Abstract
सभी ज्ञात रोगों के बहुमत हृदय प्रणाली के विकारों के साथ कर रहे. हृदय विकृतियों के दौरान सक्रिय बातचीत रास्ते की जटिलता में अध्ययन, हालांकि, मजबूत और physiologically प्रासंगिक तरीकों के अभाव के कारण सीमित कर रहे हैं. रोग संवहनी घटनाओं मॉडल करने के क्रम में हम अन्तःचूचुक और पूरे रक्त के बीच बातचीत के अध्ययन के लिए इन विट्रो परख विकसित किया है. परख मानव पूरे रक्त के संपर्क में रखा जाता है जो प्राथमिक मानव endothelial कोशिकाओं के होते हैं. विधि एक रक्त वाहिका में वर्तमान आणविक और सेलुलर घटकों के बीच नाजुक संबंधों के अध्ययन को सक्षम करने, नहीं या बहुत कम थक्कारोधी साथ देशी खून का इस्तेमाल करता.
हम साथ या मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVEC) के बिना incubated अलग रक्त संस्करणों द्वारा जमावट की सक्रियता की तुलना द्वारा परख की कार्यक्षमता की जांच की. एक बड़ा रक्त की मात्रा में योगदान दिया जबकिथ्रोम्बिन antithrombin के गठन में वृद्धि (बुनना) परिसरों, HUVEC की उपस्थिति जमावट की कम सक्रियण में हुई. HUVEC ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (TNFα) के साथ प्रेरित और रक्त संपर्क के बाद unstimulated कोशिकाओं की तुलना में TNFα कोशिकाओं प्रेरित पर काफी अधिक होने की CD16 + कोशिकाओं की उपस्थिति पाया करने के लिए इसके अलावा, हम ल्युकोसैट लगाव की छवि विश्लेषण आवेदन किया. अंत में, परख अन्तःचूचुक और रक्त डिब्बे के बीच बातचीत परेशान कर रहे हैं जहां संवहनी विकृतियों, अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है.
Introduction
हृदय रोग में रक्त-संवहनी बातचीत का विश्लेषण करने के लिए तरीके आम तौर पर पशु अनुसंधान प्रयोगों शामिल है. प्रायोगिक अनुसंधान पशु मॉडल में बनाया परिणाम, तथापि,. मानव रोग के लिए बहुत कम या कोई निहितार्थ है जैसे 1,2 सकता है, रक्त कम्पार्टमेंट और संवहनी endothelial कोशिकाओं में बीच बातचीत सेलुलर जांच करने के लिए इन विट्रो मॉडल में अच्छा और विश्वसनीय के लिए एक की जरूरत है एक मानव की तरह प्रणाली. इसलिए हम एक रक्त endothelial सेल चैम्बर मॉडल की स्थापना की है. इस biomaterials और मानव पूरे रक्त के बीच बातचीत की जांच करने के लिए इस्तेमाल एक पहले से वर्णित मॉडल पर आधारित है. आमतौर पर शुद्ध घटकों, की संख्या सीमित है, जहां अन्य में इन विट्रो setups के लिए 3 विपरीत यानी, thrombocytes, ल्यूकोसाइट्स या endothelial कोशिकाओं उपलब्ध हैं, वर्तमान मॉडल सभी को शामिल किया गया घटकों एक रक्त वाहिका में प्रस्तुत करते हैं.
रक्त एन्दोथेलिअल सी का सेटअपपक्ष चैम्बर मॉडल कम या कोई जोड़ा थक्कारोधी साथ हौसले से तैयार की गई मानव रक्त का उपयोग सक्षम बनाया गया है. अब समय अवधि के दौरान संग्रहित रक्त तो एरिथ्रोसाइट्स के टूटने के रक्त और endothelial कोशिकाओं के बीच नाजुक संबंधों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं जहां भंडारण घावों बुलाया हासिल. 4
पूर्व vivo पूरे रक्त की हैंडलिंग के दौरान थक्का बनने से बचने के लिए थक्कारोधी की या रक्त के संपर्क में सभी सामग्री गैर सक्रिय होने की जरूरत है कि उच्च खुराक या तो की आवश्यकता है. गैर सक्रिय करने सतहों प्रयोगशाला वातावरण में दुर्लभ हैं, सामग्री वैकल्पिक रूप से अप्रयुक्त हेपरिन की एक सुरक्षात्मक परत के साथ सुसज्जित किया जा सकता है. अप्रयुक्त हेपरिन की एक सुरक्षात्मक परत खून संपर्क जमावट झरना की एक सक्रियण के कारण के बिना हो सकता है, जहां एक सतह बनाने के सबसे सामग्री के लिए लागू किया जा सकता है (इसके बाद Corline हेपरिन सतह (सीएचएस) के रूप में). 5 प्रकार, साथ कक्षों प्रस्तुत द्वारा सीएचएस, रक्त एन्दोथेलिअल सीईडालूँगा चैम्बर मॉडल रक्त में थक्का-रोधी के बहुत कम मात्रा का उपयोग सक्षम बनाता है. रक्त एन्दोथेलिअल चैम्बर मॉडल में थक्कारोधी की उच्च सांद्रता के अलावा बचना अन्यथा नकाबपोश जा सकता है कि एक रक्त वाहिका के भीतर संवेदनशील बातचीत का अध्ययन करने के लिए यह संभव बनाता है. 6
एक प्लास्टिक खुर्दबीन स्लाइड के लिए:;: (9 मिमी त्रिज्या 8 मिमी ऊंचाई) रक्त endothelial सेल चैम्बर मॉडल प्लास्टिक सिलेंडरों संलग्न द्वारा गठित दो कक्षों के होते हैं. सिलेंडरों पर ऊपर की ओर का सामना करना पड़ किनारों सेल संस्कृति स्लाइड के खिलाफ कक्षों सीलिंग के लिए इस्तेमाल किया रबर O- अंगूठी के साथ लगे हैं कि खांचे से लैस हैं. कक्षों केवल आंशिक रूप से कक्षों बाद में एक ऊर्ध्वाधर स्थिति (चित्रा 1) में घुमाया जाता है जब कक्ष में छोड़ा हवा आंदोलन में खून रहता है खून से भर रहे हैं.
मॉडल की कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए, हम या तो एक पूरी तरह से सीएचएस लेपित साथ प्रयोगों का प्रदर्शनचैम्बर या मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVEC). दो अलग-अलग रक्त संस्करणों assayed गया और थ्रोम्बिन antithrombin (बुनना) परिसरों (जमावट का एक अप्रत्यक्ष मार्कर) के गठन एंजाइम लिंक्ड immunosorbent परख (एलिसा) के साथ मापा गया था. हम तो रक्त की मात्रा और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (TNFα) छवि विश्लेषण द्वारा ल्युकोसैट भर्ती पर endothelial कोशिकाओं उत्तेजित के प्रभाव का आकलन किया.
रक्त endothelial सेल चैम्बर मॉडल 1. सेटअप चित्रा. (ए) के शीर्ष PMMA में किए गए रक्त चैम्बर के योजनाबद्ध ड्राइंग देखने. (बी) प्राथमिक मानव endothelial कोशिकाओं 1-अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड्स पर संवर्धित कर रहे हैं. ताजा मानव पूरे रक्त एक खुर्दबीन स्लाइड पर दो कक्षों में जोड़ा जाता है. खून से निपटने के लिए इस्तेमाल किया कक्षों और सभी सामग्री एक सुरक्षात्मक एच एस कोटिंग के साथ व्यवहार कर रहे हैं. सीई की दीवारों को हटाने के बादडालूँगा संस्कृति स्लाइड, कोशिकाओं रक्त का सामना करना पड़ रखा जाता है और सिस्टम बंद clamped है. (सी) रक्त endothelial सेल कक्षों तो 37 डिग्री सेल्सियस में रोटेशन के तहत incubated हैं. बाद में, रक्त डिब्बे में प्रतिक्रियाओं एलिसा द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है और endothelial कोशिकाओं माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है.
Protocol
नोट: रक्त उप्साला में नैतिक समीक्षा बोर्ड (परमिट नंबर 2008/264) के साथ अनुमोदन में खुली प्रणाली venipuncture से स्वस्थ व्यक्तियों से तैयार की गई थी.
1. सीडिंग प्रकोष्ठों
- T75 बोतल में 5% में 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 में संस्कृति प्राथमिक मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVEC) पीबीएस पीएच 7.4 में 1% जिलेटिन के साथ लेपित.
- एक T75 HUVEC युक्त कुप्पी (या प्राथमिक मानव endothelial कोशिकाओं के अन्य प्रकार) से संस्कृति के माध्यम से निकालें और पीबीएस पीएच 7.4 में 2.1 मिमी EDTA के साथ कोशिकाओं को धो लें. 37 डिग्री सेल्सियस में 3 मिनट - 1 मिलीलीटर 0.25% trypsin-EDTA जोड़ने और 2 के लिए incubating द्वारा कोशिकाओं को अलग करें.
- पीबीएस पीएच 7.4 में 9 मिलीलीटर 10% FBS के साथ कुप्पी rinsing द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब सेल निलंबन हस्तांतरण. 5 मिनट के लिए 735 XG पर कोशिकाओं नीचे स्पिन.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और endothelial सेल मध्यम विकास microvascular (ईसी GMMV) में ध्यान से सेल गोली resuspend और एक Bürker कक्ष में कोशिकाओं की गिनती. 21,000 ग बीजElls / 1-अच्छी तरह से सेल संस्कृति स्लाइड्स में 2 सेमी और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. संस्कृति के 2 दिन - HUVEC 1 के बाद मिला हुआ हो जाएगा. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत सेल आकारिकी और confluency दैनिक मॉनिटर.
पूरे रक्त की 2. तैयारी
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार अप्रयुक्त हेपरिन (सीएचएस) के एक डबल परत के साथ रक्त के साथ संपर्क में हो जाएगा कि सभी कृत्रिम सतहों तैयार करें. धूल से संरक्षित सीएचएस लेपित सामग्री समारोह की हानि के बिना 6 महीने तक कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है.
- रक्त एन्दोथेलिअल चैम्बर प्रयोग शुरू करने से पहले शीघ्र ही एक स्वस्थ दाता (<30 मिनट) से रक्त आकर्षित करने के लिए खुला प्रणाली venipuncture का प्रयोग करें. ध्यान से एक सीएचएस लेपित 50 मिलीलीटर ट्यूब में रक्त एकत्रित करने से पहले: (2 मिमी भीतरी व्यास) युगल एक चमड़े के नीचे सुई सीएचएस लेपित सिलिकॉन टयूबिंग के लिए (18 जी 50 मिमी x). Unfractionated हेपरिन के साथ पूरक रक्त 0.75 आइयू / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए. Inve के द्वारा धीरे रक्त मिक्स3 बार - ट्यूब 2 rting.
3. रक्त अंतर्कलीय चैंबर मॉडल
- एक PMMA स्लाइड (25 x 75 मिमी) से चिपके रहे कि दो सिलेंडर (ऊंचाई 8 मिमी और त्रिज्या 9 मिमी) से मिलकर एक्रिलिक polymethyl methacrylate (PMMA) में, रक्त कक्षों (ऊपर देखें चित्रा 1 ए) बनाना. सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) के साथ कांच स्लाइड के खिलाफ खून चैम्बर सील करने के लिए रबर O- अंगूठी के साथ ऊपर की ओर का सामना करना पड़ सिलेंडरों के किनारों फिट. उसके बाद एक खड़ी स्थिति (चित्रा 1C) में endothelial कोशिकाओं के साथ संस्कृति स्लाइड से जुड़े रक्त कक्षों घुमाएँ.
- रक्त को सक्रिय करने के लिए नहीं चैम्बर देखभाल लेपित प्रत्येक सीएचएस में 1.5 मिलीलीटर रक्त स्थानांतरित करने के लिए एक सीएचएस लेपित पिपेट टिप का उपयोग करें.
- एमके μl 0.34 3 EDTA के 30 युक्त microcentrifuge ट्यूबों में स्थानांतरण 1 मिलीलीटर रक्त का उपयोग प्रारंभिक प्लाज्मा प्रोटीन सांद्रता के निर्धारण के लिए 10 मिमी कश्मीर 3 EDTA के अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिएएक एंजाइम immunosorbent परख (एलिसा) से जुड़े. ध्यान से रक्त मिश्रण और बर्फ पर ट्यूब रखना.
- पीबीएस पीएच 7.4 में कोशिकाओं को धोने ध्यान से निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेल संस्कृति गिलास स्लाइड की प्लास्टिक की दीवारों निकालें और. बाद में स्लाइड से जितना संभव हो उतना तरल दूर करने के लिए सुनिश्चित करें. कोशिकाओं के बाहर सूखी मत देना.
- रक्त का सामना करना पड़ कोशिकाओं के साथ, रक्त कक्षों के शीर्ष पर स्लाइड रखें. रक्त endothelial सेल कक्ष के चारों ओर एक क्लैंप रखकर स्लाइड सुरक्षित. दबाना रखकर जब सेल संस्कृति गिलास स्लाइड का टूटना से बचने के लिए अतिरिक्त सहायता के लिए एक प्लास्टिक स्लाइड का प्रयोग करें.
- एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एक घूर्णन पहिया पर खून endothelial सेल कक्ष फिक्स (40 व्यास में सेमी) रखें. 30 मिनट के लिए 0.5 XG पर पहिया पर प्रत्येक कक्ष घुमाएँ.
- ऊष्मायन के बाद, रक्त endothelial सेल कक्ष विघटित. एफ पीबीएस पीएच 7.4 में सेल संस्कृति स्लाइड धो लें और (पीएफए) बर्फ के ठंडे 1% paraformaldehyde में कोशिकाओं को ठीकया 10 मिनट. Μl 0.34 एम 3 EDTA के 30 युक्त microcentrifuge ट्यूबों के लिए प्रत्येक कक्ष से स्थानांतरण 1 मिलीलीटर रक्त में 10 मिमी कश्मीर 3 EDTA के अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने और धीरे ट्यूब मिश्रण करने के लिए. बर्फ पर ट्यूबों रखें.
- 4 डिग्री सेल्सियस में 10 मिनट के लिए 4560 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र. आगे के विश्लेषण तक डिग्री सेल्सियस -70 में नया microcentrifuge ट्यूबों और स्टोर करने के लिए रक्त प्लाज्मा स्थानांतरण.
रक्त अंतर्कलीय सहभागिता की 4. विश्लेषण
- माध्यमिक बकरी विरोधी माउस एलेक्सा 488 और phalloidin-TexasRed द्वारा पीछा माउस मानव विरोधी CD16 के साथ immunofluorescent धुंधला प्रदर्शन करना. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्रत्येक धुंधला कदम प्रदर्शन करना और हर कदम के बीच पीबीएस पीएच 7.4 में स्लाइड्स धो लो. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए DAPI साथ नाभिक Counterstain. छवि विश्लेषण ऐसे CellProfiler के रूप में उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के साथ संयोजन में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा endothelial कोशिकाओं के लिए बाध्य रक्त घटकों का विश्लेषण करें.
- Quantiवित्तीय वर्ष प्लाज्मा नमूनों के निर्माता के निर्देशों के अनुसार थ्रोम्बिन-antithrombin (बुनना) एलिसा के साथ खून डिब्बे में प्रतिक्रियाओं.
- उचित सांख्यिकीय उपकरण, जैसे प्रयोग करें., एक unpaired टी परीक्षण, डेटा का विश्लेषण करने के लिए.
Representative Results
सीएचएस कोटिंग की आवश्यकता
Endothelial कोशिकाओं द्वारा हासिल उन लोगों के लिए विशिष्ट पूरे रक्त में प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए आदेश में, रक्त endothelial सेल चैम्बर के लिए प्रयुक्त सभी सामग्री का उपयोग करने से पहले एक सीएचएस कोटिंग के साथ सुसज्जित किया जाना चाहिए. चित्रा 2A (बाएं) के 30 मिनट के बाद एक uncoated कक्ष से पता चलता है एक स्पष्ट रूप से दिखाई थक्का वर्तमान के साथ खून संपर्क. दूसरी ओर सीएचएस साथ चैम्बर (2A चित्रा, दाएं) के उपचार के परिणाम endothelial सेल-रक्त संबंधों के कारण कर रहे हैं यह सुनिश्चित करना कि अनियंत्रित सक्रियण से खून की सुरक्षा करता है.
चैंबर में रक्त की मात्रा का प्रभाव
सक्रिय जमावट कारकों के बीच बातचीत की संभावना बढ़ जाती है के रूप में जमावट की सक्रियता स्थिर रक्त में अधिक होने की संभावना है. रक्त endothelial सेल चैम्बर मॉडल में, खून की वजह से कक्ष के अंदर एक हवाई बुलबुले के संचलन के लिए गति में रखा जाता है. ओ मेंrder इस प्रकार भी हवा बुलबुला आकार रक्त की मात्रा में परिवर्तन के प्रभाव का निर्धारण, और करने के लिए, एक सीएचएस लेपित चैम्बर 1.5 मिलीलीटर या 30 मिनट के लिए 1.75 मिलीलीटर पूरे रक्त के साथ परीक्षण किया गया था कि एक सीएचएस लेपित गिलास स्लाइड से जुड़ा था. रक्त का 1.75 मिलीलीटर रक्त के 1.5 मिलीलीटर (चित्रा 2 बी) का इस्तेमाल किया जाता है जब की तुलना में चैम्बर के लिए जोड़ा गया है जब हवा बुलबुला द्वारा किसी भी आंदोलन बिना रक्त की मात्रा 2.5 गुना बड़ा है. मापा जैसे-मूल्यों में वृद्धि हुई रक्त की मात्रा (चित्रा 2 डी) के साथ जैसे-गठन की वृद्धि हुई सुझाव दिया. HUVEC (चित्रा -2) पूरे रक्त के 1.5 या 1.75 या तो मिलीलीटर के साथ incubated रहे थे, कोई फर्क नहीं endothelial कोशिकाओं जमावट की सक्रियता (चित्रा 2 डी) मिलाना सकते हैं, सुझाव है कि दो समूहों के बीच नोट किया गया था.
ब्लड सेल भर्ती पर TNFα का प्रभाव और जमावट के सक्रियण
ल्युकोसैट भर्ती पर TNFα के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, HUVEC इलाज थे20 एनजी के साथ एड / एमएल TNFα 4 घंटा रक्त संपर्क करने से पहले. रक्त संपर्क - या तो 1.5 मिलीलीटर या 1.75 मिलीलीटर रक्त के साथ -, संस्कृति स्लाइड CD16 (चित्रा 2 एफ) के लिए दाग रहे थे, जिसके बाद 30 मिनट के लिए जारी रखा imaged और CD16 + कोशिकाओं की संख्या मात्रा निर्धारित किया गया था. CD16 + कोशिकाओं की भर्ती 1.5 मिलीलीटर रक्त के साथ 100 से 256 CD16 + कोशिकाओं / 2 मिमी (पी <0.0001) से TNFα उपचार (चित्रा 2 ई) के साथ काफी वृद्धि हुई है और 172 से 1.75 मिलीलीटर रक्त के साथ 378 (पी <0.0001) के लिए. जैसे परिसरों के गठन या तो TNFα इलाज या अनुपचारित कोशिकाओं (चित्रा 2 जी) के साथ incubated रक्त की इसी प्लाज्मा नमूनों में मापा गया था. अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में TNFα उत्तेजित कोशिकाओं जैसे परिसरों की एक अनुमानित दोहरीकरण प्रेरित किया.
अंजीरure 2: रक्त endothelial सेल चैम्बर मॉडल की कार्यक्षमता. सीएचएस के साथ या बिना (ए) मंडलों पूरे रक्त के साथ incubated रहे थे. सीएचएस के बिना, एक थक्का 30 मिनट के बाद बनाई गई थी. सीएचएस बिना incubated रक्त में थ्रोम्बिन-antithrombin (बुनना) परिसरों, जमावट का एक अप्रत्यक्ष मार्कर, का मापन> 6000 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल था. (बी) रक्त की मात्रा अलग रक्त संस्करणों के साथ अलग अलग होंगे घूर्णन हवा बुलबुला से आगे बढ़ नहीं रखा. यह 1.75 मिलीग्राम के अलावा के साथ 0.74 मिलीलीटर की वृद्धि होगी, जबकि रक्त की 1.5 मिलीलीटर के साथ इसके अलावा, यह मात्रा 0.3 मिलीलीटर हो जाएगा. एक मिला हुआ monolayer के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी शो ठेठ endothelial सेल आकारिकी से पहले साथ (सी) HUVEC imaged विभिन्न रक्त संस्करणों जुड़ जाते हैं जब रक्त संपर्क. (डी) पूरी तरह से सीएचएस लेपित कक्षों के लिए जैसे मूल्यों एक मामूली अंतर दिखा. 1.5 मिलीलीटर रक्त के अलावा 85 में हुई जो 1.75 मिलीलीटर, के लिए ± 11 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल (एन = 7) तुलना में 35 में हुई77; 70 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / बुनना (एन = 8). HUVEC ही रक्त संस्करणों के साथ incubated हैं जब यह अंतर अब मौजूद नहीं है; 1.5 मिलीग्राम के लिए 66 ± 55 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल (एन = 5) और 66 ± 29 1.75 मिलीलीटर (एन = 7) unstimulated या TNFα या तो पर CD16 + कोशिकाओं की संख्या की. (ई) मात्रा मौजूद होने के बाद HUVECs प्रेरित लिए माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर रक्त संपर्क. या 1.75 मिलीग्राम (बेसल:;: TNFα या तो 1.5 मिलीलीटर (256 ± 121 कोशिकाओं / मिमी TNFα 100 ± 40 कोशिकाओं / मिमी बेसल): साथ incubated कोशिकाओं उत्तेजित साथ CD16 + कोशिकाओं की संख्या में काफी वृद्धि हुई है 172 ± 67 कोशिकाओं / मिमी; TNFα: पूरे रक्त की 378 ± 185 कोशिकाओं / मिमी) (एफ) HUVEC phalloidin (लाल के लिए दाग उत्तेजित unstimulated और TNFα के प्रतिनिधि छवियाँ), CD16 (हरा) और DAPI (नीला).. स्केल बार = 250 माइक्रोन रक्त (1.5 मिलीलीटर के साथ incubated अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में जैसे परिसरों के गठन मोटे तौर पर TNFα से दोगुनी है (जी) कोशिकाओं को प्रेरित किया. 2.1 ± 0.1 गुना अधिक बुनना, एन = 3; 1.75 मिलीग्राम: 1.7 ± 1.0 गुना अधिक बुनना, एन = 4). सभी मूल्यों मतलब ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं; पी मूल्यों unpaired टी परीक्षण द्वारा गणना की गई है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Discussion
रक्त और पोत दीवार के बीच कई मुलाकातों सामान्य रूप से होने के कारण अन्तःचूचुक की गैर चिपकने वाला और विरोधी थ्रोम्बोटिक प्रकृति को एक मौन अवस्था में रखा जाता है. 7 सूजन से जुड़े रोग की स्थिति के दौरान, अन्तःचूचुक आसंजन रिसेप्टर अभिव्यक्ति 8 में एक परिणामस्वरूप वृद्धि के साथ सक्रिय हो जाता है और एक कम क्षमता को बाधित करने के लिए रक्तस्तम्भन. बदले में रक्त में झरना प्रणालियों के 9 सक्रियण आगे घनास्त्रता और ल्युकोसैट भर्ती के कारण अन्तःचूचुक की thrombogenicity amplifies. 10 endothelial कोशिकाओं और पूरे रक्त के बीच इस नाजुक बातचीत का एक बेहतर समझ हासिल करने के लिए, हम हैं सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं पूरे रक्त के संपर्क में रखा जाता है जहां इन विट्रो विधि में एक उपन्यास का विकास किया. हमारे ज्ञान करने के लिए, हमारे सेटअप अब समय अवधि के लिए कोई साथ पूरे मानव रक्त या बहुत कम थक्कारोधी साथ incubated endothelial कोशिकाओं को दिखाने के लिए पहली बार है.
NT "> इस प्रणाली की संवेदनशीलता रक्त के संपर्क में रखा सभी सतहों पर अप्रयुक्त हेपरिन की एक सुरक्षात्मक परत के साथ संयोजन में खुली प्रणाली venipuncture से सक्षम है. खून की खरीद के दौरान एक खुली प्रणाली का उपयोग venipuncture दौरान झरना सिस्टम की सक्रियता कम कर देता है थक्कारोधी के एक स्व-निर्धारित राशि के उपयोग की अनुमति है whilst. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध खाली रक्त नलियों, हालांकि, अध्ययन का इरादा अंत अंक के आधार पर किया जा सकता है. सबसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बंद व्यवस्था ट्यूबों में जोड़ा थक्कारोधी के अंतिम एकाग्रता संवेदनशील बाधित कर सकते हैं , और नहीं तो मुश्किल सेटअप में, बातचीत का अध्ययन करने के लिए. 6 एक सुरक्षात्मक हेपरिन सतह आगे endothelial कोशिकाओं के अलावा किसी अन्य सतहों से सतह संपर्क के माध्यम से रक्त की सक्रियता समाप्त. 5 दरअसल, unfractionated हेपरिन की एक छोटी राशि में साथ पूरक पूरे रक्त की ऊष्मायन सीएचएस के संरक्षण के बिना चैम्बर थक्का बनने में हुई.इसके अलावा, TNFα स्वतंत्र रूप से रक्त की मात्रा के जैसे की एक दोगुनी गठन के साथ संयोजन में HUVEC सक्रिय करने की दिशा में रक्त कोशिकाओं की भर्ती में एक 2 गुना वृद्धि हुई थी. इस मॉडल प्रणाली की स्थिरता की पुष्टि करता है और भी पूरे रक्त के साथ संयोजन में एक सक्रिय अन्तःचूचुक का उपयोग करने की संभावना को दर्शाता है. , रक्त endothelial सेल चैम्बर विभिन्न स्थितियों और सक्रियण के चरणों के तहत कोशिकाओं पर व्यक्त मार्करों की एक किस्म से सक्रिय endothelial कोशिकाओं की दिशा में रक्त कोशिका भर्ती की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर भविष्य. इसके अलावा, मॉडल भड़काऊ शर्तों पर प्रभाव का मूल्यांकन करने के क्रम में औषधीय एजेंटों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है.
संक्षेप में, हम रोग की प्रासंगिक जांच प्रदर्शन करने के लिए इन विट्रो प्रणाली में एक पूर्ण मानव को बनाने के लिए मानव रक्त और नाड़ी कोशिकाओं के साथ एक कक्ष मॉडल के संयोजन के महान लाभ दिखा.
Acknowledgments
इस अध्ययन एन 602699 (direkt) ° अनुदान समझौते के तहत स्वीडिश अनुसंधान परिषद (90293501, A0290401, A0290402), यूरोपीय समुदाय के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, NovoNordisk फाउंडेशन, Gurli और एडवर्ड Brunnberg फाउंडेशन, चिकित्सा, Vleugel स्टेम फाउंडेशन और ake Wiberg फाउंडेशन.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC) | PromoCell | C-12200 | Any other type of primary human endothelial cell may be used. |
| Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV) | PromoCell | C-22120 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G-2500 | Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells. |
| TAT ELISA | Enzyme Research Lab. | TAT-EIA-C | |
| Mouse anti-human CD16 | DAKO | F7011 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11001 | Dilution 1:500 |
| Phalloidin-Texas Red | Molecular Probes | A22287 | Dilution 1:200 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | Dilution 10 μg/ml |
| EDTA | Sigma | E-6758 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco Life Tecnologies | 25200-056 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437 | |
| 1 well cell culture slides | BD Falcon | 354101 | |
| Blood Chambers | NA | NA | Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS |
| Clamps | Office Depot | 2052204 | |
| Corline Heparin Surface (CHS) | Corline Systems AB | 945-00 | |
| Hypodermic needle | Terumo | NN-1850R | Size: 18 G x 5 mm |
| Unfractionated Heparin (UFH) | Leo Pharma | 585679 | |
| K3EDTA | Alfa Aesar | 1709958 | Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H2O |
| PFA | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | 80i | |
| Light microscope | Nikon | TS100 | |
| Image analysis software | Broad Institute | CellProfiler | Available for free at www.cellprofiler.org |
References
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology. J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).
- Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
- Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin. Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).
- Doctor, A., Spinella, P. Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In. Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).
- Andersson, J., et al. Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro. J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).
- Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).
- Aird, W. C. Spatial and temporal dynamics of the endothelium. J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).
- Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors. J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).
- Esmon, C. T. Molecular circuits in thrombosis and inflammation. Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).
- Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-Bed–Specific Hemostasis and Hypercoagulable States. N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
