Introduction
La miniaturisation des dispositifs qui fonctionnent avec des liquides est d'une importance primordiale pour le développement de plates-formes "lab-on-a-chip». En ce sens, les deux dernières décennies ont vu un progrès significatif dans le domaine de la microfluidique, avec une variété d'applications. 1-5 Contrastant avec le transport de fluide dans les canaux fermés (canal microfluidique), DMF manipule gouttelettes sur des réseaux d'électrodes. L'un des mérites les plus attrayants de cette technique est l'absence de pièces mobiles pour le transport de fluides, et le mouvement est immédiatement arrêté en désactivant signaux électriques.
Cependant, le mouvement des gouttelettes dépend contenu de gouttelettes, certainement une caractéristique indésirable pour une plate-forme universelle "lab-on-a-chip». Gouttelettes contenant des protéines et d'autres analytes collent aux surfaces de l'appareil, devenir immobile. Sans doute, cela a été la principale limitation pour élargir le champ des applications DMF; 6-8alternatives pour minimiser l'encrassement de la surface indésirable impliquent l'ajout d'espèces chimiques supplémentaires à la goutte ou ses environs, ce qui pourrait avoir une incidence sur le contenu de gouttelettes.
Auparavant, notre groupe a développé un dispositif pour permettre le transport des cellules et des protéines dans le DMF, sans additifs supplémentaires (appareils de terrain-DW). 9 Ceci a été réalisé en combinant une surface basé sur la suie de bougie, 10 avec une géométrie du dispositif qui favorise gouttelettes de roulement et conduit à une force ascendante sur la gouttelette, ce qui réduit davantage l'interaction des gouttelettes de la surface. Dans cette approche, le mouvement des gouttelettes est pas associé à un mouillage de la surface 11.
Le but de la méthode détaillée décrit ci-dessous est de réaliser un dispositif de DMF capable de transporter des gouttelettes contenant des protéines, des cellules et des organismes entiers, sans additifs supplémentaires. Les appareils de terrain-DW ouvrent la voie à des plates-formes entièrement contrôlées de travail en grande partie indépendamment de gouttelettes chimistery.
Ici, nous avons également présentes simulations montrent que, malgré la haute tension nécessaire au fonctionnement du dispositif, la chute de tension aux bornes de la gouttelette est d'une petite fraction de la tension appliquée, ce qui indique des effets négligeables sur l'intérieur de la gouttelette bioanalytes. En fait, des essais préliminaires avec Caenorhabditis elegans (C. elegans), un nématode utilisé pour une variété d'études de la biologie, qui montrent vers nage normale que des tensions sont appliquées.
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Protocol
NOTE: Dans les procédures décrites ci-dessous, les consignes de sécurité de laboratoire doivent toujours être respectées. Il est particulièrement important de la sécurité lorsqu'ils traitent avec haute tension (> 500 V) et manipulation de produits chimiques.
1. revêtement d'un substrat conducteur avec la suie de bougie
- Cut cuivre métal en rectangles (75 x 43 mm, 0,5 mm d'épaisseur). Nettoyez chaque substrat de cuivre par immersion dans de gravure de cuivre pour environ 30 secondes, laver avec de l'eau du robinet pendant environ 20 secondes, et sécher sur papier.
NOTE: Si vous utilisez la méthode 1 ci-dessous, changer les dimensions de 75 x 25 mm à insérer dans la machine. - Balayer une bougie de paraffine allumé sous le substrat de cuivre pendant 30-45 secondes, pour obtenir un revêtement de suie à peu près uniforme (environ 40 um d'épaisseur). Gardez le substrat à ~ 1 cm à l'intérieur de la flamme. Ne touchez pas la surface de la suie fragile.
2. Protéger la couche de suie avec revêtement
NOTE: La couche de suie est très fragile, Et doit être recouvert d'une protection. Deux alternatives simples (méthodes 1 et 2 ci-dessous) sont proposées ici, mais les protocoles plus robustes sont actuellement en cours de développement.
- Méthode 1
- Charger l'échantillon dans l'évaporateur de métal ou d'un système de pulvérisation cathodique. En suivant les procédures de fonctionnement du système, évacuer la chambre, et commencer dépôt contrôlé de l'or sur la couche de suie (150-200 nm). Laissez l'appareil refroidir à la température ambiante.
- Dip-couche métallisée du substrat dans une solution de 1-dodécanethiol (1% v / v dans l'éthanol à 95%, ACS / qualité USP), pendant 10 minutes dans une hotte chimique. Ensuite, en tenant l'appareil à un angle proche de 60 °, laver délicatement la surface avec plusieurs gouttes d'éthanol seulement. Que les dispositifs sec, du jour au lendemain.
- Méthode 2
- Dans une hotte chimique, immédiatement après le revêtement du substrat avec de la suie et alors que le substrat est encore chaude de la flamme de la bougie, déposer des gouttelettes de liquide fluoré sur un côté de lasubstrat, et incliner le substrat à un angle proche de 90 °. Déposez plusieurs gouttelettes, et laissez-les rouler sur la surface de la suie entier.
NOTE: Lorsque la gouttelette tombe sur un point, la suie sera emporté de cette région. Que les gouttelettes de liquide fluoré propagation le plus possible. - Cuire le substrat sur une plaque chauffante (160 ° C pendant 15 min) à l'intérieur d'une hotte chimique.
- Laissez le substrat reposer toute la nuit à la température ambiante avant de l'utiliser. Stocker indéfiniment.
- Dans une hotte chimique, immédiatement après le revêtement du substrat avec de la suie et alors que le substrat est encore chaude de la flamme de la bougie, déposer des gouttelettes de liquide fluoré sur un côté de lasubstrat, et incliner le substrat à un angle proche de 90 °. Déposez plusieurs gouttelettes, et laissez-les rouler sur la surface de la suie entier.
3. Fabrication de électrodes supérieures (Adapté de Abdelgawad et al. 12)
- Dessiner les électrodes à l'aide de logiciels de conception graphique. Chaque électrode est de 2 mm de long, 0,3 mm de largeur, et l'écart entre les électrodes est de 0,3 mm. L'écart entre contacts (à enclencher dans le connecteur, voir ci-dessous) est de 2,3 mm (figure 1).
- Coupez un stratifié de cuivre souple (35 um d'épaisseur) dans le format Monarch (3,87 x 7,5 pouces). Utiliser d'autres tailles if compatible avec l'imprimante. Chargez le stratifié dans le bac d'alimentation manuelle d'une imprimante couleur.
- Assurez-vous d'utiliser "noir riche", ou "inscription noire", lors de l'impression sur la feuille de cuivre (voir Abdelgawad et al. 12 pour plus de détails) afin de permettre une couche plus dense de l'encre noire sur le substrat de cuivre, de protéger le motif imprimé lors de la gravure . Laissez le substrat sèche complètement imprimé, du jour au lendemain.
- A l'intérieur d'une hotte chimique, réchauffer (40 ° C) avec un bécher de 50 ml de solution d'attaque du cuivre. Trempez le stratifié imprimé dans le bécher, et secouez-la délicatement dans la solution pendant environ 10 min. Gravure temps dépend de la solution de gravure de cuivre. Toutes les quelques minutes, vérifier la corrosion et voir si le motif est intact.
- Laver soigneusement le stratifié avec de l'eau, et enlever le revêtement avec de l'acétone et de l'éthanol dans la hotte chimique. Laver une fois de plus, et doucement sécher le stratifié avec une serviette en papier.
- Fixez avec précaution le stratifié avec des électrodes à un gladiapositive ss (75 x 25 mm, ~ 1 mm d'épaisseur), en utilisant du ruban adhésif double face. Éviter les poches d'air.
- Fixer un film de perfluoroalkoxy PFA pour les électrodes à l'aide de ruban adhésif. Cela sert à éviter tout contact accidentel des électrodes avec la goutte, ce qui endommage les électrodes supérieures en raison de court-circuit.
4. L'interface électronique (circuit de la figure 2)
- Souder les relais et les condensateurs C à une carte de circuit universel.
- Assemblez le reste des 10 pilotes relais sur une planche à pain sans soudure pour circuits électroniques.
- Fil d'entrée de chaque conducteur de relais à un canal dans le panneau de contrôle.
- Casser délicatement les électrodes supérieures dans un connecteur (Figure 3). Fil de sortie de chaque commande de relais à une électrode supérieure, comme représenté sur la figure. Notez qu'il ya un contact du connecteur à la terre entre une paire de fils de relais, pour réduire le bruit électrique.
REMARQUE: Le connecteur se trouve sur une plate-forme réglable pour contrôler til distance (0,1-0,5 mm) entre le substrat (suie-plaqué) haut et en bas. - Utilisez un programme pour contrôler le calendrier pour haute tension (HT) application (environ 0,8 sec) pour 4 électrodes en même temps, en déplaçant une électrode dans la direction du mouvement (par exemple, pour 0.8 sec, actionner 1234, puis 2345, 3456, etc. ., 0,8 sec pour chaque groupe, puis vers l'arrière, se déplace de façon gouttelettes dans la direction opposée aussi bien).
5. Visualisation des gouttelettes et la manipulation
- Pour enregistrer le mouvement des gouttelettes, en utilisant le système de visualisation, qui est composé d'un 24X - Ensemble de grossissement 96X associé à une caméra CCD. Connectez le magnétoscope à la caméra en utilisant S-vidéo.
- Introduire à la pipette une goutte 4 pl contenant C. elegans dans un milieu sur le fond du substrat revêtu de la suie.
- Apportez les électrodes supérieures à ~ 0,3 mm au-dessus de la gouttelette. La goutte doit être proche de la moyenne, juste en dessous de la cinquième électrode, pour faciliter l'opération.
- Tournez sur l'interface électronique et haute tension (500 V RMS), et régler la distance d'électrode supérieure de la gouttelette jusqu'à ce qu'il commence à se déplacer. Ne laissez pas les électrodes supérieures touchent la gouttelette.
- Recueillir des données en enregistrant le nombre de transferts de gouttelettes de succès sur le dispositif en réponse à des impulsions électriques. Un essai réussi est caractérisé par au moins 700 transferts de gouttelettes, soit un transfert après chaque impulsion électrique.
- Recueillir des données en continu, jusqu'à ce que la goutte ne bouge pas en réponse à 5 à 10 impulsions.
NOTE: Lorsque la surface commence à se dégrader, le mouvement pourrait être rétablie en mettant les électrodes supérieures proche de la gouttelette.
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Representative Results
Auparavant, nous avons utilisé les appareils de terrain-DW pour permettre le mouvement des protéines dans le DMF. En particulier, les gouttelettes avec de l'albumine de sérum bovin (BSA) peuvent être déplacés à une concentration 2000 fois plus élevée que celle rapportée précédemment par d'autres auteurs (sans additifs). Cela était dû à l'interaction réduite entre gouttelettes et surface; La figure 4 montre une gouttelette contenant étiquetées par fluorescence BSA (voir Freire et al 9 pour plus d'informations sur les expériences.). La première image de gauche montre la goutte assise sur la surface de la suie enduit; celui du milieu, l'effet du champ électrique, qui, en plus de produire des gouttelettes de roulement, applique une force vers le haut sur la gouttelette, ce qui réduit en outre l'interaction avec la surface. Notez le contraste de cisaillement (à droite) à une solution couramment utilisée dans le DMF, ce qui est une surface revêtue avec un liquide fluoré seulement (sans bougie suie); la forte interaction avec la surface, indiquée par un contact inférieurngle, entrave souvent le mouvement.
Ici, nous utilisons le dispositif expérimental (figure 3) de continuer les essais avec ces appareils, le transport maintenant gouttelettes contenant des organismes plus grands, le ver C. elegans, un nématode utilisé dans une variété de dosages biologiques.
Gouttelettes avec des vers ont été actionnés avec succès sur des substrats de suie enduit. En particulier, le film 1 montre une gouttelette se déplaçant en réponse à chaque impulsion de tension (~ 0,8 s d'intervalle) (à noter que la fraction liquide, collé à un endroit sans suie, est en dehors de la voie de gouttelettes). Inspection après les expériences a révélé qu'aucun des vers, des débris ou résidus liquides, ont été laissés sur les voies gouttelettes après les expériences, indiquant réduit interaction entre gouttelettes et surface.
L'interface électronique (figure 2) permet une automatisation et un meilleur contrôle du mouvement, depuis l'actionnement simultané de groupes d'électrodes (Figure 1) Augmente la force vers le haut, ce qui réduit en outre l'interaction avec la surface.
Différentes expériences ont montré que les vers nagent tranquillement que les gouttelettes se déplace (20 min de temps d'actionnement total), ce qui indique que la haute tension (500 V ~ RMS) requis pour le fonctionnement de l'appareil ne sont pas nocifs pour les espèces biologiques transportés. Cette hypothèse est étayée par des simulations, qui ont montré que la chute de tension aux bornes de la gouttelette est une fraction insignifiante (10 -6%) de la tension nécessaire pour le fonctionnement (Figure 5, la différence de potentiel entre un point situé à la partie supérieure et inférieure de l'avion en le milieu de gouttelettes); en effet, en gouttelettes contenant les cellules T de Jurkat, des études antérieures effectuées par d'autres auteurs 13 suggèrent que ces chutes de tension minimal ne touchent pas la viabilité cellulaire, la prolifération, et de la biochimie. Pour de plus amples validation, cependant, nous sommes actuellement en train de concevoir des expériences pour évaluer les effets à long termede la tension de C. elegans. Pour les simulations décrites ici, une gouttelette ul ~ 2 était supposé être de PBS (phosphate buffer saline), assis sur une épaisse couche de suie 30 um. Électrodes supérieure et inférieure ont été modélisés comme le cuivre, et la tension appliquée égale à 500 V RMS (Pour plus de détails sur les simulations, voir Freire et al. 9).
Figure 1:. Photo de électrodes supérieures Chacun des 10 est de 2 mm de long et 0,3 mm de large. L'écart entre les deux électrodes est également de 0,3 mm, et l'écart entre les contacts (en bas) est de 2,3 mm.
Figure 2:. Schéma du système de contrôle pour électrodes supérieures, détaillant 1 des pilotes 10 relais Chaque électrode supérieure iest soit soumis à une tension, ou connecté à un condensateur. Sur la droite, une photo de la carte avec les relais. Notez que la haute tension nécessaire au fonctionnement est tenu à l'écart de la carte de commande (base blanche) sur la gauche. Schéma gouttelettes (Moyen) adapté avec la permission de Freire et al. 9 Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Vue de l'expérimental. La distance entre le substrat (suie-plaqué) haut et le bas est réglable. Les contacts de grandes électrodes sont cassés dans un connecteur. Les fils de relais (ici seulement 1, 2 et 3 des 10 fils) sont soudés au connecteur, comme indiqué sur le schéma à droite. Notez qu'il ya un contact du connecteur à la terre (par exemple, les contacts du connecteur 2 ou 4) entre une paire de fils de relais (par exemple, 1 ou 3), pour réduire le bruit électrique. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Gouttelettes (4 pi) avec BSA étiquetées par fluorescence (10 g / L) gauche, assis sur un substrat à base de suie; milieu, l'un des effets du champ électrique consiste à appliquer une force ascendante sur la gouttelette, ce qui réduit encore l'interaction avec le substrat; droit, goutte sur une surface revêtue seulement avec du liquide fluoré (pas de suie). Adapté avec la permission de Freire et al. 9
Film 1 . Droplet avec C. elegans sur un dispositif de terrain, DW, se déplaçant en réponse à chaque impulsion de tension (~ intervalle de 0,8 s). La fraction liquide représenté sur la partie inférieure gauche de la vidéo ne sont pas dans la voie de gouttelettes.
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Discussion
L'étape la plus critique de ce protocole est la protection de la couche de suie, directement associée à la réussite dans les gouttelettes en mouvement. Métallisation de la couche de suie (méthode 1 ci-dessus) permet à près de 100% de réussite de la fabrication. Toutefois, la durée de fonctionnement maximale est d'environ 10 min; éventuellement, les fractions sont gouttelettes mouillent la suie à travers des trous dans la couche de métal. Le revêtement de la couche de suie avec le liquide fluoré est l'alternative la plus simple et la plus rapide, et nécessite un minimum de ressources, mais seulement 40-50% de la (min maximum 20) fabriqué travail des substrats - et le revêtement est pas uniforme. En effet, la couche de suie est très fragile, et les liquides visqueux fluorés facilement endommage. Nous travaillons actuellement sur des solutions plus robustes pour protéger la couche de suie, ce qui augmenterait le temps de fonctionnement de l'appareil. Cependant, un aspect important est l'adsorption des matières de gouttelettes sur la surface. Auparavant, 9 nous avons quantifié la quantité de protéines que attfaisait mal à la surface pendant le fonctionnement du dispositif, et une corrélation a été trouvée entre le mouvement continu et réduit l'adsorption en surface de l'albumine de sérum bovin (BSA). Nonobstant, l'encrassement biologique est une question complexe, et certains auteurs suggèrent même qu'il pourrait être impossible de supprimer complètement l'effet; En théorie, si seulement une seule protéine se fixe sur une surface, d'autres seront attirés par ce site. En fait, le temps de fonctionnement maximal signalé pour des dispositifs microfluidiques numériques (par d'autres auteurs 6) est d'environ 40 minutes. Par conséquent, la robustesse de la surface est un point d'une grande importance et encore un travail en cours.
Notez que, dans électromouillage, l'application de la tension se propage souvent la goutte avec des analytes sur la surface, empêchant tout mouvement, à moins que des additifs sont utilisés. Cependant, certains additifs peuvent être toxiques, ou seulement pourraient fonctionner dans une plage de concentration de l'analyte dans la gouttelette. Appareils de terrain-DW permettent le transport d'analytes allant vientm protéines à des cellules individuelles et des organismes entiers, sans additifs supplémentaires. En outre, les caractéristiques de l'appareil sont en grande partie indépendante de l'épaisseur, l'uniformité, et les propriétés électriques de la couche de suie (voir Freire et al. 9 pour plus d'informations).
Par conséquent, l'importance de la méthode décrite ici est qu'il élargit le champ d'applications de DMF, ouvrant la voie pour le développement de plates-formes entièrement contrôlées de laboratoire sur une puce de travail largement indépendante de la chimie des gouttelettes.
Les dimensions de électrodes supérieures sont compatibles avec la résolution de l'imprimante, et ne sont pas uniques; électrodes étroites et plus étroits pourraient aussi travailler. En fait, d'autres procédés pour la fabrication de cartes de circuits imprimés en électronique peuvent être utilisés aussi bien. Ce qui importe est que la gouttelette est soumis à un champ électrique non uniforme, et il se déplace vers la zone où le champ est plus intense. Cependant, il faut prendre soindans la conception de garder le champ électrique entre les électrodes sous tension et flottants en dessous de 3 MV / m pour éviter les étincelles; ici, le champ est d'environ 1,7 MV / m, sans arêtes vives.
Le fonctionnement des circuits électroniques est le suivant. Chaque électrode supérieure, à travers un contact de relais, est reliée soit à la sortie d'un amplificateur haute tension ou à un condensateur (C), pour réduire au minimum le bruit électrique. Le transistor T permet le faible courant sous-traitée par la commission de contrôle, à travers la résistance R et le condensateur C 1, pour contrôler le courant plus nécessaire pour la bobine de relais pour fonctionner. La diode D empêche des dommages de circuit à cause du courant variable dans la bobine (voir la liste des matériaux pour la liste des composants). Un seul panneau de contrôle permet l'adressage individuel de toutes les électrodes, et une seule alimentation THT est nécessaire (Figure 2), qui tensions de sortie (8-18 kHz, 500 à 660 V RMS) après amplification de l'onde sinusoïdale fournie par un GENERteur. Notez que HV est maintenu aussi loin que possible du système de contrôle, afin de minimiser le bruit et le dysfonctionnement du circuit.
Les essais rapportés ici utilisés gouttelettes 4 pi, simplement en raison du fait que des gouttelettes plus petites contenant C. elegans sont plus difficiles à pipette. La culture de C. elegans ne sera pas discuté ici, et le lecteur devrait consulter pour les protocoles ailleurs (par exemple., Brenner 14).
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Acknowledgments
Nous remercions la Fondation Lindback pour un soutien financier, et le Dr Alexander Sidorenko et Elza Chu pour des discussions fructueuses et une assistance technique, et le professeur Robert Smith pour son aide avec le C dosages elegans.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin candle | Any paraffin candle | ||
| Sputtering system | Denton Vacuum, Moorestown, NJ | Sputter coater Desk V HP equipped with an Au target. | |
| 1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364 | |
| Teflon | Dupont | AF-1600 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma-Aldrich | F9755 | Fluorinated liquid: Prepare Teflon-AF resin in Fluorinert FC-40, 1:100 (w/w), to create the hydrophobic coating. |
| Graphic design software -Adobe Illustrator | Adobe Systems | Other softwares might be used as well. | |
| Copper laminate | Dupont | LF9110 | |
| Laser Printer | Xerox | Phaser 6360 or similar | Check for the compatibility with "rich black" or "registration black" (see text). |
| Copper Etchant | Transene | CE-100 | |
| Perfluoroalkoxy (PFA) film | McMaster-Carr | 84955K22 | |
| Breadboard | Allied Electronics | 70012450 or similar | Large enough to allow the assemble of 10 drivers. |
| Universal circuit board | Allied Electronics | 70219535 or similar | |
| Connector | Allied Electronics | 5145154-8 or similar | |
| Control board and control program (LabView software) | National Instruments | NI-6229 or similar | |
| High-voltage amplifier | Trek | PZD700 | |
| Capacitors C and C1, 100 nF, 60 V | Allied | 8817183 | |
| Transistor T, NPN | Allied | 9350289 | |
| Diode D, 1N4007 | Allied | 2660007 | |
| Relay | Allied | 8862527 | |
| Visualization system | Edmund Optics | VZM 200i or similar | System magnification 24X – 96X. It is combined with a Hitachi KP-D20B 1/2 in CCD Color Camera. |
| Recorder | Sony | GV-D1000 NTSC or similar | It is connected to the camera by an S-video cable. |
| Simulations | COMSOL Multiphysics | V. 4.4 |
References
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