Abstract
La majorité des maladies connues sont accompagnés par des troubles du système cardio-vasculaire. Les études sur la complexité des voies en interaction activées lors de pathologies cardio-vasculaires sont, cependant, limitée par le manque de méthodes robustes et physiologiquement pertinents. Afin de reproduire des événements vasculaires pathologiques nous avons mis au point un test in vitro pour étudier l'interaction entre l'endothélium et le sang total. Le dosage est constitué de cellules endothéliales humaines primaires, qui sont placés en contact avec le sang total humain. Le procédé utilise le sang natif avec peu ou pas d'anticoagulant, ce qui permet l'étude des interactions entre les composants délicats moléculaires et cellulaires présents dans un vaisseau sanguin.
Nous avons étudié la fonctionnalité de l'essai par comparaison de l'activation de la coagulation par des volumes de sang incubées avec ou sans les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC). Considérant qu'une quantité de sang plus contribué àune augmentation de la formation de la thrombine de l'antithrombine (TAT) complexes, la présence de cellules HUVEC entraîné réduit l'activation de la coagulation. En outre, on a appliqué l'analyse de l'image de l'attachement des leucocytes aux cellules HUVEC stimulées par le facteur de nécrose tumorale (TNFa) et a trouvé la présence de cellules CD16 + à être nettement plus élevé sur le TNFa a stimulé les cellules par rapport aux cellules non stimulées après contact avec le sang. En conclusion, le test peut être appliqué à l'étude de pathologies vasculaires, où les interactions entre l'endothélium et le compartiment de sang sont perturbées.
Introduction
Des procédés pour l'analyse des interactions de sang vasculaire à une maladie cardio-vasculaire comportent généralement des expériences de recherche animale. Résultats créés dans des modèles animaux de recherche expérimentales peuvent, cependant, avoir peu ou pas d'incidence sur les maladies humaines 1,2 En tant que tel., Il ya un besoin pour de bon et fiable dans des modèles in vitro pour étudier les interactions cellulaires entre le compartiment sanguin et les cellules endothéliales vasculaires un système de type humain. Nous avons donc mis en place un modèle de la chambre de cellules endothéliales dans le sang. Ceci est basé sur un modèle décrit précédemment utilisé pour étudier les interactions entre les biomatériaux et le sang total humain. 3 Contrairement à d'autres configurations in vitro où habituellement au nombre de composants purifiés, limitées à-dire, les thrombocytes, des leucocytes ou des cellules endothéliales sont disponibles, le modèle actuel intègre tous les composants présents dans un vaisseau sanguin.
La configuration de l'endothélium de sang cmodèle de chambre ell est conçu pour permettre l'utilisation du sang humain fraîchement prélevé avec peu ou pas d'anticoagulant ajouté. Sang conservé pendant des périodes de temps plus longues acquérir ce qu'on appelle des lésions de stockage où répartition des érythrocytes peut interférer avec les interactions délicates entre le sang et les cellules endothéliales. 4
Pour éviter la formation de caillots lors de la manipulation de sang entier ex vivo nécessite soit de fortes doses d'anticoagulant ou que tout le matériel en contact avec du sang doivent être non-activation. Comme les surfaces non-activation sont rares dans l'environnement du laboratoire, les matériaux peuvent également être équipées d'une couche de protection de l'héparine immobilisée. Une couche protectrice de l'héparine immobilisée (ci-après dénommée surface Corline d'héparine (CHS)) qui peut être appliquée à la plupart des matériaux qui créent une surface où un contact avec du sang peut se produire sans provoquer une activation de la cascade de la coagulation. 5 Par conséquent, en fournissant des chambres avec CHS, la CE endothéliale artériellell modèle de la chambre permet l'utilisation de très faibles concentrations de l'anticoagulant dans le sang. En évitant l'ajout de concentrations élevées d'anti-coagulant dans le modèle de la chambre de l'endothélium dans le sang, il est possible d'étudier les interactions sensibles au sein d'un vaisseau sanguin qui pourraient autrement être masqués. 6
Le modèle de la chambre de cellules endothéliales dans le sang est constitué de deux chambres formées en attachant des cylindres en plastique (hauteur: 8 mm, un rayon de 9 mm) sur une lame de microscope en plastique. Les bords tournés vers le haut sur les cylindres sont équipés de rainures qui sont équipés de joints toriques en caoutchouc utilisés pour assurer l'étanchéité des chambres à l'encontre du support de culture cellulaire. Les chambres sont seulement partiellement remplies de sang comme l'air dans la chambre maintient le sang en circulation, lorsque les chambres sont ensuite mis en rotation dans une position verticale (figure 1).
Afin d'évaluer la fonctionnalité du modèle, nous avons effectué des expériences avec soit un CHS recouvert complètementchambre ou ombilical veine cellules endothéliales (HUVEC). Deux volumes de sang ont été analysés séparément et la formation de la thrombine de l'antithrombine (TAT) complexes (un marqueur indirect de la coagulation) a été mesurée avec la méthode immuno-enzymatique (ELISA). Nous avons ensuite évalué l'effet de volumes de sang et le facteur de nécrose tumorale (TNFa) stimulé des cellules endotheliales sur le recrutement des leucocytes par analyse d'image.
Figure 1. Configuration du modèle de chambre de cellule endothéliale du sang. (A) Vue du dessus dessin schématique de la chambre de sang faite en PMMA. (B) des cellules endothéliales humaines primaires sont cultivées sur des lames de la chambre 1 puits. Le sang entier humain frais est ajouté à deux chambres sur une lame de microscope. Les chambres et tous les matériaux utilisés pour la manipulation du sang sont traités avec un revêtement de protection HS. Après avoir enlevé les parois de la CEll glissière culture, les cellules sont placées en regard du sang et le système de fermeture est serré. chambres d'éléments (C) Le endothéliale de sang sont ensuite incubées sous rotation à 37 ° C. Par la suite, les réactions dans le compartiment de sang peuvent être analysés par ELISA et les cellules endotheliales peuvent être analysées par microscopie.
Protocol
REMARQUE: Le sang est prélevé d'individus sains par ponction veineuse ouverte du système dans l'approbation de la Commission de révision éthique à Uppsala (permis no 2008/264).
1. Les cellules de semis
- Culture de cellules primaires humaines endotheliales de veine ombilicale (HUVEC) à 37 ° C dans 5% de CO2 dans des flacons T75 revêtues de gélatine à 1% dans du PBS pH 7,4.
- Retirer le milieu de culture à partir d'un flacon T75 contenant HUVEC (ou un autre type de cellules endothéliales humaines primaires) et laver les cellules avec 2,1 mM d'EDTA dans du PBS pH 7,4. Détacher les cellules par addition de 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA et incubation pendant 2 à 3 min à 37 ° C.
- Recueillir les cellules par rinçage de la fiole avec 9 ml de 10% de FBS dans du PBS pH 7,4 et transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml. Isoler les cellules à 735 g pendant 5 min.
- Eliminer le surnageant et remettre en suspension avec précaution du culot de cellules endothéliales dans un milieu de croissance de cellules microvasculaires (CE GMMV) et compter les cellules dans une chambre Bürker. Seed 21.000 cElls / cm 2 dans les diapositives de culture cellulaire 1-puits et incuber à 37 ° C. Le HUVEC sera confluentes après 1 - 2 jours de culture. Surveiller la morphologie cellulaire et la confluence de tous les jours sous un microscope optique.
2. Préparation de sang total
- Préparer toutes les surfaces artificielles qui seront en contact avec le sang d'une double couche de l'héparine immobilisée (CHS) selon les instructions du fabricant. Enrobés SHC protégées de la poussière peuvent être conservés à température ambiante jusqu'à 6 mois sans perte de fonction.
- Utilisez ouvert ponction veineuse du système pour prélever du sang d'un donneur sain peu (<30 minutes) avant de commencer l'expérience de la chambre de endothéliale artérielle. Couple une aiguille hypodermique (18 G x 50 mm) au SHC tubes de silicium revêtue (diamètre intérieur: 2 mm) avant de recueillir soigneusement sang dans un tube revêtu CHS de 50 ml. Supplément de sang avec de l'héparine non fractionnée pour atteindre une concentration finale de 0,75 UI / ml. Mélanger doucement le sang par inverter le tube 2 - 3 fois.
3. sang endothéliale Chambre modèle
- Fabriquer chambres de sang (Figure 1A; vue de dessus) en polyméthacrylate de méthyle acrylique (PMMA) constitué de deux cylindres (hauteur 8 mm et de rayon 9 mm) qui sont collés sur une lame de PMMA (25 x 75 mm). Monter les bords des cylindres vers le haut avec joints toriques en caoutchouc pour sceller la chambre de sang contre les lames de verre avec des cellules endothéliales en culture (figure 1B). Faire tourner les chambres de sang reliées à la lame de culture avec les cellules endothéliales par la suite dans une position verticale (Figure 1C).
- Utiliser un embout de pipette enduit CHS de transférer 1,5 ml de sang dans chaque CHS enrobés chambre en prenant soin de ne pas activer le sang.
- Transfer 1 ml de sang dans des tubes à centrifuger contenant 30 pi d'EDTA 0,34 MK 3 pour atteindre une concentration finale de 10 mM d'EDTA K 3 pour la détermination des concentrations en protéines de plasma initial à l'aideun dosage immunoenzymatique (ELISA). Mélanger soigneusement le sang et maintenir les tubes sur la glace.
- Retirer les parois en plastique des lames de verre de culture de cellules selon les instructions du fabricant et soigneusement laver les cellules dans du PBS pH 7,4. Veillez à retirer par la suite autant de liquide que possible de les diapositives. Ne laissez pas les cellules se dessèchent.
- Placer la lame au-dessus des chambres de sang, avec des cellules du sang faisant face. Fixer la lame en plaçant une pince autour de la chambre de cellules endothéliales dans le sang. Utiliser une lame en matière plastique pour un soutien supplémentaire pour éviter la rupture de la lame de verre de culture cellulaire lors de la passation de la pince.
- Fixer la chambre de cellules endothéliales de sang sur une roue en rotation (40 cm de diamètre) lieu dans un bain d'eau à 37 ° C. Tournez chaque chambre sur le volant à 0,5 g pendant 30 min.
- Après incubation, le démontage de la chambre de cellules endothéliales dans le sang. Laver les lames de culture de cellules dans du PBS pH 7,4 et fixer les cellules dans le froid de la glace 1% de paraformaldéhyde (PFA) fou 10 min. Transfer 1 ml de sang à partir de chaque chambre de microtubes à centrifuger contenant 30 pi d'EDTA 0,34 MK 3 pour atteindre une concentration finale de 10 mM d'EDTA K 3 et mélanger doucement les tubes. Gardez les tubes sur la glace.
- Centrifuger les tubes à 4560 g pendant 10 min à 4 ° C. Transférer le plasma sanguin de nouveaux microtubes et magasin à -70 ° C jusqu'à analyse plus approfondie.
4. Analyse de sang endothéliale Interactions
- Effectuer immunofluorescence avec la souris CD16 anti-humain suivie par chèvre secondaire anti-souris Alexa 488 et phalloidin-TexasRed. Effectuez chaque étape de coloration pendant 1 heure à température ambiante et laver les lames dans du PBS pH 7,4 entre chaque étape. Counterstain les noyaux au DAPI pendant 10 min à température ambiante. Analyser les composants sanguins liés aux cellules endotheliales par microscopie de fluorescence en combinaison avec l'analyse d'image en utilisant un logiciel approprié d'analyse d'images tel que CellProfiler.
- Quantify les réactions dans le compartiment de sang avec de la thrombine-antithrombine (TAT) ELISA selon les instructions des échantillons de plasma du fabricant.
- Utiliser des outils statistiques appropriés, par exemple., Un test t non apparié, à analyser les données.
Representative Results
La nécessité de CHS revêtement
Afin de mesurer les réactions dans le sang total spécifiques à ceux provoqués par les cellules endothéliales, tous les matériaux utilisés pour la chambre de cellules endothéliales de sang doivent être munis d'un enduit CHS avant de l'utiliser. Figure 2A (à gauche) montre une chambre non couché après 30 min de contact avec le sang d'un caillot clairement visible présente. Le traitement de la chambre avec le SHC (Figure 2A, droite) d'autre part protège le sang de l'activation incontrôlée, veiller à ce que les résultats sont dus à des interactions cellule-endothéliales sang.
L'effet du volume de sang dans la chambre
L'activation de la coagulation est plus probable dans le sang stagnant comme la probabilité d'interaction entre les facteurs de coagulation activés est augmenté. Dans le modèle de la chambre de cellules endothéliales dans le sang, le sang est maintenu en mouvement en raison de la circulation d'une bulle d'air à l'intérieur de la chambre. En oRDONNANCE pour déterminer l'effet de variations du volume de sang, et donc aussi la taille des bulles d'air, une chambre revêtue CHS est reliée à un coulisseau CHS en verre revêtu qui a été testé avec 1,5 ml ou 1,75 ml de sang total pendant 30 min. Le volume de sang sans aucun mouvement de la bulle d'air est 2,5 fois plus grande lorsque 1,75 ml de sang est ajouté à la chambre par rapport à quand 1,5 ml de sang est utilisé (figure 2B). Les TAT-valeurs mesurées ont suggéré augmenté TAT-formation avec augmentation du volume sanguin (figure 2D). Lorsque les cellules HUVEC (figure 2C) ont été incubées avec soit 1,5 ou 1,75 ml de sang total, aucune différence n'a été observée entre les deux groupes, ce qui suggère que les cellules endotheliales peuvent moduler l'activation de la coagulation (figure 2D).
L'effet du TNFa sur Globule recrutement et l'activation de la coagulation
Afin d'étudier l'effet du TNFa sur le recrutement des leucocytes, des cellules HUVEC était régaled avec 20 ng / ml de TNFa 4 heures avant le contact avec le sang. contact avec le sang - soit avec 1,5 ml ou 1,75 ml de sang - a été poursuivie pendant 30 minutes après que les diapositives de la culture ont été colorées pour CD16 (figure 2F), imagée et le nombre de cellules CD16 + a été quantifiée. Le recrutement de cellules CD16 + a augmenté de manière significative avec le traitement TNFa (figure 2E) 100-256 CD16 + cellules / mm 2 (p <0,0001) avec 1,5 ml de sang et 172 à 378 (P <0,0001) avec 1,75 ml de sang. La formation de complexes TAT a été mesurée dans les échantillons de plasma correspondantes du sang incubées avec des cellules non traitées ou non traitées TNFa (figure 2G). les cellules stimulées TNFa induit un doublement approximatif de complexes TAT, par rapport aux cellules non traitées.
Figueure 2: Fonctionnalité du modèle de chambre de cellule endothéliale du sang. (A) Les chambres avec ou sans CHS ont été incubées avec du sang total. Sans CHS, un caillot a été formé après 30 min. Mesure de la thrombine-antithrombine (TAT) complexes, un marqueur indirect de la coagulation, dans le sang incubées sans CHS était> 6000 pg / ml. (B) Le volume de sang pas maintenu en mouvement par la bulle d'air en rotation varie en fonction de différents volumes de sang. Avec l'ajout de 1,5 ml de sang, ce volume sera de 0,3 ml, alors il passera à 0,74 ml avec l'ajout de 1,75 ml. (C) HUVEC imagé avec contraste de phase microscopie spectacle typique morphologie des cellules endothéliales d'une monocouche confluente avant contact avec le sang. (D) des valeurs pour les chambres TAT complètement enrobées CHS montrent une légère différence en différents volumes de sang sont ajoutés. L'addition de 1,5 ml de sang a donné lieu à 35 ± 11 pg / ml (n = 7) par rapport à 1,75 ml, qui a abouti à 8577; 70 ug / ml de TAT (n = 8). Cette différence est plus présent lorsque les cellules HUVEC sont mises en incubation avec les mêmes volumes de sang; 66 ± 55 pg / ml pour 1,5 ml (n = 5) et 66 ± 29 pg / ml de 1,75 ml (n = 7). (E) La quantification du nombre de cellules CD16 + non stimulés soit présent sur le TNFa ou HUVEC stimulées après contact avec le sang. Le nombre de CD16 + est augmenté de façon significative avec le TNFa stimule les cellules incubées soit avec 1,5 ml (de base: 100 ± 40 cellules / mm; TNF: 256 ± 121 cellules / mm) ou 1,75 ml (de base: 172 ± 67 cellules / mm; TNF: 378 ± 185 cellules / mm) de sang total (F) des images représentatives de non stimulées et TNF HUVEC stimulées coloration des phalloidin (rouge), CD16 (vert) et DAPI (bleu).. Barre d'échelle = 250 um (G) La formation de complexes TAT est pratiquement doublé par TNFa a stimulé les cellules par rapport aux cellules non traitées incubées avec du sang (1,5 ml:. 2.1 ± 0,1 fois plus TAT, n = 3; 1,75 ml: 1,7 ± 1,0 fois plus de TAT, n = 4). Toutes les valeurs sont présentées comme moyenne ± écart-type; Les valeurs de p ont été calculés par des tests t non appariés. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Interactions multiples entre le sang et la paroi du récipient sont normalement maintenus dans un état de repos en raison de la nature non-adhésive et anti-thrombotique de l'endothélium. 7 Dans des conditions pathologiques impliquant une inflammation, l'endothélium est activé avec une augmentation résultante de l'expression des récepteurs d'adhérence 8 et une diminution de la capacité à inhiber l'hémostase. 9 Activation des systèmes en cascade dans le sang à son tour amplifie le thrombogène de l'endothélium provoquant de nouveaux recrutements de thrombose et de leucocytes. 10 Pour avoir une meilleure compréhension de cette délicate interactions entre les cellules endothéliales et du sang total, nous avons mis au point une nouvelle méthode in vitro, où les cellules endothéliales en culture sont mises en contact avec du sang entier. À notre connaissance, notre installation est la première à montrer les cellules endothéliales incubées avec du sang humain total avec très peu ou pas d'anticoagulant pour des périodes de temps plus longues.
nt "> La sensibilité de ce système est activée par ouverture de ponction veineuse du système, en combinaison avec une couche de protection de l'héparine immobilisée sur toutes les surfaces mises en contact avec du sang. L'utilisation d'un système ouvert lors du prélèvement sanguin réduit l'activation des systèmes en cascade pendant la ponction veineuse tout en permettant l'utilisation d'une quantité d'auto-déterminé de l'anticoagulant. disponibles dans le commerce tubes de sang évacués peuvent, toutefois, être utilisés en fonction des points d'extrémité visés par l'étude. La concentration finale de l'anticoagulant ajouté à tubes de système fermé plus disponibles dans le commerce peuvent inhiber sensible et par ailleurs difficile d'étudier les interactions dans la configuration. 6 Une surface de l'héparine de protection élimine en outre l'activation du sang à travers la surface de contact par des surfaces autres que les cellules endotheliales. 5 En effet, l'incubation du sang total additionné d'une petite quantité d'héparine non fractionnée en chambre sans la protection de la SCH a donné lieu à la formation de caillots.En outre, il y avait une augmentation de 2 fois dans le recrutement de cellules sanguines vers les cellules HUVEC TNFa activée en combinaison avec une formation de TAT doublé indépendamment du volume sanguin. Cela permet de vérifier la stabilité du système de modèle et montre aussi la possibilité d'utiliser un endothélium activé en association avec du sang total. Future sur, la chambre de cellules endothéliales dans le sang peut être utilisé pour étudier le recrutement de cellules sanguines vers les cellules endotheliales activées par une variété de marqueurs exprimés sur des cellules dans diverses conditions et les étapes d'activation. En outre, le modèle peut être utilisé en combinaison avec des agents pharmacologiques dans le but d'évaluer les effets sur les états inflammatoires.
En résumé, nous montrons le grand avantage de combiner un modèle de chambre avec les cellules sanguines et vasculaires humaines pour créer un être humain complet dans le système in vitro pour mener des enquêtes pertinentes de maladie vasculaire.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par des subventions du Conseil suédois de la recherche (90293501, A0290401, A0290402), septième programme-cadre de la Communauté européenne dans le cadre d'accord de subvention n ° 602699 (DIRECT), la Fondation Novo Nordisk, la Fondation Gurli et Edward Brunnberg, La thérapie génique, Vleugel Fondation et la Fondation Åke Wiberg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC) | PromoCell | C-12200 | Any other type of primary human endothelial cell may be used. |
| Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV) | PromoCell | C-22120 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G-2500 | Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells. |
| TAT ELISA | Enzyme Research Lab. | TAT-EIA-C | |
| Mouse anti-human CD16 | DAKO | F7011 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11001 | Dilution 1:500 |
| Phalloidin-Texas Red | Molecular Probes | A22287 | Dilution 1:200 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | Dilution 10 μg/ml |
| EDTA | Sigma | E-6758 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco Life Tecnologies | 25200-056 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437 | |
| 1 well cell culture slides | BD Falcon | 354101 | |
| Blood Chambers | NA | NA | Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS |
| Clamps | Office Depot | 2052204 | |
| Corline Heparin Surface (CHS) | Corline Systems AB | 945-00 | |
| Hypodermic needle | Terumo | NN-1850R | Size: 18 G x 5 mm |
| Unfractionated Heparin (UFH) | Leo Pharma | 585679 | |
| K3EDTA | Alfa Aesar | 1709958 | Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H2O |
| PFA | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | 80i | |
| Light microscope | Nikon | TS100 | |
| Image analysis software | Broad Institute | CellProfiler | Available for free at www.cellprofiler.org |
References
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