Protocol
Kültür Medya, Sitokinlerle ve Jelleşmiş Plakaların 1. Hazırlık
- Yüksek glikoz ve sodyum piruvat ile Eagle Medium (DMEM) içinde Dulbecco modifikasyonu kullanılarak bir ES hücre ortamı hazırlayın. % 1 HEPES Tamponu,% 1 non-essential amino aist,% 0.1 gentamisin (50 mg / ml) ve% 0.1 (Fetal Sığır Serumu (FBS) Kalifiye% 20 ESC,% 1 Penisilin / Streptomisin,% 1 L-glutamin, ekleme 55 uM), β-mersaptoetanol eklenir. Süzme ile ES hücre ortamı sterilize edin.
- Üreticinin talimatlarına göre toz Alfa Minimum Esansiyel Medium (α-MEM) 1 L yaparak OP9 ortamı hazırlayın. % 20 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 Penisilin / Streptomisin ekleyin. Karıştırmak için ters. Iki adet 500 ml'lik alikota süzme ile sterilize edin.
NOT: tozundan yapılan medya kullanımı tavsiye ve geliştirilmiş OP9 hücre bakım ve in vitro farklılaşma sonuçları elde etmek muhtemeldir. Bu yaklaşım standart bir prosedür haline gelmiştir. Ancak, biz de tha dikkatt biz bazen yeterli başarı ile önceden yapılmış sıvı α-MEM kullandık. - % 90 FBS,% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) eklenerek ortam dondurma hazırlayın. Yavaşça karıştırınız ve süzülerek sterilize. 4 ° C'de saklayın.
- 10 ug / ml tam ortam içinde OP9 insan rekombinant Flt-3, ligand (Flt-3 L) içinde çözülmesiyle 2,000x Flt-3, ligand (10 ug / ml) hazırlayın. -80 ° C'de 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri içine kısım saklayın. Istikrar ve depolama ile ilgili tedarikçinin tavsiyelerine uyun.
Not: Flt-3L stabilitesi (4 ° C 'de 3 ay -80 ° C de 1 ay) kısadır. - Tam OP9 ortamını kullanarak 1,000x, IL-7 (1 ug / ml) hazırlayın. -80 ° C'de 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri içine kısım saklayın. Istikrar ve depolama tedarikçinin önerileri izleyin (IL-7 -80 ° C'de 12 aya kadar dayanır).
- LİF i 7 10 adet 1:10 seyreltme ile 1,000x, lösemi önleyici faktörü (LİF) ya da (10 ug / ml) hazırlayınn, ES hücre ortamı. 4 ° C'de muhafaza kısım. Kısım şişeler üzerinde üretici tarafından sağlanan son kullanma tarihini not ettiğinizden emin olun.
NOT: Ürün üretim tarihinden itibaren konsantre veya seyreltilmiş formu en az 18 ay stabildir. - Jelatinleştirilmiş 6 oyuklu plakalar hazırlamak ile 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 1.5 ml% 0.1 jelatin solüsyonunu ilave edin. Kaplama için en az 30 dakika izin kapakları ile oda sıcaklığında steril bir muhafaza içinde yemekler bırakın. Yemekler de nemlendirilmiş bir inkübatör içinde bir gece boyunca kalabilir. Sağ cep tohumlamadan önce herhangi bir artık jelatin çözüm çıkarın. Jelatin çözüm tamamen kuyuda kurumasına izin vermeyin.
2. Hazırlık ve Besleyici Hücreleri ve Fare Embriyonik Kök Hücreleri Bakım (Mesc)
NOT:% 5 CO2 ile nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör tüm hücreleri inkübe edin.
- Çözülme Fare Embriyonik Fibroblastlar (MEF)
- Donmuş bir flakon (~ 5 x 10 6 Hızlı-çözülme
- Yavaş yavaş dondurma ortamından DMSO sulandırmak için damla damla olarak, çözülmüş hücrelere ES hücre ortamı 8 ml ilave edilir.
- 5 dakika boyunca 4 ° C'de 400 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve ES hücre ortamı, 3 ml hücre pelletini.
- Önceden ısıtılmış ES hücre ortamı 33 ml 50 ml'lik bir santrifüj tüpü hazırlayın. 36 ml nihai hacme getirmek üzere yeniden süspansiyon haline getirilmiş MEF'lerin 3 ml ilave edilir.
- İki jelatinleştirilmiş 6 oyuklu plakaların her bir kuyunun içine yeniden süspanse MEF'lerin 3 ml dağıtın. Hücreler takın ve onlara mESCs, tohumlamadan önce yaymak için izin vermek üzere en az altı saat süreyle tekrar inkübatör içine tabak yerleştirin. Medya her 2-3 günde bir değiştirilir ise bu mitotikal tutuklandı besleyici katmanlar, ilk ekimden birkaç gün boyunca kullanılabilir olabilir.
NOT: Taze tutuklandı MEF'ler da kullanılabilir. </ Ol>
- Tohumlama mESCs
- 37 ° C su banyosu içinde dondurulmuş Mesc klon ile bir şişe hızlı çözünmesi ve 2.1.1-2.1.3 tarif edildiği gibi hücrelerini hazırlamak.
NOT: Bir 6-çukurlu plaka bir birleşik kuyusundan Mesc 2 şişe dondurma. - (Adım 2.1.5 hazırlandı) tutuklandı MEF tek tabakasıyla 6-plaka (Mesc klonu itibarıyla) bir kuyudan ortamları çıkarın ve MEF tek tabaka üstüne mESCs ve 3 ml tohum. 1,000x LİF (10 ng / ml), 3 ul ekleyin. Kuvöz içine yemekleri dönün.
- 37 ° C su banyosu içinde dondurulmuş Mesc klon ile bir şişe hızlı çözünmesi ve 2.1.1-2.1.3 tarif edildiği gibi hücrelerini hazırlamak.
- ES hücre bakım ve tripsin aracılı geçit
NOT: Mesc izdiham göre değiştir günlük medya, ya da bölünmüş. Optimal, hasat ve split / yeniden-plaka hücreleri her gün.- ES hücre ortamı çıkarın ve 2 ml PBS ile mESCs yıkayın. PBS çıkarın. % 0.25 tripsin 1 ml ilave edilir ve 3-5 dakika 37 ° C'de inkübe edin.
- Tripsinize hücreleri toplamak ve 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içine transfer edin. Şiddetle m topaklannı kırmaya hücre süspansiyonu pipetleyinEKH. Tripsin nötralize etmek için hücre süspansiyonu tam ES hücre ortamı 2 ml ilave edilir.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj hücreleri. Süpernatantı ve 3 ml ES hücre medya pelletini.
- Hazırlanan tutuklandı MEF tek tabakaları ihtiva eden 6 oyuklu plakalar ortamı çıkarın. Her bir oyuğa ES hücre ortamı, 3 ml (istenilen bölme oranına göre) hücre süspansiyonu uygun miktarda ekilmiş edin. 1,000x LIF 3 ul ekleyin. 2 gün içinde geçiş için hazır olacak 6: Birleşik bir Mesc de 1 bölün.
- OP9 / OP9-DL1 hücrelerin bakım
- OP9 hücrelerin bir şişe çözülme (adımları izleyin 2.1.1-2.1.3 OP9 medyayı kullanarak)
- 10 cm doku kültürü çanak 7 mi OP9 ortam ekleyin. Plaka boyunca hücrelerin dağıtılması, damla damla bir şekilde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler 3 ml ilave edilir. Gece boyunca inkübatör içinde hücreleri yerleştirin.
- Ertesi gün hücrelerin OP9 izdiham kontrol edin. Çanak birçok ölü yüzen hücreleri içeriyorsa, remoOrtamı ettik ve taze ortam OP9 10 ml ekleyin. Neredeyse tam izdiham görülmez ise inkübatör tabak dönmek. 4 yakın birleşik OP9 monolayer: Split 1 (tripsin kullanarak).
NOT: Tabaklar yaklaşık 2 gün içinde tekrar aynı izdiham düzeyine ulaşması gerekir. Aşırı yapışık hale OP9 hücreleri bırakmamaya özen gösterin. - Genişleme hisse senetleri gibi OP9 hücrelerin erken pasajlar dondurun.
NOT: konfluen 10 cm çanak yakın birinden OP9 hücrelerin 2 şişe dondurma. Genişletme stoklar Her bir ampul, aşağıda daha ayrıntılı olarak Mesc ko-kültür deneyleri kullanılan çalışma stoğu oluşturmak için çoğaltılabilir. Değişen sıcaklıklara olumsuz donar kalitesini etkileyebilir, çünkü daha -80 ° C'de derin dondurucuda daha sıvı azot içinde dondurulur, tüm OP9 stokları tutun.
3. OP9-DL1 Ortak kültür Prosedür
- Eş-kültür preparatlar
- Yaklaşık bir hafta önce, bir ortak-kültürünün başlatılmasından MEF'ler, mESCs ve OP9 Hücre çalışma STO çözülmecks. OP9-DL1 hücrelerinin ko-kültür gününde 8 kadar gerekli olmadığından, ko-kültür başlangıcından sonraki ilk üç gün boyunca OP9-DL1 hücrelerini eritin. Bakım ya da gerektiği gibi tüm hücreleri dondurmak.
- Deneyin ölçeği dayalı gün 0 ko-kültür ile% 80 kaynaşmaya eriştikten hazır OP9 hücre tekli katmanları, 10 cm tabaklar başlangıç sayısını belirlemek (örneğin, Mesc klonların sayısı ve ayırt edilmesi için ortak-kültür zaman noktalarının sayısı ile ) analiz edilebilir. 4 ve 1: bir ko-kültürü hazırlamak için, 1 ila OP9 hücrelerinin konfluent çanak yakınındaki bölme 6 iki gün önce mono tabakalar gerekli olacaktır ne zaman.
NOT: Bir ÇIK klon başına en az bir levha gerekir. Gün 5 pasaj altı tabak tohum için yeterli hücrelerin vermelidir 0. günde (aşağıda tarif edildiği gibi), genellikle, tek bir ESC klon, tek bir plaka üzerinde tohumlandı. Her gün 5 tabak bir sonraki analiz zaman noktasını sağlayacaktır. - OP9 monokatmanlar sürekli ko-kültür geçişi için gerekli olacak bu yana, bakımı her zaman HAYATIMIN almakko-kültür ile paralel olarak ilave OP9 kültür plakalarının yeterli sayıda.
- Gün 0: ortak-kültürünün başlatılması
- 2.3.1-2.3.4 gibi Mesc toplayın. Hücreleri saymak.
- Her bir klon için Mesc plaka başına OP9 ortam, 10 ml 5 x 10 4 Mesc hazırlar.
NOT:. Biz kullanılan olmasına rağmen, biz alternatif bir orta α-MEM,% 10 FBS oluşan ve 5 x 10 β-mercaptoethanol da farklılaşma ko-kültürlerinde kullanılmak üzere rapor edilmiştir -5 M 10 unutmayın - OP9 yemekleri eski ortamları çıkarın ve plaka boyunca eşit hücrelerini dağıtmak için özen yemekleri Mesc süspansiyonu 10 ml ekleyin. 37 ° C inkübatör yemekler yerleştirin.
- 3. Gün: Medya değişiklik
- Inkübatör yemekleri çıkarın ve mikroskop altında gözlemlemek. Koloniler üzere parlaklık kaybetmek ve basık görünür başlamalıdır.
- Yemekler ortamı kaldırın ve yavaşça taze OP9 10 ml ekleyinmedya.
- Inkübatör ko-kültür yemekleri dönün. Görsel kolonilerin% 80-90 görsel mezoderm-benzeri morfolojiye sahiptir ~ kadar gerçekleştirilemeyen gereken bir sonraki geçidin (gün 5) için, besleyici OP9 tek tabaka hazırlama zamanlama bilgi günlük mezoderm gibi koloni oluşumunu izlemek. 5 gün hücre transferi, aşama fazla erteleme 2 gündür.
- 5. Gün: ön-kaplama ile Tripsin aracılı geçit.
NOT: optimal konfluen OP9 hücreleri ile önceden 10 cm yemekleri yeterli sayıda hazırlayın. Ko-kültürler görsel aşama 3.3.3 açıklanan özellikler gösterir yalnızca sonraki adımlara devam (ayrıca Temsilcisi Sonuçlar bakınız).- Ko-kültür yemekleri ortamı çıkarın. Yıkamak için 4 ml PBS ilave edin. PBS girdap ve çıkarın. % 0.25 tripsin 4 ml ilave edilir ve ~ 5 dakika boyunca inkübatör yemekler yerleştirin.
- Dikkat ederek kadar, aşırı hava kabarcıkları tanıtmak için, güçlü pipetleme ile tripsinize edilmiş hücre katmanı bozabilirHomojen, çoğunlukla tek bir hücre süspansiyonu elde edilir.
- Tam OP9 medya 4 ml ekleyin ve pipetleme karıştırın. 30 dakika boyunca inkübatör yeni, boş bir 10 cm çanak ve yerine hücreleri aktarın OP9 hücreleri çanak uymak için izin vermek. Bu "ön kaplama" aşaması eş-kültür bir sonraki adıma aktarılmıştır OP9 hücrelerin sayısını azaltır.
- 40 mikron hücre süzgeçler ile 50 ml santrifüj tüpleri hazırlayın.
- Ön kaplama çanak yapışkan olmayan hücreler toplanır ve daha sonra tüpe hücre süzgecinden yoluyla geçmektedir. 6 ml PBS'de hafifçe bulaşık yıkama ve arkasında bağlı OP9 hücreleri bırakarak aynı süzgecinden geçirin.
- 4 ° C'de 400 x g'de 5 dakika santrifüjleyin hücreleri. Süpernatantı ve tam OP9 medya 3 ml pelet hücreleri tekrar süspansiyon. Hücreleri saymak.
- Optimal Konfluent OP9 hücreleri ile 10 cm plakalardan ortamı çıkarın.
- Her analiz zaman noktası için, OP9 mono 5 x 10 5 hücre tohum10 ml nihai hacim içinde katmanı.
- 5 ng / ml insan rekombinan Fit-3L ekleyin ve inkübatör yemekler yerleştirin.
- 8. Gün: Hematopoetik progenitör Hücre (HPC) koleksiyonu
NOT: Bu aşama için süre içinde bu olacağı şekilde önceden OP9 veya OP9-DL1 hücre mono tabakaları ile 6 oyuklu plakaların yeterli sayıda Hazırlama ~% 80 konfluent.- 40 mikron filtreli, 50 ml santrifüj tüpleri hazırlayın.
- Inkübatör yemekleri çıkarın ve mikroskop altında gözlemlemek. Yüksek basınçlı bir parlak kümeleri gevşek OP9 tek tabaka eklenmesi gerekmektedir. Bir pipet ile OP9 tek tabaka ve yemeğin üzerine mevcut medya yıkanması (ama aşırı rahatsız değil) mümkün olduğunca bu hücrelerin birçok toplayın. Köpük oluşumu önlemek için, her zaman bu HPC toplama / yıkama aşaması sırasında pipet ucuna ortamın en az 1 ml bırakın.
- Bir tüp içine 40 um süzgecinden hücreleri geçirin. , Tüm HPC aynı plaka 8 ml PBS ilave edin ve bir mikroskop altında kontrol bizyeniden toplandı. Daha kuvvetli bir yıkama ile (eğer gerekli ise) PBS Yıkama / toplama aşamasından tekrar edilmelidir. Zaten aynı Hücreleri plakadan içeren tüp içine hücreleri süzün.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje hücreleri.
- 5 ng OP9 ortam (levha, 5. günde tohumlanır başına) 3 ml 'lik bir ana karışımı hazırlayın / ml Flt-3L ve 1 ng / ml IL-7.
- Fit-3L + IL-7 ana karışımı ile OP9 medya (işlenen her 10 cm çanak için 3 ml) süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. OP9 hücrelerine sahip bir 6-yuvalı plakanın bir oyuğuna Her levhadan toplanan hücreler aktarın.
- , Monositik, B hücreleri ya da eritroid soylar doğru pillerinin OP9 hücreler üzerine hücreler toplandı tohum için. T hücreleri elde etmek için, OP9-DL1 hücre mono tabakaları üzerine hücreleri tohum.
- Inkübatör içine 6 oyuklu plakalar yerleştirin.
- Gün 10: Medya değişiklik
- Her biri farklı klon Mesc besleyici hücre tipi Combina bir 15 ml santrifüj tüpü hazırlayınko-kültür tion.
- Flt-3L 5 ng / ml IL-7 ve 1 ng / ml 'si ile OP9 ortamın bir ana karışımı hazırlayın. Her bir oyuk için 3 ml hazırlayın.
- Yavaşça aynı ESC klon besleyici hücre tipi kombinasyonunu içeren çoklu ortam çukurlardan birleştirerek 6 oyuklu plakanın her bir medya toplar.
- Her bir kuyuya OP9 ortam ana karışımı 2 ml (3.6.2) ekleyin.
- Santrifüj, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de toplanmıştır ortam. Kuyu başına OP9 medya ana karışımı 1 ml her pelet (görünür eğer çok küçük) (3.6.2 bakınız) başlangıçta adımda 3.6.3 toplanan süpernatant kaldırmak ve tekrar süspansiyon.
- Lütfen, her oyuğa ortam başlangıçta 3 ml her bir hazne içinde toplanmıştır hacmi getiren başka içine hücre 1 ml dağıtın. Inkübatör yemekleri dönün.
- Gün 12: Hayır tripsin pasaj
Not: Bu s onlar optimal zamanında birleştirilebilmeli böylece önceden OP9 veya OP9-DL1 hücreleri ile 6 oyuklu tabaklarda yeterli sayıda hazırlayındım. Gün 12 geliştirme eritrosit, monositik ve erken evre T hücreleri akış sitometrisi analizleri için idealdir.- Bir ana karışımı Fit-3L 5 ng / ml IL-7 ve 1 ng / ml 'si ile OP9 ortam (ko-kültür içinde devam edecek her çukuruna 3 ml) hazırlayın.
- 40 um süzgeçler (ko-kültür, her klon-ESC besleyici hücre tipi kombinasyon için bir adet) ile 50 ml'lik bir santrifüj tüpü hazırlayın.
- Kuvvetlice kuyuda (tek tabaka da dahil olmak üzere) tüm hücreleri parçalamak için her bir oyuğa mevcut ortamı pipetle. Tek bir hücre süspansiyonu andıran bir kıvama gelinceye kadar güçlü pipetlenmesiyle devam edin.
- Tüp içine süzgecinden toplanan hücreler geçirin. Kalan tüm yıkama hücreleri ve toplamak için, her bir oyuğa PBS 3 ml ilave edilir. Aynı süzgecinden hücrelere geçerler. Aynı ESC klon-besleyici hücre tipi kombinasyonu içeren çoklu kuyu hücreleri birleştirin.
- Kullanılan hücre süzgeç atın ve bir kuyuya bir kısım eşdeğer kaldırmak (~ 6 ml) İstenilen için(ya da başka) akış sitometrisi o gün yürütülecek analiz eder. Kullanımdan önce buz üzerinde, bu alikotları saklayın.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje hücreleri. Süpernatantı. Oyuk başına ana karışımı 3 ml, 50 ml santrifüj tüpünden elde edilen pelet yeniden tohumlu edilmesi. Uygun besleyici bir hücre tipi için her hücre süspansiyonu, göz başına 3 ml ilave edilir ve kuluçka makinesi içindeki yemekler yerleştirin.
- Gün 14: Medya değişiklik
- Bölüm 3.6 özetlenen adımları izleyin.
- Gün 16: Hayır tripsin pasaj
NOT: Bu aşama için önceden en uygun konfluent OP9 veya OP9-DL1 hücreleri, 6 oyuklu kapları hazırlayın.
NOT: Flow sitometri B lenfositleri ve orta evre T hücrelerinin analizleri için günlük 16 idealdir.- Bölüm 3.7 özetlenen adımları izleyin.
- Gün 18: Medya değişiklik
- Bölüm 3.6 özetlenen adımları izleyin.
- Gün 20: Hayır tripsin pasaj
NOT: Gün 20 iAkış sitometri için s ideal bir T hücrelerini gelişmekte geç sahneye orta analizleri.- Bölüm 3.7 özetlenen adımları izleyin. İstenirse, hücreleri son gün 20 alternatif medya değişikliği ayırt taşımak ve hiçbir tripsin lenfosit genişleme oranı günlük izlenmesi ile, her iki gün geçitleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LİF mevcudiyetinde MEF'ler üzerinde yetiştirildiğinde, mESCs farklılaşmamış bir halde muhafaza edilebilir. İdeal koşullar altında, bunlar faz kontrast mikroskopisi parlak bir halosu ile çevrili olan hücrelerin yoğun kolonileri (Şekil 1) olarak görünür. Bu kültürler günlük olarak takip edilmelidir. Hücrelerin birleştiği bağlı olarak, ortam değiştirilebilir ya da hücre ayrılabilir. Komşu Mesc koloniler birbirleri ile temas noktasına gelmemeli. Farklılaşmamış mESCs bir normal, sağlıklı kültür, in vitro T hücre farklılaşması için önemli bir başlangıç noktasıdır. Ko-kültürünün başlatılması üzerine, bu hücreler, kalabalık olmadan tam olarak birleşmiş olması önerilir. OP9 monokatmanlar üzerine tohum hücreleri için hasat hücrelerin çoğunluğu (yerine besleyici hücreler daha) Mesc böylece bu. Izdiham önemli farklılıklar 0 günde ayırt edilmesi için çeşitli Mesc klonlar arasında gözlenen varsa, o tis öncesi uyarak MEFS kaldırmak için iyi olurduko-kültür tohumlama için mESCs saymadan önce (tam ES hücre ortamını kullanarak adım 3.4.3-3.4.6 gibi) dava kültür yemekleri.
(Bölüm 2.4 de tarif edildiği gibi) hücreler, önce OP9 ko-kültür başlatılmasını muhafaza edilmelidir. Buna ek olarak, OP9 hücrelerin uzun süreli kültür ve / veya çoğalma hızında belirgin artış ile bunların bazı özellikleri kaybetmek düşünülmektedir 7 1 ötesinde bölünme oranları kaçınmak:. OP9 hücrelerin bakımı sırasında 5 ve altı hafta sonra sürekli OP9 kültürleri atarak, Bu tuzaklardan kaçınmak yardımcı olacaktır.
Ko-kültür (gün 0, 5, 8, 12, 16) başlangıç hücre ve hücre transferi adımlarında OP9 mono tabakalar. Birleşiminin için optimum bir dağılım içinde olmalıdır 2 düşük (Şekil 2A) göstermektedir ve yüksek (Şekil 2B) eş-kültür mono-tabaka olarak kullanım için tavsiye OP9 hücre birleştiği aralığının sona erer. Aşırı birleşik levhanın bir örneği Şekil l'de gösterilmiştirure 2C. Uygun izdiham tutulamaması büyük miktarlarda, olumsuz yan-kültüre etkileyebilir, adipositler (Şekil 2B) oluşumuna neden olabilir.
Mezoderm oluşumu OP9 hücreleri üzerinde olduğu için tercih 0. günde, ko-kültür OP9 hücreleri yerine OP9-DL1 hücreleri üzerinde başlatılır. Hücreler, T hücresi üretimini indükleme 8. günde başlayan OP9-DL1 hücreleri tekli katmanlar üzerinde plakalanır. Bazı klonlar Mesc görsel ko-kültür (Şekil 3A-B) 'nin 5 gün ile mezoderm gibi koloni sağlam ve kantitatif (~% 90) oluşumunu gösterir iken, diğerleri bu adımda (Şekil 3C-F) gecikmeleri görüntüleyebilir. Mikroskop altında, bu tahlilde elde edilen mezoderm gibi koloniler değişken bir vagon tekerlekleri veya kraterler (Şekil 4A) veya starbursts veya çiçeği (Şekil 4B) benzer olarak tarif edilmiştir.
Yayınlanan OP9-DL1 protokol kantitatif mezoderm formasyonunun bir norm yansıtırkenko-kültür günlük 5 ile siyon, 7 hepimiz ESC klonlar bu zaman dilimi içinde bu normu elde değil bulmak. Bu durumlarda, biz günde 5 üzerinde orta değiştirmek ve "günde 5" hücre hasat / transfer protokolü yapmadan önce ek bir 1-2 gün bekleyin. Bu gecikme amacı Aktarılmadan önce görsel hale mezodermal için ~ ES hücre kolonilerinin% 80-90 sağlamaktır. Bu% 80-90 rakam ko-kültür yemekleri koloni morfolojisinin basit faz kontrast mikroskobik muayene ile bir kesinlikle görsel kriter ayırt yansıttığını net yapmak önemlidir. Sadece Şekil 4'te gösterilen daha çok benzeyen ÇIK kolonilerin oranını ifade etmektedir. Bazı ÇIK klonlar da iki günlük bir bekleme süresinden sonra, bu görsel kritere ulaşmaz olanaklıdır. Daha önce tarif edilmiş olduğu gibi böyle bir durumda, bu, Flk-1 + hücreleri için ayırma hücresine akış sitometrisi kullanılarak kan yapıcı mezodermal öncüleri zenginleştirmek için mümkündür. Her durumda 6,11, SAke isimlendirme kolaylık, biz "saat reset" ve "5. günde" olarak mezoderm benzeri koloni transfer güne bakın
Birden ESC klonlar paralel olarak ayırt ediliyor, bu başkalarının gerisinde ise bazı co-kültürler, zamanında günde 5 geçişi için hazır olacağı mümkündür. Bu durumda, bu klonlar, daha yavaş diğerlerine yakalamak kadar tüm eş kültürlerinde geçişini geciktirmek için tavsiye edilir. Gecikme "zamanında" co-kültürler herhangi bir zarar değil gibi görünüyor, ama yavaş klonlar büyük bir sonraki farklılaşmasını yararlanır.
8. Gün (yani, mezodermal koloni transferi üç gün sonra) HPC doğuşunu ve birikimini görür. HPC gevşek OP9 besleyici hücreleri (Şekil 5) yapışık hücre parlak kümeleri olarak görebilir. Terk ederken dikkatli bir yıkama işlemi, bir pipet ve yemeğin üzerine medyayı kullanarak, ayırmak ve HPC toplayacakOP9 tek tabaka çok sağlam (Şekil 6A-C). Bu belki de protokolün en tekniği duyarlı bir adımdır. Bu besleyici tabakanın en az bozulma ile HPC maksimal hasat istenilen denge elde etmek için uygun hareketler ve medya fırlatma basıncını bulmak için biraz pratik alır. OP9 tek tabaka kapalı bazı kaldırması halinde filtreleme. Şekil 6D gerekenden fazla tek tabakalı bozulmasına yol açan aşırı pipetle sonra bir tek tabaka gösterdikten sonra herhangi bir sokak tek tabaka çoğunluğu 40 mikron naylon örgü çekilecek beri, kabul edilebilir. Bu yıkama basamağı sırasında tüm HPC toplanmıştır olsun ya da mikroskop altında kontrol ve buna göre yıkama basıncı ayarlamak için önemlidir.
Eş-kültür İlerleme akış sitometrisi ile izlenebilir. Özellikle ESC olmayan eritroid hematopoietik döl analiz etmek için, canlı CD45 + hücreleri üzerinde birinci kapısı önemlidir.Analizlerde OP9 hücrelerin dışarı Bu adım ekranları, DAPI veya diğer nükleer boyama boya kullanımı cansız hücrelerin dışlanmasını sağlar iken. 12. günde, küçük, yuvarlak, parlak hücrelerin birçok kümeleri görünür olmalıdır. Bu aşamada hücreleri saymak için gerekli değildir. Ancak, canlı kapı akış sitometri olay sayısı de gün 12 ko-kültür başına 1-3 x 10 5 aralığında, tipik olarak gözlemlemişlerdir. Akış sitometrisi eritroid verecektir OP9 tabaka üzerinde farklılaşmış canlı kapılanmış hücrelerin (CD45 negatif, Ter119 +) ve monositik (CD45 +, CD11 yüksek) soyları (Şekil 7A) analiz edildi. CD4 / CD8 çift negatif karakteristik belirteçleri açığa çıkarmalıdır OP9-DL1 mono tabakaları ayırt üzerinde canlı, CD45 + hücrelerin Analizleri (DN) -1 (CD44 +, CD25 negatif, CD4 negatif, CD8 negatif) ve DN2 (CD44 +, CD25 +, CD4 negatif, CD8 negatif) evre T hücreleri (Şekil 7B ng>). 16. günde, kültürler küçük, yuvarlak, parlak hücrelerin miktarında önemli bir artış vardır. OP9-DL1s, DN3 (CD44 negatif kan, CD25 +, CD4 negatif, CD8 negatif) ve DN4'den (CD44 negatif, CD25 negatif, CD4 negatif, CD8 negatif) aşamaları T hücre farklılaşması ürünleri ilerleme. Bazı DP (CD4 +, CD8 +) T hücreleri, 16 gün (Şekil 7B) ile ortaya çıkan başlayabilir. HPC OP9 hücreleri üzerindeki, hücre DP T hücreleri ve tek bir pozitif (SP), CD8 + T hücrelerinin bu büyük miktarları (olacaktır OP9-DL1-Mesc ortak-kültürünün bir gün 20 gün ile 16 ile sağlanan B hücreleri (CD19 +) elde ekildi Şekil 7B). Şekil 8, yukarıda anlatılan prosedürlerin kilit adımları özetleyen bir diyagram ve ko-kültür esnasında önerilen analizi zaman noktaları sağlar.
ghres.jpg "/>
MEF tek tabaka (100X büyütme) üstünde büyüyen ayrışmamış mESCs (keskin kenarlı koloniler) Şekil 1. Faz kontrast mikroskobu görüntüsü.
Şekil 2:. OP9 tek katmanlı confluency Faz kontrast mikroskobu görüntüleri (A) En düşük ve ko-kültür kanalı / tohumlama (40X büyütme) için tavsiye (B) yüksek confluency düzeyleri aşırı konfluent OP9 tek tabaka (40X büyütme (C) Örnek. adiposit oluşumu (içeren büyük, vezikül, hücreler ile). (D) Aşırı Konfluent OP9 tek tabaka (200X büyütme)).
Şekil 3: faz kontrast mikroskopko-kültür "günde 5" de mezoderm benzeri koloni oluşumu y görüntüleri. (A)>% 90 mezodermal koloni farklılaşma ile ko-kültür plakaları 40X ve (B) 100X bakıldı. Bu plakalar gün 5 geçişi için hazır. Transferi (C & E, 40X büyütme, D & F, 100X büyütme) önce 1-2 gün ertelenmesine ihtiyaç Gün 5 ko-kültür plakaları (CF) örnekler.
Şekil 4: ko-kültür 5. günde mezoderm-benzeri koloni oluşumları çeşitli Faz kontrast mikroskobu görüntüleri (A) "kraterler" veya olarak anılacaktır koloni morfolojisi (B) atıfta koloni morfolojisi. "Vagon tekerleği." "starburst" veya "çiçeği" (200X büyütme) gibi.
Bir OP9 tek tabaka (40X büyütme) küçük, yuvarlak, parlak HPC kümeleri ile gün 8 ko-kültür plaka Şekil 5. Faz kontrast mikroskobu görüntüsü.
Şekil 6:.. Gün kesintiye over-ko-kültür 8. günde HPC toplandıktan sonra OP9 tek tabakalı (AC) HPC hasat için dikkatli yıkandıktan sonra OP9 tek tabaka bozulması Uygun aralığı (D), bir OP9 monolayer bir örnek olmuştur 8 HPC hasat prosedürü.
Şekil 7: Temsilci akım sitometri (FACS) sırasında belirli zaman noktalarında analizleriin vitro Mesc farklılaşması. (A), eritroid (sol), monositik (orta) ve B hücre için boyama, (sağ) günde 12 ya da belirtildiği gibi 16 ° Mesc-OP9 ko-kültür ürünleri. (B) belirtilen zaman noktalarında T hücrelerinin geliştirilmesi için lekeleme Mesc-OP9-DL1 ko-kültür. Immünolojik ayrıntılı açıklamaları için metin bakın.
Mesc-OP9 ko-kültür prosedürü aşağıdaki aşamaları Şekil 8. diyagramı. (A) eş-kültür ilk sekiz gün arasında önemli hücre transferi, adım. Sıfır ile beş belirtilmiştir günde OP9 hücreleri üzerinde tohumlandı hücrelerin yaklaşık sayısı. (B), gün 8 ve aktarma adımı sitometri ortak-kültürünün önemli zaman noktalarında akış ile saptanan beklenen hücre farklılaşması ürünleri. Immünolojik ayrıntılı açıklamaları için metin bakın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OP9-DL1 ko-kültür sistemi, kök hücreleri, kan hücre tiplerinin gelişimi esnasında, gen rolünü incelemek için kullanılmıştır. 8,12,13 Ayrıca gen düzenleyici DNA fonksiyonlarını incelemek için etkin bir modeli olduğu kanıtlanmıştır hücre farklılaşması sırasında. 9,14 zaman ve hematopozun birçok temel soruları deneylerin maliyeti önemli ölçüde tasarruf elde edebilirsiniz tüm fare modellerine alternatif olarak bu yaklaşımı kullanarak. Bununla birlikte, bu amaçlar için, bu protokol adaptasyonu, bu işlemlerde kullanılacak Mesc klon arasında olası değişkenliği idrak gerektirir. Yayınlanan bir protokolün çizelgesi ortalama beklenebilir, bakımlı olmayan manipüle Mesc hattı. 7 Buna ek olarak, Mesc klonlar çoğunlukla yüksek kalitede ve OP9 ko-kültür çok sağlam gerçekleştirecek kimerik farelerin üretilmesi için seçilmiş . Öte yandan, stabil klonlar Mesc şirketinden çıkanBir ektopik entegre transgenle transfeksiyon ortalama ile ortalamanın altında değişen ilk farklılaşma verimliliği değişen derecelerde gösterecektir. Burada açıklanan protokol in vitro hemopoeziste indüksiyonu öncesinde bu potansiyel farklarını eşitlemek için gün 5 geçiş adımı stratejik 1-2 gün gecikme sağlar.
Gün 8 pasaj bu protokolün yürütme hatası için en potansiyele sahip hangi adımdır. Sabır, uygulama ve dikkatli gözlem OP9 tek tabakalı kesintileri en aza indirerek HPC hasat optimize tekniğini geliştirmek için bir sağlayacaktır. Anahtar gün ve 5 gün 8 adımları dışında, en önemli parametre protokolünde kullanılan reaktiflere (yukarıda tarif edildiği gibi, özellikle OP9 hücreleri) titiz hücre kültür bakım ve özel dikkat gerektirir. En kritik reaktif FBS. FBS Farklı bir sürü bu yordamı desteklemek için kendi yeteneği belirgin değişecektir. Birden çok o test edilmelidirSarf bu deneyde sağlam farklılaşma verecek belirlemek için.
Bu ko-kültür sistemi sınırlamaları vardır. Örneğin, bu model, tek bir pozitif CD4 hücrelerinin farklılaşmasına da değildir. Bunun bir nedeni, OP9 hücrelerinde büyük histo-uyumluluk kompleksi (MHC) sınıf II antijen sunumu alt ifade eksikliğidir. MHC Sınıf II antijenlerinin 1 CD4 hücre yüzeyi sunum SP hücrelerinin doğru gelişimi için gereklidir. Ortaya yapmak CD8 SP hücreler olgun ve olgunlaşmamış CD8 SP timosit aşamalarında bir karışımını temsil eder. 1 Dahası, Mesc başarılı transplantasyonu bir fare içine T hücre atalarıdır türetilmiş fetal timus organ kültürü yoluyla önceki geçişi gerektirir. 1 Yine de, bu teknoloji kanıtlamıştır onun v keşfetmek için şimdiye kadar sadece kan ve bağışıklık sistemi gelişimi hem de hücresel ve moleküler sorulara güçlü bir soruşturma yaklaşım olarak söz veriyorumivo. Böylece, kenara deney hayvanlarının kullanımının azaltılması geniş bir etkisi olacak bu sorulara daha hızlı ilerleme, OP9-ESC ko-kültür sisteminin daha geniş kabul yapmak için yeni bir yol vermekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Stem cell qualified FBS | Gemini | 100-125 | Heat inactivated |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| L-alanyl L-glutamine | Corning | 25-015-CI | |
| HEPES buffer | Millipore | TMS-003-C | |
| Non-Essential Amino Acids | ThermoScientific | SH30853.01 | |
| Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml) | Life Technologies | 15750-060 | |
| β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS | Life Technologies | 21985-023 | |
| Filter Unit | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm PES membrane |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CM | |
| α-MEM | Life Technologies | 12000-022 | Powder, reconstitute per manufacture recommendation |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| FBS | ThermoScientific | SH 30396.03 | Testing of individual lots required |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma | D2650 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand | R&D Systems | 308-FK | |
| Recombinant Murine IL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| Utrapure water with 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| MEFs mitomycin C treated | Millipore | PMEF-CF | Any mitotically arresteded MEFs can be used |
| DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| Cell strainer (40 μm) | Fisher | 22363547 | |
| Tissue culture dish 100 x 20 mm | BD Falcon | 353003 | |
| Multiwell 6-well | BD Falcon | 353046 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | Tubes for FACS |
| ES R1 cells | ATCC | SCRC-1011 | |
| OP9 cells | Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan). | ||
| OP9-DL1 cells | Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory. | ||
| FlowJo software | Tree Star | FACS data analyses | |
| Flow Cytometer | BD | FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab |
References
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
- Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
- de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
- Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
- Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
- Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
- Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
- de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
- Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
- Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).
