Protocol
1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام، ومركبات السيتوكينات مهيلم
- إعداد وسائل الاعلام الخلية ES باستخدام تعديل Dulbecco لمن النسر المتوسطة (DMEM) مع ارتفاع نسبة الجلوكوز والصوديوم البيروفات. إضافة 20٪ ESC المؤهلين الجنين مصل بقري (FBS) و 1٪ البنسلين / الستبرتوميسين، 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ HEPES العازلة، الأحماض الأمينية 1٪ غير الضرورية، 0.1٪ جنتاميسين (50 ملغ / مل) و 0.1٪ ( 55 ميكرومتر) β-المركابتويثانول. تعقيم وسائل الاعلام الخلية ES عن طريق الترشيح.
- إعداد وسائل الاعلام OP9 بجعل 1 L ألفا الأساسية الدنيا متوسط (α-MEM) من مسحوق وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. إضافة 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين. عكس إلى المزيج. تعقيم عن طريق الترشيح إلى قسمين 500 مل مأخوذة.
ملاحظة: ينصح استخدام وسائل الإعلام مصنوعة من مسحوق، ومن المرجح أن تسفر عن تحسين صيانة الخلايا OP9 والتمايز في نتائج المختبر. وقد أصبح هذا النهج الإجراء لدينا معيار. ومع ذلك، نلاحظ أيضا ثار قمنا في بعض الأحيان يستخدم السائل مسبقة الصنع α-MEM مع النجاح الكافي. - إعداد تجميد وسائل الإعلام من خلال إضافة 10٪ سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) إلى 90٪ FBS. دوامة بلطف وتعقيم عن طريق الترشيح. تخزينها في 4 درجة مئوية.
- إعداد 2،000x العميد بحري 3 يجند (10 ميكروغرام / مل) عن طريق إذابة البشري المؤتلف العميد بحري 3 يجند (العميد بحري-3L) في كامل وسائل الإعلام OP9 إلى 10 ميكروغرام / مل. قسامة إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -80 درجة مئوية. اتبع توصيات المورد بشأن الاستقرار والتخزين.
ملاحظة: استقرار العميد بحري-3L قصيرة (1 شهر في 4 درجات مئوية أو 3 أشهر في -80 درجة مئوية). - إعداد 1،000x IL-7 (1 ميكروغرام / مل) باستخدام وسائل الإعلام OP9 الكامل. قسامة إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -80 درجة مئوية. اتبع توصيات المورد على الاستقرار والتخزين (IL-7 غير مستقر لمدة تصل إلى 12 شهرا في -80 درجة مئوية).
- إعداد 1،000x اللوكيميا التثبيطي عامل (LIF) (10 ميكروغرام / مل) من 1:10 تخفيف من 10 7 وحدات من LIF طن وسائل الإعلام خلية ES. متجر قسامة في 4 درجات مئوية. تأكد من ملاحظة تاريخ انتهاء الصلاحية المقدمة من قبل الشركة المصنعة على قارورة قسامة.
ملاحظة: المنتج هو مستقر في مركزة أو مخففة شكل لا يقل عن 18 شهرا من تاريخ الصنع. - إعداد مهيلم 6 لوحات جيدا قبل إضافة 1.5 مل من 0.1٪ محلول الجيلاتين في كل بئر من لوحة 6 جيدا. ترك الأطباق في غطاء العقيمة في درجة حرارة الغرفة مع أغطية على، مما يسمح لا يقل عن 30 دقيقة للطلاء. ويمكن أيضا أن تترك الأطباق في الحاضنة بين عشية وضحاها مرطب. إزالة أي حل الجيلاتين بقايا الحق قبل البذر الخلية. لا تدع حل الجيلاتين يجف تماما في البئر.
2. إعداد وصيانة الخلايا المغذية والفأر الخلايا الجذعية الجنينية (مسك)
ملاحظة: احتضان كل الخلايا في ترطيب الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
- ذوبان الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEF)
- سريعة الذوبان قارورة المجمدة (~ 5 × 10 6
- إضافة 8 مل من وسائل الاعلام الخلية ES لإذابة الخلايا، بطريقة الإفلات من الحكمة أن تضعف تدريجيا DMSO المتوسطة من التجمد.
- خلايا الطرد المركزي في 400 ز س في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إزالة بعناية وطاف resuspend الكرية خلية في 3 مل من وسائل الاعلام الخلية ES.
- إعداد أنبوب الطرد المركزي 50 مل مع 33 مل من قبل تحسنت وسائل الاعلام الخلايا ES. إضافة 3 مل من MEFs معلق لجلب الحجم النهائي إلى 36 مل.
- توزيع 3 مل من MEFs معلق في كل بئر من صفيحتين مهيلم 6 جيدا. وضع لوحات في الحاضنة لمدة ست ساعات على الأقل للسماح للخلايا لإرفاق وانتشرت قبل بذر mESCs عليها. قد تكون هذه الطبقات المغذية القبض ميتوتيكلي صالحة للاستعمال لعدة أيام بعد البذر الأولي، إن وسائل الإعلام الخاصة يتم تغيير كل 2-3 أيام.
ملاحظة: يمكن أيضا MEFs القبض طازجة استخدامها. </ OL>
- mESCs البذر
- سريعة الذوبان قارورة مع استنساخ مسك المجمدة في 37 ° C حمام المياه وإعداد الخلايا كما هو موضح في 2.1.1-2.1.3.
ملاحظة: نحن تجميد 2 قارورة من مسك من بئر متموجة من لوحة 6 جيدا. - إزالة وسائل الاعلام من جانب واحد (لكل مسك استنساخ) من لوحة 6 جيدا مع الطبقات الوحيدة MEF اعتقال (المعد في الخطوة 2.1.5) وبذر مل 3 من mESCs على رأس أحادي الطبقة MEF. إضافة 3 ميكرولتر من 1،000x LIF (10 نانوغرام / مل). العودة الأطباق في الحاضنة.
- سريعة الذوبان قارورة مع استنساخ مسك المجمدة في 37 ° C حمام المياه وإعداد الخلايا كما هو موضح في 2.1.1-2.1.3.
- ES صيانة الخلية والتربسين بوساطة مرور
ملاحظة: تغيير وسائل الإعلام يوميا، أو تقسيم على أساس التقاء مسك. على النحو الأمثل، والحصاد وانقسام / إعادة لوحة الخلايا كل يوم.- إزالة الخلايا ES سائل الإعلام ويغسل mESCs مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من 0.25٪ التربسين واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقيقة.
- جمع الخلايا trypsinized وتحويلها في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. بقوة الماصة تعليق خلية لتفتيت كتل من مالمجالس الاقتصادية والاجتماعية. إضافة 2 مل من وسائل الاعلام الخلية ES الكامل لتعليق خلية لتحييد التربسين.
- تدور في الخلايا ز × 400 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend بيليه في 3 مل ES سائل الاعلام الخلية.
- إزالة وسائل الاعلام من 6 لوحات جيدا تحتوي على إعداد الطبقات الوحيدة MEF المعتقلين. إضافة كمية مناسبة من تعليق خلية (استنادا إلى نسبة الانقسام المطلوب) في 3 مل من وسائل الاعلام الخلية ES إلى كل بئر إلى أن المصنف. إضافة 3 ميكرولتر من 1،000x LIF. ومتموجة مسك تقسيم جيدا 1: 6 وسوف يكون جاهزا للمرور في 2 يوما.
- OP9 / OP9-DL1 صيانة الخلايا
- ذوبان الجليد قارورة من الخلايا OP9 (اتبع الخطوات 2.1.1-2.1.3 باستخدام وسائل الإعلام OP9)
- إضافة 7 مل سائل الإعلام OP9 إلى 10 سم صحن زراعة الأنسجة. إضافة 3 مل من الخلايا معلق بطريقة الإفلات من الحكمة، وتوزيع الخلايا في جميع أنحاء اللوحة. وضع الخلايا بين عشية وضحاها في الحاضنة.
- تحقق التقاء الخلايا OP9 في اليوم التالي. إذا كان الطبق يحتوي على العديد من خلايا ميتة طافية، ريمولقد وسائل الإعلام وإضافة 10 مل من وسائل الإعلام OP9 الطازجة. إعادة الإناء إلى الحاضنة إذا لم يتم ملاحظة التقاء كامل تقريبا. سبليت (باستخدام التربسين) 1: 4 في القريب أحادي الطبقة متموجة OP9.
ملاحظة: يجب أن تصل إلى نفس المستوى لوحات التقاء مرة أخرى في حوالي 2 يوما. والحرص على عدم السماح لخلايا OP9 تصبح أكثر متموجة. - تجميد المقاطع الأولى من خلايا OP9 كما أسهم التوسع.
ملاحظة: نحن تجميد 2 قارورة من الخلايا OP9 متكدسة بالقرب من واحدة 10 سم الطبق. كل قارورة من الأسهم التوسع يمكن نشر مزيد من العمل لخلق الأسهم التي يتم استخدامها لاحقا في مسك التجارب ثقافة مشتركة. إبقاء جميع الأسهم OP9 مجمدة في النيتروجين السائل وليس في الفريزر -80 درجة مئوية، لأن التقلبات في درجات الحرارة يمكن أن تؤثر سلبا على جودة يتجمد.
3. OP9-DL1 الإجراءات المشارك الثقافة
- الاستعدادات ثقافة مشتركة
- ما يقرب من أسبوع واحد قبل الشروع في الثقافة المشتركة، ذوبان الجليد MEFs، mESCs وستو الخلايا OP9 العملCKS. بما أنه لا حاجة خلايا OP9-DL1 حتى اليوم ثقافة مشتركة 8، ذوبان الجليد الخلايا OP9-DL1 خلال الأيام الثلاثة الأولى بعد ثقافة مشتركة البدء. المحافظة أو تجميد جميع الخلايا حسب الحاجة.
- تحديد العدد الأولي من 10 سم لوحات مع الطبقات الوحيدة الخلية OP9 أعدت لتصل إلى 80٪ على التقاء شارك في ثقافة اليوم 0 بناء على حجم التجربة (على سبيل المثال، عدد من الحيوانات المستنسخة مسك أن تكون متباينة، وعدد من النقاط الزمنية ثقافة مشتركة ل يتم تحليلها). للتحضير لالثقافة المشتركة، وتقسيم بالقرب طبق متموجة من OP9 الخلايا بين 1: 4 و 1: 6 قبل يومين من متى تكون هناك حاجة إلى الطبقات الوحيدة.
ملاحظة: يحتاج المرء لوحة واحدة على الأقل في ESC استنساخ. عادة، المصنف على ESC استنساخ واحد على لوحة واحدة (كما هو موضح أدناه) يوم 0 ينبغي أن تسفر خلايا كافية لبذر ست لوحات في اليوم مرور 5. كل يوم سوف 5 لوحة تمكين نقطة زمنية لاحقة تحليل واحد. - انه ستكون هناك حاجة باستمرار الطبقات الوحيدة لOP9 شارك في ثقافة المرور، ورعاية لmainta دائمافي عدد كاف من لوحات إضافية الثقافة OP9 بالتوازي مع الثقافة المشتركة.
- 0 اليوم: بدء شارك في ثقافة
- جمع مسك كما في 2.3.1-2.3.4. عد الخلايا.
- لكل استنساخ مسك إعداد 5 × 10 4 مسك في 10 مل من وسائل الإعلام OP9 لكل لوحة.
ملاحظة: على الرغم من أننا لم تستخدم، نلاحظ أن وسيلة بديلة تتكون من α-MEM 10٪ FBS، و5 × 10 -5 M تم الإبلاغ أيضا عن β-المركابتويثانول لاستخدامها في التمايز المشترك الثقافات 10. - إزالة وسائل الإعلام القديمة من OP9 الأطباق وإضافة 10 مل من تعليق لمسك الأطباق مع الحرص على توزيع الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء اللوحة. ضع الأطباق في الحاضنة 37 ° C.
- يوم 3: تغيير وسائل الإعلام
- إزالة الأطباق من الحاضنة ومراقبة تحت المجهر. يجب المستعمرات تبدأ لانقاص اللمعان ويبدو بالارض.
- إزالة وسائل الاعلام من أطباق بلطف وإضافة 10 مل من OP9 جديدةوسائل الاعلام.
- العودة الأطباق المشارك الثقافة الحاضنة. مراقبة بصريا تشكيل مستعمرة مثل الأديم المتوسط يوميا إبلاغ توقيت OP9 إعداد أحادي الطبقة المغذية للمرور القادم (يوم 5)، والتي لا ينبغي أن تنفذ حتى ~ 80-90٪ من المستعمرات عرض بصريا مثل الأديم المتوسط التشكل. تأجيل الأقصى للخطوة نقل خلية يوم 5 هو 2 يوما.
- يوم 5: التربسين مرور بوساطة مع ما قبل الطلاء.
ملاحظة: إعداد مقدما عدد كاف من أطباق 10 سم مع الخلايا OP9 متكدسة على النحو الأمثل. المضي قدما في الخطوات المقبلة إلا إذا كانت الثقافات المشتركة بصريا عرض الميزات الموضحة في الخطوة 3.3.3 (انظر ممثل النتائج أيضا).- إزالة وسائل الاعلام من الأطباق ثقافة مشتركة. إضافة 4 مل PBS لغسل. دوامة PBS وإزالتها. إضافة 4 مل من 0.25٪ التربسين ووضع الأطباق في الحاضنة لمدة 5 دقائق ~.
- تعطيل طبقة من الخلايا trypsinized من قبل pipetting قوية، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء المفرطة، حتىويتحقق متجانسة، تعليق خلية في الغالب واحد.
- إضافة 4 مل من وسائل الإعلام OP9 كاملة ومزيج من قبل pipetting. نقل الخلايا إلى جديد وفارغ 10 سم طبق وضعها في الحاضنة لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا OP9 التمسك الطبق. هذا "ما قبل الطلاء" خطوة يقلل من عدد الخلايا OP9 نقل إلى الخطوة التالية من ثقافة مشتركة.
- تحضير 50 مل أنابيب الطرد المركزي مع مصافى الخلية 40 ميكرومتر.
- جمع الخلايا غير ملتصقة من طبق مطلي قبل وتمريرها من خلال مصفاة الخلية في أنبوب. غسل الطبق برفق مع 6 مل من برنامج تلفزيوني وتمريرها من خلال نفس مصفاة، وترك الخلايا OP9 المرفقة خلف.
- خلايا الطرد المركزي في 400 ز × 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend الخلايا مكعبات في 3 مل من وسائل الإعلام OP9 الكامل. عد الخلايا.
- إزالة وسائل الإعلام من 10 سم لوحات مع خلايا OP9 متكدسة على النحو الأمثل.
- عن كل نقطة زمنية التحليل، البذور 5 × 10 5 خلية أحادية على OP9طبقة في 10 مل الحجم النهائي.
- إضافة 5 نانوغرام / مل البشري المؤتلف العميد بحري-3L ووضع الأطباق في الحاضنة.
- يوم 8: لدم السلف الخلية (HPC) جمع
ملاحظة: إعداد مقدما عدد كاف من 6 لوحات جيدا مع الطبقات الوحيدة OP9 أو OP9-DL1 الخلية بحيث أنها ستكون ~ 80٪ متكدسة في الوقت المناسب لهذه الخطوة.- تحضير 50 مل أنابيب الطرد المركزي مع 40 ميكرون المصافي.
- إزالة الأطباق من الحاضنة ومراقبة تحت المجهر. عناقيد لامعة من HPCS يجب أن يرفق فضفاضة لأحادي الطبقة OP9. جمع أكبر عدد ممكن من هذه الخلايا ممكن عن طريق غسل (ولكن ليس بشكل مفرط تعطيل) أحادي الطبقة OP9 مع ماصة ووسائل الإعلام الموجودة على الطبق. لمنع الرغوة، وترك دائما لا يقل عن 1 مل من وسائل الإعلام في غيض من الماصة خلال هذه المجموعة HPC / خطوة الغسيل.
- تمر الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر في أنبوب. إضافة 8 مل PBS لنفس لوحة وتحقق تحت المجهر إذا كان كل HPCS نحنإعادة جمعها. كرر الخطوة الغسيل / جمع مع برنامج تلفزيوني و(إذا لزم الأمر) مع الغسيل أكثر قوة. سلالة الخلايا في الأنبوب الذي يحتوي بالفعل على خلايا من نفس اللوحة.
- خلايا الطرد المركزي في ز × 400 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إعداد مزيج الرئيسي من 3 مل (لكل لوحة المصنفة في يوم 5) وسائل الإعلام OP9 مع 5 نانوغرام / مل العميد بحري-3L و 1 نانوغرام / مل IL-7.
- إزالة وطاف بيليه resuspend في وسائل الإعلام OP9 مع العميد بحري-3L + IL-7 مزيج الرئيسي (3 مل لكل 10 سم طبق معالجتها). نقل الخلايا التي جمعت من كل لوحة في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا مع الخلايا OP9.
- من أجل دفع الخلايا نحو حيدي، خلية B أو الأنساب محمر، خلايا البذور التي تم جمعها على خلايا OP9. لاستخلاص خلايا T، خلايا البذور على الطبقات الوحيدة الخلية OP9-DL1.
- وضع 6 لوحات جيدا في الحاضنة.
- يوم 10: تغيير وسائل الإعلام
- إعداد أنبوب الطرد المركزي 15 مل لكل متميز مسك استنساخ نوع من الخلايا المغذية-combinaنشوئها في ثقافة مشتركة.
- إعداد مزيج الرئيسي من وسائل الاعلام OP9 مع 5 نانوغرام / مل من العميد بحري-3L و 1 نانوغرام / مل من IL-7. إعداد 3 مل لكل بئر.
- جمع بلطف وسائل الإعلام من كل بئر من لوحة 6 جيدا يجمع بين وسائل الإعلام من آبار متعددة تحتوي على نفس ESC-استنساخ نوع من الخلايا المغذية الجمع.
- إضافة 2 مل من مزيج الرئيسي وسائل الإعلام OP9 (انظر 3.6.2) في كل بئر.
- الطرد المركزي وسائل الإعلام التي تم جمعها في 400 ز س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend كل بيليه (صغير جدا إذا مرئية) في 1 مل من مزيج الرئيسي OP9 سائل الإعلام (انظر 3.6.2) لكل بئر جمعها أصلا في الخطوة 3.6.3.
- توزيع 1 مل من الخلايا مرة أخرى في كل بئر من التي تم جمعها وسائل الإعلام أصلا ليصل حجم في كل بئر إلى 3 مل. العودة الأطباق إلى الحاضنة.
- اليوم 12: لا التربسين مرور
ملاحظة: إعداد مقدما عدد كاف من الأطباق 6 جيدا مع الخلايا OP9 أو OP9-DL1 بحيث سيتم متموجة على النحو الأمثل في الوقت المناسب لهذا لياليتيب. يوم 12 هو المثل الأعلى للالتدفق الخلوي تحليلات محمر النامية، وحيدي، وخلايا T مرحلة مبكرة.- إعداد مزيج الرئيسي (3 مل لكل بئر التي ستستمر في التعاون ثقافة) وسائل الإعلام OP9 مع 5 نانوغرام / مل من العميد بحري-3L و 1 نانوغرام / مل من IL-7.
- تحضير 50 مل أنابيب الطرد المركزي مع 40 ميكرومتر مصافى (واحد لكل ESC استنساخ-المغذية نوع من الخلايا في الجمع المشارك الثقافة).
- بقوة ماصة وسائل الإعلام الموجودة في كل بئر إلى تفصيل جميع الخلايا (بما في ذلك أحادي الطبقة) في البئر. تواصل مع pipetting لقوي حتى يتحقق حالة تشبه تعليق خلية واحدة.
- تمر الخلايا التي تم جمعها من خلال مصفاة في أنبوب. أضف 3 مل من برنامج تلفزيوني في كل بئر لغسل وجمع كل الخلايا المتبقية. تمر الخلايا من خلال نفس مصفاة. الجمع بين الخلايا من آبار متعددة تحتوي على نفس ESC-استنساخ نوع من الخلايا المغذية الجمع.
- تجاهل مصفاة الخلية المستخدمة وإزالة ما يعادل قسامة إلى بئر واحدة (~ 6 مل) لأي المطلوبالتدفق الخلوي (أو غيرها) التحاليل التي يتعين الاضطلاع بها في ذلك اليوم. تخزين هذه مأخوذة على الجليد قبل الاستخدام.
- خلايا الطرد المركزي في ز × 400 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف. resuspend الكرية من 50 مل أنابيب الطرد المركزي في 3 مل من مزيج الرئيسي لكل بئر لإعادة المصنف. إضافة 3 مل لكل بئر من كل تعليق الخلية إلى نوع من الخلايا المغذية المناسبة ووضع الأطباق في الحاضنة.
- يوم 14: تغيير وسائل الإعلام
- اتبع الخطوات المذكورة في القسم 3.6.
- اليوم 16: لا التربسين مرور
ملاحظة: إعداد مقدما أطباق 6 جيدا الخلايا OP9 أو OP9-DL1 متكدسة على النحو الأمثل لهذه الخطوة.
ملاحظة: يوم 16 هو المثالي لتدفق تحليل الخلوي من الخلايا الليمفاوية B وخلايا T المرحلة المتوسطة.- اتبع الخطوات المذكورة في القسم 3.7.
- يوم 18: تغيير وسائل الإعلام
- اتبع الخطوات المذكورة في القسم 3.6.
- اليوم 20: لا التربسين مرور
ملاحظة: يوم 20 طق مثالية لتحليل التدفق الخلوي من منتصف إلى أواخر مرحلة تطوير خلايا T.- اتبع الخطوات المذكورة في القسم 3.7. إذا رغبت في ذلك، وتحمل تمييز الخلايا الماضي يوم 20 التغيير سائل الإعلام بالتناوب ولا التربسين الممرات كل يومين، مع الرصد اليومي لمعدل التوسع اللمفاويات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عندما نمت على MEFs بحضور LIF، mESCs يمكن الحفاظ في حالة غير متمايزة. في ظل ظروف مثالية، فإنها تبدو وكأنها مستعمرات المدمجة للخلايا تحيط بها هالة لامعة في المرحلة النقيض المجهر (الشكل 1). يجب مراقبة هذه الثقافات يوميا. اعتمادا على التقاء الخلايا، وسائل الإعلام يمكن تغيير أو الخلايا يمكن تقسيم. يجب أن المستعمرات المجاورة مسك لم يأت الى نقطة الاتصال مع بعضها البعض. والعادية، والثقافة الصحية لmESCs غير متمايزة هي نقطة انطلاق أساسية لفي المختبر الخلايا التائية التمايز. على الشروع في ثقافة مشتركة، فمن المستحسن أن الخلايا تكون متكدسة تماما دون أن مكتظة. هذا هو الحال في معظم خلايا تحصد لبذر خلايا OP9 على الطبقات الوحيدة هي مسك (بدلا من الخلايا المغذية). إذا لوحظت اختلافات كبيرة في التقاء بين مختلف الحيوانات المستنسخة مسك لتكون متباينة في اليوم 0، ثم أنه سيكون من الأفضل لإزالة MEFs من قبل الالتزام تيسأطباق ثقافة سو (كما في الخطوة 3.4.3-3.4.6 باستخدام وسائل الإعلام خلية كاملة ES) قبل احتساب mESCs للثقافة مشتركة البذر.
خلايا OP9 يجب الحفاظ جيدا قبل الشروع ثقافة مشتركة (كما هو موضح في القسم 2.4). بالإضافة إلى ذلك، يعتقد أن OP9 الخلايا تفقد بعض خصائصها مع ثقافة طويلة و / أو الزيادات وضوحا في معدل انتشارها 7 تجنب تقسيم نسب تتجاوز 1: 5 أثناء صيانة OP9 الخلايا، ونبذ الثقافات OP9 مستمرة بعد ستة أسابيع، سوف يساعد على تجنب هذه المزالق.
في الخطوات الأولية البذر الخلية ونقل خلية من الثقافة المشتركة (اليوم 0، 5، 8، 12، 16)، وينبغي أن تكون الطبقات الوحيدة OP9 ضمن نطاق الأمثل للالتقاء. الشكل 2 يوضح المنخفض (الشكل 2A) وعالية (الشكل 2B) ينتهي من مجموعة من الخلايا OP9 التقاء المستحسن لاستخدامها في الطبقات الوحيدة ثقافة مشتركة. ويرد مثال لوحة الإفراط في متموجة في الشكللدى عودتهم 2C. قد فشل في الحفاظ على التقاء الأمثل لحث على تشكيل الخلايا الشحمية (الشكل 2D) أنه في كميات كبيرة، يمكن أن تؤثر سلبا على الثقافة المشتركة.
في اليوم 0، يتم تشغيل الثقافة المشتركة على OP9 الخلايا بدلا من OP9-DL1 خلايا منذ يفضل تشكيل الأديم المتوسط على OP9 الخلايا. ومطلي الخلايا على OP9-DL1 خلايا الطبقات الوحيدة التي تبدأ في يوم 8 للحث على إنتاج خلايا T. في حين أن بعض الحيوانات المستنسخة مسك سيتم عرض مرئي (~ 90٪) تشكيل قوي والكمي للمستعمرات مثل الأديم المتوسط بعد يوم 5 من الثقافة المشتركة (الشكل 3A-B)، يمكن للآخرين عرض التأخير في هذه الخطوة (الشكل 3C-F). تحت المجهر، المستعمرات مثل الأديم المتوسط المستمدة في هذا الاختبار وقد وصفت بنسب مختلفة كما تشبه عجلات عربة أو الحفر (الشكل 4A) أو النجمية أو زهيرات (الشكل 4B).
بينما بروتوكول OP9-DL1 نشرت يعكس المعيار الكمي من الأديم المتوسط الشكلنشوئها بعد يوم 5 من الثقافة المشتركة، 7 نجد أنه ليست كل الحيوانات المستنسخة ESC تحقيق هذا المعيار ضمن هذا الإطار الزمني. في هذه الحالات، ونحن تغيير المتوسطة في يوم 5 و الانتظار لمدة 1-2 أيام إضافية قبل إجراء "يوم 5" الحصاد خلية / بروتوكول نقل. الهدف من هذا التأخير هو السماح ~ 80-90٪ من مستعمرات الخلايا ES إلى أرومية متوسطة تصبح بصريا قبل نقلها. من المهم أن نوضح أن هذا الرقم 80-90٪ يعكس إدراكها المعيار المرئي بدقة مرحلة النقيض التفتيش المجهري بسيطة من مستعمرة التشكل في أطباق ثقافة مشتركة. فإنه يشير فقط إلى نسبة المستعمرات ESC التي تشبه تلك التي تظهر في الشكل 4. ومن الممكن أن بعض الحيوانات المستنسخة ESC لن تصل هذا المعيار البصري، حتى بعد تأخير لمدة يومين. في مثل هذه الحالة، فمن الممكن لإثراء الدم لتشكيل السلائف أرومية متوسطة باستخدام التدفق الخلوي لخلية فرز FLK-1 + خلايا، كما تم وصفه سابقا. 6،11 في أي حال، لساكه من الراحة التسميات، نحن "إعادة عقارب الساعة" والرجوع إلى يوم مثل الأديم المتوسط كما نقل مستعمرة "اليوم 5."
عندما يتم متباينة متعددة استنساخ ESC في موازاة ذلك، فمن الممكن أن بعض الثقافات المشتركة ستكون جاهزة لهذا اليوم مرور 5 في الوقت المناسب، في حين أن آخرين متخلفة. في هذه الحالة، فإنه من المستحسن تأجيل مرور كل الثقافات المشتركة حتى الحيوانات المستنسخة أبطأ اللحاق بالآخرين. التأخير لا يبدو أن تفعل أي ضرر لل"في الوقت المحدد" المشترك الثقافات، ولكن يفيد التمايز لاحق من الحيوانات المستنسخة أبطأ كثيرا.
اليوم 8 (أي بعد ثلاثة أيام من نقل مستعمرة أرومية متوسطة) ترى ظهور وتراكم HPCS. HPCS مرئية لامعة في شكل مجموعات من الخلايا التي انضمت فضفاضة إلى خلايا OP9 المغذية (الشكل 5). إجراء الغسيل الدقيق، باستخدام ماصة وسائل الإعلام على طبق، وفصل وجمع HPCS مع تركأحادي الطبقة OP9 معظمها سليمة (الشكل 6A-C). ولعل هذا هو معظم خطوة تقنية حساسة للبروتوكول. الأمر يحتاج إلى بعض الممارسات للعثور على الاقتراحات المناسبة وضغط طرد وسائل الاعلام لتحقيق التوازن المنشود الحصاد القصوى من HPCS مع أقل قدر من الاضطراب طبقة المغذية. كان مقبولا إذا كان بعض من أحادي الطبقة OP9 ترفع قبالة، حيث سيتم القبض على الأغلبية في أي أحادي الطبقة الضالة في 40 ميكرومتر شبكة النايلون يظهر بعد التصفية. الشكل 6D أحادي الطبقة بعد pipetting لالمفرط يؤدي الى مزيد من الاضطراب أحادي الطبقة من اللازم. خلال هذه الخطوة غسل، فمن المهم للتحقق تحت المجهر أم لا كل HPCS تم جمعها، وضبط الضغط الغسيل وفقا لذلك.
تقدم الثقافة المشتركة يمكن رصدها بواسطة التدفق الخلوي. لتحليل تحديدا ذرية المكونة للدم غير محمر من ESC، من المهم أن البوابة الأولى على CD45 + الخلايا الحية.هذه الشاشات خطوة على خلايا OP9 من التحليلات، في حين استخدام دابي أو غيرها من صبغ تلطيخ النووي يمكن استبعاد خلايا nonviable. بعد يوم 12، يجب أن العديد من مجموعات، وخلايا صغيرة مستديرة لامعة تكون مرئية. ليس من الضروري أن عدد الخلايا في هذه المرحلة. ولكن لاحظنا أن يعيش، التهم الحدث بوابات التدفق الخلوي وعادة ما تكون في حدود 1-3 × 10 5 في يوم 12 شارك في الثقافة أيضا. تحليل التدفق الخلوي للخلايا الحية بوابات متباينة على أحادي الطبقة OP9 سوف تسفر محمر (NEG CD45، TER119 +) وحيدي (CD45 +، CD11b مرحبا) الأنساب (الشكل 7A). تحليلات، CD45 + الخلايا الحية مع التمييز على OP9-DL1 الطبقات الوحيدة يجب أن تكشف عن العلامات المميزة لCD4 / CD8 النفي المزدوج (DN) -1 (CD44 +، CD25 NEG، NEG CD4، CD8 NEG) وDN2 (CD44 +، CD25 +، NEG CD4، CD8 NEG) خلايا T المرحلة (الشكل 7B نانوغرام>). بعد يوم 16، هناك زيادة كبيرة في كمية، جولة، خلايا صغيرة لامعة في الثقافات. على OP9-DL1s، T المنتجات تمايز الخلايا التقدم إلى (NEG CD44، CD25 +، CD4 NEG، CD8 NEG) DN3 وDN4 (CD44 NEG، CD25 NEG، NEG CD4، CD8 NEG) مراحل. بعض موانئ دبي (CD4 +، CD8 +) خلايا T يمكن أيضا أن تبدأ الناشئة بعد يوم 16 (الشكل 7B). المصنف HPCS على OP9 الخلايا تسفر خلايا B (CD19 +) بعد يوم 16. بعد يوم 20 من OP9-DL1-مسك ثقافة مشتركة، سوف تكون هناك كميات كبيرة من الخلايا T موانئ دبي وايجابية واحد (SP) خلايا CD8 + T الحالية ( الرقم 7B). يقدم الشكل 8 رسم تخطيطي يلخص الخطوات الأساسية للإجراءات المذكورة أعلاه، واقترح تحليل نقاط زمنية خلال ثقافة مشتركة.
ghres.jpg "/>
الرقم 1. المرحلة المجهر النقيض من الصورة mESCs غير متمايز (المستعمرات فوز حادة) المتنامي على رأس أحادي الطبقة MEF (100X التكبير).
الشكل 2: المرحلة المجهر النقيض من الصور من OP9 confluency أحادي الطبقة (A) أقل و (B) أعلى مستويات confluency ينصح للثقافة مشتركة مرور / البذر (40X التكبير) (C) مثال على الإفراط في متموجة OP9 أحادي الطبقة (40X التكبير. ). (D) الإفراط في متموجة OP9 أحادي الطبقة (200X التكبير) مع تشكيل خلية شحمية (كبيرة، الحويصلة التي تحتوي على الخلايا).
الشكل 3: المرحلة النقيض microscop صور Y من تشكيل مستعمرة تشبه في الأديم المتوسط "يوم 5" المشترك الثقافة. (A) مشاهدة 40X و (B) 100X لوحات ثقافة مشتركة مع> 90٪ أرومية متوسطة مستعمرة التمايز. هذه لوحات جاهزة للمرور يوم 5. (CF) أمثلة على لوحات يوم 5 المشارك الثقافة التي تتطلب 1-2 يوم قبل تأجيل نقل (C & E، 40X التكبير، D & F، 100X التكبير).
الشكل 4: المرحلة المجهر النقيض من الصور من مجموعة متنوعة من التشكيلات مستعمرة تشبه في الأديم المتوسط يوم 5 من الثقافة المشتركة (A) مورفولوجيا مستعمرة يشار إليها باسم "الحفر" أو (B) مورفولوجيا مستعمرة المشار إليها. "عجلة عربة". كما "النجمي" أو "الزهيرات" (200X التكبير).
الصفحة = "دائما"> 
الشكل 5. المرحلة المجهر النقيض من الصورة من يوم 8 لوحة شارك في الثقافة مع مجموعات من، الجولة، HPCS لامعة صغيرة على أحادي الطبقة OP9 (40X التكبير).
الرقم 6:. OP9 أحادي الطبقة بعد جمع HPCS في اليوم ثقافة مشتركة 8 (AC) مجموعة مناسبة من اختلال OP9 أحادي الطبقة بعد الغسيل دقيق لحصاد HPCS (D) مثال لأحادي الطبقة OP9 التي تم الإفراط في تعطلت يوما بعد يوم 8 HPC إجراء الحصاد.
تحليل تدفق الممثل الخلوي (FACS) في نقطة معينة خلال وقت: الرقم 7مسك التمايز في المختبر. (A) لتلطيخ محمر (يسار)، وحيدي (وسط) والخلايا B (يمين) منتجات مسك-OP9 المشارك الثقافة في اليوم 12 أو 16 كما هو مبين. (B) تلطيخ لتطوير خلايا T في النقاط الزمنية المشار إليها من مسك-OP9-DL1 ثقافة مشتركة. يرجى الاطلاع على النص وصفا تفصيليا للimmunophenotypes.
الرقم 8. مخطط للخطوات الإجراء مسك-OP9 المشارك الثقافة. (A) الخطوات الرئيسية لنقل الخلية الثمانية أيام الأولى من شارك في الثقافة. العدد التقريبي للخلايا المصنف على الخلايا OP9 في أيام يشار إلى الصفر وخمس سنوات. (B) الخطوة نقل يوم 8 و المنتجات تمايز الخلايا المتوقع الكشف عنها بواسطة التدفق الخلوي في timepoints الرئيسية ثقافة مشتركة. يرجى الاطلاع على النص وصفا تفصيليا للimmunophenotypes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدمت نظام OP9-DL1 ثقافة مشتركة لدراسة دور الجينات منتجات مختلفة خلال تطوير أنواع خلايا الدم من الخلايا الجذعية. 8،12،13 وقد ثبت أيضا نموذج فعال لدراسة وظيفة الجين DNA التنظيمي خلال تمايز الخلايا. 9،14 باستخدام هذا النهج كبديل لنماذج الماوس كلها يمكن أن تسفر عن وفورات كبيرة في الوقت والتكلفة من التجارب التي تعالج العديد من الأسئلة الأساسية في تكون الدم. ومع ذلك، والتكيف مع هذا البروتوكول لهذه الأغراض يتطلب الاطلاع على التباين المحتمل بين الحيوانات المستنسخة مسك التي ستستخدم في هذه الإجراءات. الجدول الزمني للبروتوكول المنشورة من توقع حدوث المتوسط، بالاضافة الى الحفاظ على، وغير التلاعب خط مسك 7 بالإضافة إلى ذلك، استنساخ مسك اختارت لتوليد الفئران خيالية وعادة ما تكون ذات جودة أعلى وسوف تؤدي بقوة جدا في OP9 المشارك الثقافة . من ناحية أخرى، استنساخ مسك الناشئة مباشرة من مستقرسوف ترنسفكأيشن مع التحوير متكاملة ectopically عرض درجات متفاوتة من كفاءة التمايز الأولية تتراوح بين المتوسط إلى المتوسط أدناه. بروتوكول الموصوفة هنا ينص على تأخير الاستراتيجي 1-2 يوم من الخطوة 5 حتى مرور يوم لخروج هذه الاختلافات المحتملة قبل تحريض تكون الدم في المختبر.
مرور يوم 8 هو الخطوة التي تنفيذ هذا البروتوكول لديه معظم احتمالات الخطأ. سوف الصبر والممارسة والملاحظة الدقيقة تمكين احد لتطوير الاسلوب الذي يحسن الحصاد HPC مع تقليل تعطيل OP9 أحادي الطبقة. ما وراء الرئيسية يوم 5 ويوم 8 خطوات، المعلمات حرجة تنطوي دقيقة الصيانة زراعة الخلايا (خلايا OP9 خاصة، كما هو موضح أعلاه)، وإيلاء اهتمام خاص لالكواشف المستخدمة في البروتوكول. الكاشف الأكثر أهمية هو FBS. والكثير من FBS متميزة تختلف بشكل ملحوظ في قدرتها على دعم هذا الإجراء. يجب أن يتم اختبار الكثير متعددة في سrder لتحديد ما الذي سوف تسفر التمايز القوي في هذا الاختبار.
هذا النظام المشترك الثقافة لها حدودها. على سبيل المثال، وهذا النموذج لا يدعم تمايز خلايا CD4 إيجابية واحدة. وأحد أسباب ذلك هو عدم التعبير من معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) الدرجة الثانية البنية التحتية لتقديم المستضد في الخلايا OP9. مطلوب 1 خلية عرض سطح المستضدات من قبل MHC الدرجة الثانية لتحقيق التنمية السليمة للخلايا CD4 SP. خلايا CD8 SP التي لا تظهر تمثل مزيجا من مراحل خلية توتية CD8 SP ناضجة وغير ناضجة. 1 وعلاوة على ذلك، زرع ناجحة من مسك تستمد T أسلاف الخلايا في الماوس يتطلب مرور مسبق من خلال الثقافة الجهاز الغدة الصعترية الجنين. 1 ومع ذلك، فقد أثبتت هذه التكنولوجيا وعد كنهج التحقيق قوية على السؤالين الخلوية والجزيئية في تنمية الدم والجهاز المناعي التي كانت في السابق ممكنا فقط لاستكشاف في الخامسايفو. وهكذا، وبصرف النظر عن تقديم وسيلة جديدة لكسب المزيد من التقدم السريع على هذه الأسئلة واعتماد أكبر من نظام المشاركة في الثقافة OP9-ESC سيكون لها تأثير أوسع نطاقا للحد من استخدام حيوانات التجارب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Stem cell qualified FBS | Gemini | 100-125 | Heat inactivated |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| L-alanyl L-glutamine | Corning | 25-015-CI | |
| HEPES buffer | Millipore | TMS-003-C | |
| Non-Essential Amino Acids | ThermoScientific | SH30853.01 | |
| Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml) | Life Technologies | 15750-060 | |
| β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS | Life Technologies | 21985-023 | |
| Filter Unit | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm PES membrane |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CM | |
| α-MEM | Life Technologies | 12000-022 | Powder, reconstitute per manufacture recommendation |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| FBS | ThermoScientific | SH 30396.03 | Testing of individual lots required |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma | D2650 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand | R&D Systems | 308-FK | |
| Recombinant Murine IL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| Utrapure water with 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| MEFs mitomycin C treated | Millipore | PMEF-CF | Any mitotically arresteded MEFs can be used |
| DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| Cell strainer (40 μm) | Fisher | 22363547 | |
| Tissue culture dish 100 x 20 mm | BD Falcon | 353003 | |
| Multiwell 6-well | BD Falcon | 353046 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | Tubes for FACS |
| ES R1 cells | ATCC | SCRC-1011 | |
| OP9 cells | Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan). | ||
| OP9-DL1 cells | Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory. | ||
| FlowJo software | Tree Star | FACS data analyses | |
| Flow Cytometer | BD | FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab |
References
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
- Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
- de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
- Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
- Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
- Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
- Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
- de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
- Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
- Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).
