto sul droplet, diminuendo ulteriormente l'interazione gocciolina superficie. In questo approccio, il movimento gocciolina non è associato con bagnatura superficiale. 11
L'obiettivo del metodo dettagliato di seguito descritto è quello di realizzare un dispositivo DMF in grado di trasportare goccioline contenenti proteine, cellule e interi organismi, senza additivi supplementari. I dispositivi di campo-DW aprono la strada per le piattaforme interamente controllate di lavoro in gran parte indipendentemente goccia chimicory.
Qui, anche simulazioni presenti mostrando che, nonostante l'alta tensione necessaria per il funzionamento del dispositivo, la caduta di tensione attraverso la goccia è una piccola frazione della tensione applicata, indicando effetti trascurabili sulla bioanalytes all'interno della gocciolina. Infatti, prove preliminari con Caenorhabditis elegans (C. elegans), un nematode utilizzato per una varietà di studi in biologia, mostrano che i vermi nuotano indisturbati come vengono applicate tensioni.
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Protocol
NOTA: Nelle procedure descritte di seguito, le linee guida di sicurezza di laboratorio devono essere sempre seguite. Di particolare importanza è la sicurezza quando si tratta di alta tensione (> 500 V) e prodotti chimici di trattamento.
1. Rivestimento di un substrato conduttivo con la candela fuliggine
- Taglio di metallo in rame in rettangoli (75 x 43 mm, spessore di 0,5 mm). Pulire ogni substrato di rame per immersione in mordenzante di rame per circa 30 secondi, lavare con acqua corrente per circa 20 secondi, e asciugare con carta.
NOTA: Se si utilizza il metodo 1 di seguito, cambiare le dimensioni di 75 x 25 mm per adattarsi alla macchina. - Sweep una candela di paraffina candela sotto il substrato di rame per 30-45 secondi, per ottenere un rivestimento di fuliggine approssimativamente uniforme (spessore di circa 40 micron). Mantenere il substrato ~ 1 cm all'interno della fiamma. Non toccare la superficie di fuliggine fragile.
2. Proteggere lo strato di fuliggine con rivestimento
NOTA: Lo strato di fuliggine è molto fragileE deve essere ricoperta per protezione. Due alternative semplici (metodi 1 e 2 di seguito) sono suggeriti qui, ma i protocolli più robusti sono attualmente in fase di sviluppo.
- Metodo 1
- Caricare il campione nell'evaporatore metallo o sistema di sputtering. Seguendo le procedure di funzionamento del sistema, evacuare la camera, e inizia la deposizione controllata di oro sullo strato di fuliggine (150-200 nm). Lasciare raffreddare l'apparecchio a temperatura ambiente.
- Dip-coat substrato metallizzato in una soluzione di 1-dodecantiolo (1% v / v, in etanolo al 95%, ACS / USP grado), per 10 min all'interno di una cappa chimica. Quindi, tenendo il dispositivo ad un angolo vicino a 60 °, lavare delicatamente la superficie con diverse gocce di solo etanolo. Lasciate che i dispositivi a secco, durante la notte.
- Metodo 2
- In una cappa chimica, subito dopo il rivestimento del substrato di fuliggine e mentre il substrato è ancora calda della fiamma candela, versare alcune gocce di liquido fluorurato su un lato dellasubstrato, e inclinare il substrato ad un angolo di circa 90 °. Deposita più gocce, e far rotolare su tutta la superficie di fuliggine.
NOTA: Quando la goccia cade su un punto, la fuliggine verrà spazzato via da quella zona. Lasciare le goccioline di liquido fluorurato diffusione il più possibile. - Cuocere il substrato su una piastra calda (160 ° C per 15 min) all'interno di una cappa chimica.
- Lasciate che il substrato sedersi durante la notte a temperatura ambiente prima dell'uso. Conservare a tempo indeterminato.
- In una cappa chimica, subito dopo il rivestimento del substrato di fuliggine e mentre il substrato è ancora calda della fiamma candela, versare alcune gocce di liquido fluorurato su un lato dellasubstrato, e inclinare il substrato ad un angolo di circa 90 °. Deposita più gocce, e far rotolare su tutta la superficie di fuliggine.
3. Realizzazione di Top elettrodi (adattato da Abdelgawad et al. 12)
- Disegnare gli elettrodi che utilizzano software di progettazione grafica. Ciascun elettrodo è lungo 2 mm di larghezza 0,3 mm, e la distanza tra gli elettrodi è di 0,3 mm. Il divario tra i contatti (a scatto nel connettore, vedi sotto) è di 2,3 mm (figura 1).
- Tagliare un laminato di rame flessibile (35 micron di spessore) nel formato di Monarch (3,87 x 7,5 pollici). Utilizzare altre dimensioni if compatibile con la stampante. Caricare il laminato nel vassoio di alimentazione manuale di una stampante a colori.
- Assicurarsi di utilizzare "nero ricco", o "Registrazione nero", quando si stampa su foglio di rame (vedi Abdelgawad et al. 12 per i dettagli) per consentire uno strato più denso di inchiostro nero sul supporto di rame, proteggendo il motivo stampato durante l'incisione . Lasciate che il supporto stampato asciugare completamente, durante la notte.
- All'interno di una cappa chimica, riscaldamento (40 ° C) un becher con 50 ml di mordenzante rame. Immergere il laminato stampato nel bicchiere, e agitare delicatamente nella soluzione per circa 10 min. Tempo di attacco dipende dalla soluzione mordenzante rame. Ogni pochi minuti, controllare la corrosione e vedere se il modello è intatto.
- Lavare accuratamente il laminato con acqua e rimuovere il rivestimento con acetone ed etanolo nella cappa chimica. Lavare, ancora una volta, e asciugare delicatamente il laminato con il tovagliolo di carta.
- Fissare accuratamente il laminato con elettrodi ad un glass slitta (75 x 25 mm, spessore di ~ 1 mm), con nastro biadesivo. Evitare di sacche d'aria.
- Attaccare un film di perfluoroalkoxy PFA agli elettrodi con i nastri. Questo serve per evitare contatti accidentali degli elettrodi con la goccia, che danneggia migliori elettrodi a causa di corto circuito.
4. L'interfaccia elettronica (circuito in figura 2)
- Saldare i relè ed i condensatori C a un circuito universale.
- Montare il resto dei 10 comandi dei relè di una breadboard per i circuiti elettronici.
- Filo di ingresso ogni driver di relè a un canale nella scheda di controllo.
- Scatto con attenzione i primi elettrodi in un connettore (Figura 3). Filo uscita ogni driver del relè ad un elettrodo superiore, come mostrato in figura. Si noti che esiste un connettore contatto a terra tra una coppia di fili dal relè, per minimizzare il rumore elettrico.
NOTA: Il connettore si siede su una piattaforma regolabile per controllare tha distanza (0,1-0,5 mm) tra superiore e inferiore (fuliggine rivestito) substrato. - Utilizzare un programma per controllare la temporizzazione per alta tensione (HV) applicazione (circa 0,8 sec) a 4 elettrodi contemporaneamente, spostando 1 elettrodo nella direzione del moto (cioè per 0,8 secondi, azionare 1234, poi 2345, 3456, ecc ., 0.8 sec per ciascun gruppo, e poi indietro, si muove in modo gocciolina nella direzione opposta pure).
5. Visualizzazione Droplet e Manipolazione
- Per registrare il movimento gocciolina, utilizzare il sistema di visualizzazione, che si compone di un 24X - assemblaggio ingrandimento 96X combinato con una telecamera CCD. Collegare il videoregistratore alla fotocamera tramite S-video.
- Pipettare una goccia 4 ml contenente C. elegans nel supporto sul fondo del substrato fuliggine rivestito.
- Portare i primi elettrodi a ca 0.3 mm sopra la goccia. La gocciolina dovrebbe essere vicino al centro, proprio sotto il quinto elettrodi, per facilitare le operazioni.
- Accendere l'interfaccia elettronica e alta tensione (500 V RMS) e regolare la distanza elettrodo superiore alla goccia finché inizia a muoversi. Non lasciate che i primi elettrodi toccano la goccia.
- Raccogliere dati registrando il numero di trasferimenti gocciolina successo sul dispositivo in risposta agli impulsi elettrici. Un esperimento di successo è caratterizzata da almeno 700 trasferimenti goccioline, cioè, un trasferimento dopo ogni impulso elettrico.
- Raccogliere dati continuo, fino alla gocciolina non si muove più in risposta a 5 a 10 impulsi.
NOTA: Quando la superficie comincia a degradare, il movimento potrebbe essere ripristinato portando i primi elettrodi più vicino alla goccia.
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Representative Results
In precedenza, abbiamo utilizzato i dispositivi di campo-DW per consentire il movimento delle proteine in DMF. In particolare, goccioline con albumina di siero bovino (BSA) possono essere spostati ad una concentrazione di 2000 volte superiore a quanto precedentemente riportato da altri autori (senza additivi). Ciò è dovuto alla ridotta interazione tra la goccia e la superficie; la figura 4 mostra una gocciolina contenente fluorescente-tag BSA (vedi Freire et al 9 per ulteriori informazioni sulle esperimenti.). La prima immagine a sinistra mostra la goccia seduto sulla superficie rivestita di fuliggine; quello centrale, l'effetto del campo elettrico, che, oltre a produrre gocciolina laminazione, vale anche una forza verso l'alto sul droplet, riducendo ulteriormente l'interazione con la superficie. Si noti il contrasto di taglio (destra) per un'alternativa comune utilizzato in DMF, che è una superficie rivestita solo con liquido fluorurato (senza candela fuliggine); la forte interazione con la superficie, indicata dal contatto inferiore angle, molto spesso ostacola il movimento.
Qui, si usa il set-up sperimentale (Figura 3) per continuare le prove con questi dispositivi, ora il trasporto di goccioline contenenti organismi più grandi, il verme C. elegans, un nematode utilizzato in una varietà di saggi biologici.
Le goccioline con i vermi sono stati attivati con successo su substrati di fuliggine rivestite. In particolare, Film 1 è una gocciolina movimento in risposta a ciascun impulso di tensione (~ 0,8 intervallo sec) (si noti che la frazione liquida, attaccato ad un luogo senza fuliggine, è fuori del percorso goccia). Controllo dopo gli esperimenti hanno rivelato che non vermi, detriti o residui di liquidi, sono stati lasciati in goccioline percorsi dopo gli esperimenti, con l'indicazione ridotta interazione tra goccia e la superficie.
L'interfaccia elettronica (figura 2) permette l'automazione e un migliore controllo del movimento, poiché l'azionamento simultaneo dei gruppi di elettrodi (Figura 1) Aumenta la forza verso l'alto, riducendo ulteriormente l'interazione con la superficie.
Diversi esperimenti hanno dimostrato che i vermi nuotano indisturbati come la goccia si muove (20 min Tempo totale di attuazione), che indica che l'alta tensione (~ 500 V RMS) necessario per il funzionamento del dispositivo non è dannoso per le specie biologiche trasportati. Questo è supportato da simulazioni, che hanno dimostrato che la caduta di tensione attraverso la goccia è una frazione trascurabile (10 -6%) della tensione necessaria per il funzionamento (figura 5, la differenza di potenziale tra un punto nella parte superiore e inferiore del piano di mezzo della goccia); infatti, in goccioline contenenti cellule T Jurkat, studi precedenti effettuati da altri autori 13 suggeriscono che tali cadute di tensione minima non influenzano la vitalità cellulare, la proliferazione e la biochimica. Per ulteriore convalida, però, ci sono attualmente in fase di progettazione di esperimenti per valutare gli effetti a lungo terminedella tensione su C. elegans. Per le simulazioni descritte, una gocciolina microlitri ~ 2 è stato ipotizzato di PBS (tampone fosfato salino), seduto su uno spesso strato di fuliggine 30 micron. Elettrodi superiore ed inferiore sono stati modellati come rame e la tensione applicata pari a 500 V RMS (Per ulteriori informazioni sulle simulazioni, vedi Freire et al. 9).
Figura 1:. Immagine di primi elettrodi Ognuno dei 10 è lunga 2 mm e largo 0.3 mm. Il divario tra i 2 elettrodi è anche 0,3 mm, e il divario tra i contatti (in basso) è di 2,3 mm.
Figura 2:. Schematica del sistema di controllo per i primi elettrodi, dettaglio 1 dei comandi dei relè 10 Ogni elettrodo superiore is sia sottoposto a tensione, o connesso ad un condensatore. A destra, una foto della scheda con i relè. Si noti che l'alta tensione necessaria per il funzionamento viene tenuto lontano dalla scheda di controllo (base bianca) sulla sinistra. Schema Droplet (Medio) adattato con il permesso di Freire et al. 9 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Vista del set-up sperimentale. La distanza tra la parte superiore e inferiore (fuliggine rivestito) substrato è regolabile. I contatti tra le migliori elettrodi sono agganciati in un connettore. I fili di relè (qui illustrati solo 1, 2 e 3 dei 10 fili) sono saldati al connettore, come indicato dal diagramma a destra. Si noti che c'è un connettore a contatto a terra (ad esempio, i contatti del connettore 2 o 4) tra una coppia di fili dal relè (ad esempio, 1 o 3), per ridurre al minimo il rumore elettrico. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Goccioline (4 ml) con fluorescenti-tag BSA (10 g / L) a sinistra, seduto su un substrato a base di fuliggine; mezzo, uno degli effetti del campo elettrico è di applicare una forza verso l'alto sul droplet, riducendo ulteriormente l'interazione con il substrato; a destra, gocciolina su una superficie rivestita solo con liquido fluorurato (senza fuliggine). Adattato con il permesso di Freire et al. 9
Movie 1 . Droplet con C. elegans su un dispositivo di campo-DW, muovendosi in risposta a ciascun impulso di tensione (~ intervallo di 0,8 secondi). La frazione liquida indicata in basso a sinistra del video non è nel percorso gocciolina.
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Discussion
La fase più critica del protocollo è la protezione dello strato di fuliggine, direttamente associata con il successo in goccioline movimento. Metallizzazione lo strato di fuliggine (precedenti metodi 1) permette di quasi il 100% di successo fabbricazione. Tuttavia, il tempo massimo di funzionamento è di circa 10 minuti; eventualmente, le frazioni delle gocce sono bagnare la fuliggine attraverso buchi nello strato di metallo. Rivestimento lo strato di fuliggine con il liquido fluorurato è l'alternativa più semplice e veloce, e richiede risorse minime, ma solo il 40-50% del (min max 20) fabbricato substrati lavoro - e il rivestimento non è uniforme. Infatti, lo strato di fuliggine è molto fragile, ed i liquidi viscosi fluorurati facilmente danneggia. Attualmente stiamo lavorando su alternative più robuste per proteggere lo strato di fuliggine, che farebbe aumentare il tempo di funzionamento del dispositivo. Tuttavia, un aspetto importante è l'adsorbimento dei contenuti gocciolina alla superficie. In precedenza, 9 abbiamo quantificato la quantità di proteina che ATTdoleva alla superficie durante il funzionamento del dispositivo, e una correlazione è stata trovata tra continuato movimento e ridotto assorbimento superficiale di albumina di siero bovino (BSA). Nonostante, biofouling è una questione complessa, e alcuni autori addirittura suggeriscono che potrebbe essere possibile eliminare completamente l'effetto; in teoria, se solo una singola proteina si attacca ad una superficie, maggiore sarà attratto a questo sito. Infatti, il tempo di funzionamento massima riportata per dispositivi microfluidici digitali (da altri autori 6) era di circa 40 minuti. Pertanto, la robustezza della superficie è un punto di grande importanza e ancora un lavoro in corso.
Si noti che, nel elettrowetting, l'applicazione della tensione diffonde spesso la goccia con analiti sulla superficie, interamente ostacolare il movimento, a meno additivi. Tuttavia, alcuni additivi possono essere tossici, o possono funzionare solo in un intervallo di concentrazione dell'analita nel gocciolina. Dispositivi di campo-DW consentono il trasporto di analiti che vanno indietrom proteine di cellule singole e interi organismi, senza additivi aggiunti. Inoltre, le caratteristiche del dispositivo sono in gran parte indipendenti di spessore, uniformità e proprietà elettriche dello strato di fuliggine (vedi Freire et al. 9 per ulteriori informazioni).
Pertanto, il significato del metodo qui descritto è che amplia la portata delle domande di DMF, spianando la strada per lo sviluppo di piattaforme interamente controllate lab-on-a-chip che lavorano in gran parte indipendentemente goccia chimica.
Le dimensioni dei primi elettrodi sono compatibili con la risoluzione della stampante, e non sono unici; elettrodi più strette e più stretti potrebbe anche funzionare. Infatti, altri metodi per la fabbricazione di circuiti stampati in elettronica possono essere usati pure. L'importante è che la goccia è sottoposto ad un campo elettrico non uniforme, e si muove verso la regione dove il campo è più intenso. Tuttavia, occorre prestare attenzionenella progettazione di tenere il campo elettrico tra gli elettrodi sotto tensione e galleggianti sotto 3 MV / m per evitare la formazione di scintille; Qui, il campo è di circa 1,7 MV / m, senza spigoli.
Il funzionamento dei circuiti elettronici è il seguente. Ogni elettrodo superiore, attraverso un contatto di relè, o è collegato all'uscita di un amplificatore ad alta tensione, o ad un condensatore (C), per ridurre al minimo rumore elettrico. Il transistore T consente la bassa corrente outsourcing dalla scheda di controllo, attraverso il resistore R e il condensatore C 1, per controllare la corrente grande richiesta per la bobina del relè a funzionare. Il diodo D previene i danni del circuito a causa della corrente variabile nella bobina (vedi elenco materiali per la lista dei componenti). Solo uno centrale permette indirizzamento individuale di tutti gli elettrodi, è richiesta solo alimentatore HV (Figura 2), che tensioni di uscita (8-18 kHz, 500-660 V RMS) dopo amplificando la sinusoide fornita da un generator. Si noti che HV è mantenuto il più lontano possibile dal sistema di controllo, per minimizzare il rumore e possibili malfunzionamenti del circuito.
I saggi qui riportati utilizzano 4 gocce microlitri, semplicemente per il fatto che piccole goccioline contenenti C. elegans sono più difficili da pipetta. La cultura di C. elegans non verrà discusso in questa sede, e il lettore dovrebbe cercare i protocolli altrove (ad es., Brennero 14).
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Acknowledgments
Ringraziamo la Fondazione Lindback per il sostegno finanziario, e il dottor Alexander Sidorenko e Elza Chu per le discussioni fruttuose e assistenza tecnica, e il professor Robert Smith per l'assistenza con la C. saggi elegans.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin candle | Any paraffin candle | ||
| Sputtering system | Denton Vacuum, Moorestown, NJ | Sputter coater Desk V HP equipped with an Au target. | |
| 1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364 | |
| Teflon | Dupont | AF-1600 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma-Aldrich | F9755 | Fluorinated liquid: Prepare Teflon-AF resin in Fluorinert FC-40, 1:100 (w/w), to create the hydrophobic coating. |
| Graphic design software -Adobe Illustrator | Adobe Systems | Other softwares might be used as well. | |
| Copper laminate | Dupont | LF9110 | |
| Laser Printer | Xerox | Phaser 6360 or similar | Check for the compatibility with "rich black" or "registration black" (see text). |
| Copper Etchant | Transene | CE-100 | |
| Perfluoroalkoxy (PFA) film | McMaster-Carr | 84955K22 | |
| Breadboard | Allied Electronics | 70012450 or similar | Large enough to allow the assemble of 10 drivers. |
| Universal circuit board | Allied Electronics | 70219535 or similar | |
| Connector | Allied Electronics | 5145154-8 or similar | |
| Control board and control program (LabView software) | National Instruments | NI-6229 or similar | |
| High-voltage amplifier | Trek | PZD700 | |
| Capacitors C and C1, 100 nF, 60 V | Allied | 8817183 | |
| Transistor T, NPN | Allied | 9350289 | |
| Diode D, 1N4007 | Allied | 2660007 | |
| Relay | Allied | 8862527 | |
| Visualization system | Edmund Optics | VZM 200i or similar | System magnification 24X – 96X. It is combined with a Hitachi KP-D20B 1/2 in CCD Color Camera. |
| Recorder | Sony | GV-D1000 NTSC or similar | It is connected to the camera by an S-video cable. |
| Simulations | COMSOL Multiphysics | V. 4.4 |
References
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