Protocol
1. Herstellung von Kulturmedien, Zytokine und Gelatinierte Platten
- Bereiten ES-Zell-Medien mit Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit hoher Glukose und Natrium Pyruvat. Fügen Sie 20% ESC qualifiziert Fetal Bovine Serum (FBS), 1% Penicillin / Streptomycin, 1% L-Glutamin, 1% HEPES-Puffer, 1% nicht-essentielle Aminosäuren, 0,1% Gentamicin (50 mg / ml) und 0,1% ( 55 uM) β-Mercaptoethanol. Sterilisieren ES-Zellmedium durch Filtration.
- Vorbereitung OP9 Medien, indem 1 l Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) aus Pulver nach den Anweisungen des Herstellers. Mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin. Kehren Sie zu mischen. Sterilisieren durch Filtration in zwei 500 ml-Aliquots.
HINWEIS: Die Verwendung von Medien aus Pulver hergestellt wird empfohlen und wahrscheinlich verbessert OP9 Zelle Wartung und In-vitro-Differenzierung Ergebnisse. Dieser Ansatz hat sich zu unserem Standardverfahren. Beachten Sie jedoch, wir auch that wir manchmal verwendet vorgefertigten flüssigen α-MEM mit ausreichenden Erfolg. - Vorbereitung Gefriermedien durch Zugabe von 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) und 90% FBS. Vorsichtig schwenken und zu sterilisieren durch Filtration. Lagerung bei 4 ° C.
- Vorbereitung 2,000x Flt-3-Ligand (10 ug / ml) durch Lösen humanen rekombinanten Flt-3-Ligand (Flt-3L) in komplettem Medium OP9 bis 10 ug / ml. Aliquot in 1,5 ml Reaktionsgefäße und bei -80 ° C. Folgen des Lieferanten Empfehlungen bezüglich Stabilität und Lagerung.
HINWEIS: Die Stabilität von Flt-3L ist kurz (1 Monat bei 4 ° C oder 3 Monate bei -80 ° C). - Vorbereitung 1,000x IL-7 (1 ug / ml) unter Verwendung von vollständigen OP9 Medien. Aliquot in 1,5 ml Reaktionsgefäße und bei -80 ° C. Folgen Sie den Empfehlungen des Lieferanten, die auf Stabilität und Lagerung (IL-7 ist bei -80 ° C für bis zu 12 Monate haltbar).
- Vorbereitung 1,000x Leukemia Inhibitory Factor (LIF) (10 ug / ml) durch eine 1:10 Verdünnung von 10 7 Einheiten LIF in ES-Zell-Medien. Speicher Aliquots bei 4 ° C ist. Notieren Sie die vom Hersteller auf den aliquoten Fläschchen vorgesehen Ablaufdatum.
HINWEIS: Das Produkt ist in konzentrierter oder verdünnter Form mindestens 18 Monate ab dem Datum der Herstellung stabil. - Bereiten gelatinisierten 6-Well-Platten von 1,5 ml von 0,1% Gelatine-Lösung in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Die Teller in den sterilen Abzug bei Raumtemperatur mit Deckel auf, so dass mindestens 30 min für die Beschichtung. Die Schalen können auch in einem befeuchteten Inkubator über Nacht stehen gelassen werden. Entfernen Sie alle übrig gebliebenen Gelatinelösung direkt vor Zellaussaat. Lassen Sie sich nicht die Gelatinelösung vollständig trocknen im gut.
2. Vorbereitung und Wartung von Feeder-Zellen und embryonalen Stammzellen der Maus (MESC)
Hinweis: Alle Zellen inkubiert in einer befeuchteten 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2.
- Auftauen embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF)
- Quick-tauen eine gefrorene Fläschchen (~ 5 x 10 6
- 8 ml ES-Zell-Medien, um den aufgetauten Zellen in einem Dropdown-weise Mode allmählich verdünnen das DMSO aus dem Gefriermedium.
- Zentrifuge Zellen bei 400 x g bei 4 ° C für 5 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und Zellpellet in 3 ml ES-Zellmedium.
- Vorbereiten einer 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit 33 ml vorgewärmten ES-Zellmedium. Fügen Sie die 3 ml resuspendiertes MEFs, um das Endvolumen auf 36 ml zu bringen.
- Verteilen 3 ml der resuspendierten MEFs in jede Vertiefung zwei gelatinierte 6-Well-Platten. Legen Sie die Platten in den Brutschrank für mindestens sechs Stunden, um damit die Zellen anlagern und ausbreiten vor der Aussaat die mESCs auf sie. Diese mitotisch verhaftet Feeder-Schichten kann für mehrere Tage nach der ersten Aussaat verwendbar sein, wenn ihre Medien wird alle 2-3 Tage gewechselt.
HINWEIS: Frisch verhaftet MEFs können ebenfalls verwendet werden. </ Ol>
- Seeding mESCs
- Quick-tauen ein Fläschchen mit einem gefrorenen MESC Klon in der 37 ° C-Wasserbad und bereiten Zellen, wie in 2.1.1-2.1.3 beschrieben.
HINWEIS: Wir frieren 2 Fläschchen von MESC aus einer konfluenten Vertiefung einer 6-Well-Platte. - Entfernen Sie das Medium aus einer gut (pro MESC Klon) der 6-Well-Platte mit MEF verhaftet Monoschichten (in Schritt 2.1.5 vorbereitet) und Samen der 3 ml mESCs auf dem MEF-Monoschicht. Hinzufügen 3 ul 1,000x LIF (10 ng / ml). Zurück Gerichte in den Brutschrank.
- Quick-tauen ein Fläschchen mit einem gefrorenen MESC Klon in der 37 ° C-Wasserbad und bereiten Zellen, wie in 2.1.1-2.1.3 beschrieben.
- ES-Zell-Wartung und Trypsin-vermittelte Durchgang
HINWEIS: Medienwechsel täglich, oder Split basierend auf Zusammenfluss von MESC. Optimal, Ernte und Split / re-Platte die Zellen jeden zweiten Tag.- ES-Zell-Medien entfernen und waschen mESCs mit 2 ml PBS. PBS zu entfernen. 1 ml 0,25% Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für 3-5 min.
- Sammeln trypsiniert Zellen und übertragen sie in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen. Kräftig pipettieren die Zellsuspension zu brechen Klumpen von mWSR. 2 ml des vollständigen ES-Zellmedium zu der Zellsuspension, um das Trypsin zu neutralisieren.
- Spin-Zellen bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C ist. Überstand entfernen und das Pellet in 3 ml ES-Zellmedium.
- Entfernen Sie das Medium aus 6-Well-Platten, die bereit verhaftet MEF-Monoschichten. Die geeignete Menge der Zellsuspension (basierend auf dem gewünschten Aufteilungsverhältnis) in 3 ml ES-Zellmedium in jede Vertiefung ausgesät zu werden. Hinzufügen 3 ul 1,000x LIF. Eine konfluente MESC gut aufgeteilt 1: 6 bereit für den Durchgang in 2 Tagen sein.
- OP9 / OP9-DL1 Zelle Instandhaltung
- Tauwetter ein Fläschchen OP9 Zellen (befolgen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.3 mit OP9 Medien)
- 7 ml OP9 Medien bis 10 cm Gewebekulturschale. Fügen Sie die 3 ml resuspendierten Zellen in einem Dropdown-weise Weise, Verteilung Zellen im ganzen Platte. Legen Sie die Zellen über Nacht im Brutschrank.
- Prüfen Sie am nächsten Tag den Zusammenfluss der OP9 Zellen. Wenn das Gericht viele tote Zellen enthält schwimm Remove die Medien und die 10 ml frischem OP9 Medien. Gibt die Schale in den Inkubator, wenn fast voll Fluss nicht beachtet wird. Split (unter Verwendung von Trypsin) 1: 4 in der Nähe der konfluenten Monolayer OP9.
HINWEIS: Die Platten sollten gleiche Ebene Zusammenfluss wieder in ca. 2 Tagen zu erreichen. Achten Sie darauf, OP9 Zellen über-konfluent werden zu lassen. - Einfrieren der frühen Passagen der OP9 Zellen als Erweiterung Aktien.
HINWEIS: Wir frieren 2 Fläschchen von OP9 Zellen von einem in der Nähe von konfluenten 10 cm Schüssel. Jedes Fläschchen der Expansion Lager weiter propagiert werden, um Arbeitsvorräte, die später in MESC Co-Kultur-Experimente verwendet werden zu erstellen. Bewahren Sie alle OP9 Bestände in flüssigem Stickstoff eingefroren und nicht in der -80 ° C-Gefrierschrank, da Temperaturschwankungen können sich negativ auf die Qualität der friert.
3. OP9-DL1 Co-Kultur-Verfahren
- Co-Kultur-Zubereitungen
- Etwa eine Woche vor dem Beginn der Ko-Kultur, auftauen MEFs, mESCs und OP9 Zelle arbeiten stocks. Seit OP9-DL1 Zellen nicht bis Co-Kultur-Tag 8 erforderlich ist, tauen die OP9-DL1 Zellen während der ersten drei Tage nach der Co-Kultur-Initiation. Erhalten oder zu frieren alle Zellen, wie gebraucht.
- Bestimmen die Anfangszahl von 10 cm-Platten mit OP9 Zellmonoschichten zu 80% Konfluenz auf Co-Kultur Tag 0, basierend auf dem Ausmaß des Experiments zu erreichen (zB Anzahl der MESC Klone unterschieden werden und die Anzahl der Co-Kultur-Zeitpunkte analysiert werden). Um nach einer Co-Kultur vorzubereiten, teilen nahezu konfluenten Gericht OP9 Zellen zwischen 1: 4 und 1: 6 zwei Tage vor, wenn die Monoschichten benötigt werden.
HINWEIS: Man wird zumindest eine Platte pro ESC-Klon müssen. Typischerweise ausgesät eine einzige ESC-Klon auf einer einzigen Platte am Tag 0 (wie unten beschrieben) sollte genügend Zellen liefern zu sechs Platten am Tag 5 Gang Samen. Jeder Tag 5 Platte ermöglicht eine anschließende Analyse Zeitpunkt. - Seit OP9 Monoschichten kontinuierlich für die Co-Kulturpassage erforderlich sein, achten Sie darauf, immer maintain einer ausreichenden Anzahl von zusätzlichen OP9 Kulturplatten parallel mit der Co-Kultur.
- Tag 0: Einleitung der Co-Kultur
- Sammeln MESC wie in 2.3.1-2.3.4. Zählen Sie die Zellen.
- Für jeden Klon MESC vorbereiten 5 x 10 4 MESC in 10 ml OP9 Medien pro Platte.
Hinweis: Obwohl wir es nicht verwendet wird, stellen wir fest, dass ein alternatives Medium, das aus α-MEM, 10% FBS und 5 × 10 -5 M β-Mercaptoethanol wurde auch zur Verwendung bei der Differenzierung Co-Kulturen 10 gemeldet. - Entfernen Sie alte Medien aus OP9 Gerichte und fügen Sie die 10 ml MESC Suspension auf die Gerichte kümmern, um die Zellen gleichmäßig über die Platte zu verteilen. Die Schalen werden in der 37 ° C-Inkubator.
- Tag 3: Medienwechsel
- Gerichte zu entfernen aus dem Inkubator und beobachten unter dem Mikroskop. Kolonien sollten anfangen, Glanz verlieren und erscheinen abgeflacht.
- Entfernen Sie das Medium aus Speisen und schonend 10 ml frischem OP9Medien.
- Bringen Sie die Co-Kulturschalen in den Inkubator. Mesoderm-wie Koloniebildung täglich visuell zu überwachen, um den Zeitpunkt der Zuführung OP9 Mono Vorbereitung für den nächsten Durchgang (Tag 5), die nicht bis ~ 80-90% der Kolonien visuell Mesoderm-ähnliche Morphologie Anzeige durchgeführt werden sollte informieren. Maximale Verschiebung des Tag 5 Zelltransfer Schritt 2 Tage.
- Tag 5: Trypsin-vermittelte Durchgang mit Pre-Beschichtung.
HINWEIS: Bereiten Sie im Voraus eine ausreichende Anzahl von 10 cm-Schalen mit optimal zusammenfließenden OP9 Zellen. Fahren Sie mit den nächsten Schritten nur, wenn die Co-Kulturen visuell die in Schritt 3.3.3 beschriebenen Funktionen anzuzeigen (siehe auch Repräsentative Ergebnisse).- Entfernen Sie das Medium aus den Co-Kulturschalen. 4 ml PBS zu waschen. Schwenken Sie die PBS und entfernen. 4 ml 0,25% Trypsin und die Schalen in Inkubator für ~ 5 min.
- Stören die Schicht von Zellen durch Trypsin heftiges Pipettieren, dabei nicht zu hohe Luftblasen einzuführen, bis einehomogenen, überwiegend Einzelzellsuspension erreicht.
- 4 ml komplette OP9 Medien und mischen durch Pipettieren. Transferzellen in eine neue, leere Schüssel 10 cm und in den Brutschrank für 30 Minuten, damit sich die Zellen zu OP9 an der Schale haften. Diese "Pre-plating" Schritt reduziert die Anzahl von Zellen OP9 zum nächsten Schritt der Co-Kultur überführt.
- Bereiten Sie 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 40 um Zellsiebe.
- Sammeln nicht-adhärenten Zellen von der vorgalvanisierten Gericht und leiten sie durch die Zelle Sieb in die Röhre. Vorsichtig waschen die Schale mit 6 ml PBS und geben es durch den gleichen Filter, so dass die Zellen angebracht OP9 hinter sich.
- Zentrifuge Zellen bei 400 x g 5 Minuten bei 4 ° C ist. Überstand entfernen und resuspendieren pelletierten Zellen in 3 ml vollständigem OP9 Medien. Zählen Sie die Zellen.
- Entfernen Sie die Medien aus 10 cm-Platten mit optimal zusammenfließenden OP9 Zellen.
- Für jedes Analysezeitpunkt, Samen 5 x 10 5 Zellen auf dem OP9 monoSchicht in 10 ml Endvolumen.
- Mit 5 ng / ml humanes rekombinantes Flt-3L und die Schalen in Inkubator.
- Tag 8: hämatopoetischen Vorläuferzelle (HPC) Sammlung
HINWEIS: Bereiten Sie im Voraus eine ausreichende Anzahl von 6-Well-Platten mit OP9 oder OP9-DL1 Zellmonoschichten, so dass sie in der ~ 80% konfluent in der Zeit für diesen Schritt.- Bereiten Sie 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 40 um Siebe.
- Entfernen Sie die Gerichte aus dem Inkubator und beobachten unter dem Mikroskop. Shiny Cluster HPC sollte locker an die OP9 Monolage befestigt werden. Sammeln, wie viele dieser Zellen wie möglich durch Waschen (aber nicht übermäßig zu stören) die OP9 Monoschicht mit einer Pipette und die vorhandenen Medien auf dem Teller. Um Schaumbildung zu verhindern, zumindest 1 ml des Mediums in der Spitze der Pipette in dieser Sammlung HPC / Waschschritt immer verlassen.
- Führen Sie die Zellen durch die 40 um Sieb in einem Rohr. 8 ml PBS auf die gleiche Platte und überprüfen unter dem Mikroskop, wenn alle HPC wirwieder gesammelt. Wiederholen des Wasch / Sammelschritt mit PBS und (falls erforderlich) mit kräftiger Waschen. Belastung der Zellen in das Rohr bereits die Zellen von der gleichen Platte enthält.
- Zentrifuge Zellen bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C ist.
- Bereiten Sie ein Master-Mix von 3 ml (pro Platte ausgesät am Tag 5) des OP9 Medien mit 5 ng / ml Flt-3L und 1 ng / ml IL-7.
- Überstand entfernen und Pellet in OP9 Medien mit Flt-3L + IL-7-Master-Mix (3 ml pro 10 cm Schale verarbeitet). Übertragen Sie die gesammelten Zellen von jeder Platte in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit OP9 Zellen.
- Um Zellen zu Monozyten-, B-Zell-Linien fahren oder Erythrozyten-, Saatgut die gesammelten Zellen auf OP9 Zellen. T-Zellen stammen, Saatgut der Zellen auf OP9-DL1 Zellmonoschichten.
- Legen Sie die 6-Well-Platten in Inkubator.
- Tag 10: Medienwechsel
- Bereiten Sie eine 15 ml-Zentrifugenröhrchen für jede einzelne MESC Klon-Feeder-Zelltyp Combination in Co-Kultur.
- Bereiten Sie eine Mischung aus Master OP9 Medien mit 5 ng / ml Flt-3L und 1 ng / ml IL-7. Bereiten Sie 3 ml für jeden gut.
- Sanft sammeln Medien aus jedem Well der 6-Well-Platte kombiniert Medien von mehreren Brunnen die gleiche ESC Klon-Feeder-Zelltyp Kombination enthält.
- 2 ml OP9 Medien Master-Mix (siehe 3.6.2) in jedes Well.
- Zentrifuge die gesammelten Medien bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C ist. Überstand entfernen und jedes Pellet resuspendieren (sehr klein, wenn sichtbar) in 1 ml OP9 Medien Master-Mix (siehe 3.6.2) pro Vertiefung ursprünglich in Schritt 3.6.3 gesammelt.
- Verteilen Sie 1 ml der Zellen wieder in jede Vertiefung, von dem die Medien ursprünglich erhoben bringt die Lautstärke in jedem gut 3 ml. Bringen Sie die Gerichte in den Inkubator.
- Tag 12: Kein Durchgang Trypsin
HINWEIS: Bereiten Sie im Voraus eine ausreichende Anzahl von 6-Well-Platten mit OP9 oder OP9-DL1 Zellen, so dass sie optimal in der Zeit konfluent für dieses s werdenTEP. Tag 12 ist ideal für die Durchflusszytometrie Analysen der Entwicklung von Erythrozyten-, Monozyten-und T-Zellen frühzeitig.- Bereiten Sie ein Master-Mix (3 ml für jede Vertiefung, die in Co-Kultur fortsetzen wird) von OP9 Medien mit 5 ng / ml Flt-3L und 1 ng / ml IL-7.
- Vorbereitung 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit 40 um Siebe (eine für jeden Klon ESC-Feeder-Zelltyp in Kombination Co-Kultur).
- Kräftig pipettieren die vorhandenen Medien in jede Vertiefung, um alle Zellen (einschließlich der Monoschicht) in der gut zu zerlegen. Fahren Sie mit kraftvollen Pipettieren bis ein Zustand ähnlich einer Einzelzellsuspension erreicht.
- Die gesammelten Zellen passieren durch das Sieb in das Rohr. 3 ml PBS in jedes Well zu waschen und zu sammeln alle übrigen Zellen. Pass-Zellen durch die gleiche Sieb. Kombinieren Sie mehrere Zellen aus dem gleichen Brunnen ESC Klon-Feeder-Zelltyp Kombination enthält.
- Entsorgen Sie die Zelle Sieb und entfernen einen aliquoten entspricht einem gut (~ 6 ml) für jede gewünschteDurchflusszytometrie (oder andere) analysiert, um aus an diesem Tag durchgeführt werden. Bewahren Sie diese Aliquots auf Eis vor dem Gebrauch.
- Zentrifuge Zellen bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C ist. Überstand entfernen. Das Pellet aus den 50 ml-Zentrifugenröhrchen in 3 ml pro Vertiefung Master-Mix neu ausgesät werden. 3 ml pro Vertiefung jeder Zellsuspension auf die entsprechende Feeder-Zelltyp und die Schalen in den Brutschrank.
- Tag 14: Medienwechsel
- Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 3.6 skizziert.
- Tag 16: Kein Durchgang Trypsin
HINWEIS: Bereiten Sie im Voraus 6-Well-Schalen optimal zusammenfließenden OP9 oder OP9-DL1 Zellen für diesen Schritt.
HINWEIS: Tag 16 ist ideal für die Durchflusszytometrie-Analysen der B-Lymphozyten und T-Zellen mittlere Stufe.- Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 3.7 skizziert.
- Tag 18: Medienwechsel
- Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 3.6 skizziert.
- Tag 20: Kein Durchgang Trypsin
HINWEIS: Tag 20 is ideal für die Durchflusszytometrie analysiert der Mitte bis späten Stadium der Entwicklung T-Zellen.- Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 3.7 skizziert. Falls gewünscht, tragen differenzierenden Zellen vergangenen Tag 20 Wechselmedienwechsel und kein Trypsin Gänge alle zwei Tage, mit täglichen Überwachung der Lymphozyten-Expansionsrate.
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Representative Results
Wenn auf MEFs in Gegenwart von LIF wachsen kann mESCs in einem undifferenzierten Zustand aufrechterhalten werden. Unter idealen Bedingungen als kompakte Kolonien von Zellen durch ein leuchtender Ring im Phasenkontrast-Mikroskopie umgeben (Abbildung 1) erscheinen sie. Diese Kulturen muss täglich überwacht werden. Je nach dem Zusammenfluss der Zellen, können Medien verändert oder Zellen können geteilt werden. Benachbarte MESC Kolonien nicht bis zur Berührung miteinander kommen. Eine normale, gesunde Kultur undifferenzierter mESCs ist ein wesentlicher Ausgangspunkt für die in-vitro-T-Zell-Differenzierung. Nach Einleitung Co-Kultur, ist es empfehlenswert, dass die Zellen vollständig konfluent, ohne überfüllt. Dies ist so die Mehrzahl der Zellen zur Aussaat von Zellen auf OP9 Monolayer geerntet sind MESC (eher als Feeder-Zellen). Wenn große Unterschiede in der Zusammenfluss sind unter den verschiedenen MESC Klone am Tag 0 unterschieden werden beobachtet, dann wäre es am besten sein, MEFs durch Voraus Einhaltung tis entfernenSue Kulturschalen (wie in Schritt 3.4.3-3.4.6 mit kompletten ES-Zellmedium), bevor das Zählen der mESCs für die Co-Kultur Aussaat.
OP9 Zellen müssen auch vor der Co-Kultur Einleitung gehalten werden (wie in Abschnitt 2.4 beschrieben). Darüber hinaus wird angenommen, dass OP9 Zellen verlieren einige ihrer Eigenschaften mit verlängerter Kultur und / oder ausgeprägte Erhöhung ihrer Proliferationsrate 7 Vermeidung Split-Verhältnisse über 1:. 5 während der Wartung OP9 Zellen, und nach sechs Wochen Verwerfen kontinuierlichen OP9 Kulturen, So vermeiden Sie diese Fallstricke.
Bei der anfänglichen Zellbesiedelung und Zellenübertragungsschritte der Co-Kultur (Tag 0, 5, 8, 12, 16), sollte OP9 Monoschichten in einem optimalen Bereich des Zusammenflusses ist. 2 zeigt die niedrige (2A) und hoher (Abbildung 2B) endet der Bereich von OP9 Zellkonfluenz ratsam für den Einsatz als Co-Kultur-Monoschichten. Ein Beispiel einer Über konfluenten Platte ist in FigUre 2C. Nicht optimale Zusammenfluss aufrechterhalten kann die Bildung von Adipozyten (2D), die in großen Mengen, kann sich negativ auf die Co-Kultur zu induzieren.
Am Tag 0 wird der Co-Kultur auf OP9 Zellen anstelle OP9-DL1 Zellen begonnen, da Mesoderm Bildung auf OP9 Zellen begünstigt. Zellen werden auf OP9-DL1 Zellen-Monoschichten, die am Tag 8 beschichtet, um T-Zell-Produktion zu induzieren. Während einige MESC Klone optisch robust und quantitative (~ 90%) die Bildung von Mesoderm artige Kolonien von Tag 5 der Co-Kultur (3A-B) angezeigt wird, können andere Verzögerungen bei diesem Schritt (3C-F) an. Unter dem Mikroskop werden die Mesoderm-Kolonien wie in diesem Test abgeleitet wurden variabel ähnelt Wagenräder oder Krater (4A) oder Starbursts oder Röschen (4B) beschrieben.
Während die veröffentlichte OP9-DL1 Protokoll spiegelt eine Norm der quantitativen Mesoderm-forma-tion von Tag 5 der Co-Kultur, 7 finden wir, dass nicht alle ESC-Klone zu erreichen, dass die Norm in diesem Zeitrahmen. In diesen Fällen haben wir das Medium am Tag 5 zu ändern und warten weitere 1-2 Tage vor der Durchführung des "Tag 5" Zellernte / Transfer-Protokoll. Das Ziel dieser Verzögerung ist, um visuell zu mesodermalen vor der Übertragung erlauben ~ 80-90% der ES-Zell-Kolonien. Es ist wichtig, deutlich zu machen, dass dieser 80-90% Zahl spiegelt eine streng visuelle Kriterium erkennbar durch einfache Phasenkontrast mikroskopische Untersuchung der Koloniemorphologie in den Co-Kulturschalen. Sie bezieht sich nur auf den Anteil der ESC-Kolonien, die den in 4 gezeigten ähnlich sind. Es ist möglich, dass einige ESC Klone dieser visuellen Kriterium nicht erreicht, selbst nach einer zweitägigen Verzögerung. In einem solchen Fall ist es möglich, für die blutbildenden Vorläufern mesodermalen Durchflusszytometer Zellsortierung für Flk-1 +-Zellen anzureichern, wie es zuvor beschrieben wurde. 6,11 in jedem Fall für das SAke der Nomenklatur Bequemlichkeit, wir "stellen Sie die Uhr" und beziehen sich auf den Tag der Mesoderm-Kolonie wie Transfer als "Tag 5"
Wenn mehrere ESC-Klone, die parallel zu unterscheiden, ist es möglich, dass einige Co-Kulturen wird bereit für den Tag 5 Durchgang auf Zeit zu sein, während andere zurückbleiben. In diesem Fall empfiehlt es sich, den Durchgang von allen Co-Kulturen zu verzögern, bis die langsameren aufholen Klone zu den anderen. Die Verzögerung scheint nicht schaden, um die "auf Zeit" Co-Kulturen zu tun, aber profitiert die nachfolgende Differenzierung der langsameren Klone sehr viel.
Tag 8 (dh drei Tage nach mesodermalen Kolonie Transfer) sieht die Entstehung und Anhäufung von HPC. HPC sind glänzend Cluster von Zellen, die lose an den OP9 Feeder-Zellen (Figur 5) angeklebt sind sichtbar. Eine sorgfältige Waschverfahren, mit einer Pipette und die Medien auf dem Teller, wird zu lösen und sammeln die HPC, währenddie OP9 Mono weitgehend intakt (6A-C). Dies ist vielleicht der Technik empfindlichen Schritt des Protokolls. Es braucht etwas Übung, um die entsprechenden Bewegungen und Medienausstoßdruck zu finden, um das gewünschte Gleichgewicht der maximalen Ernte von HPC mit minimaler Unterbrechung des Feeder-Schicht zu erreichen. Es ist akzeptabel, wenn einige der OP9 Monoschicht abhebt, da die Mehrheit aller Streumonoschicht in der 40 um Nylon-Mesh-fangen werden nach der Filterung. 6D zeigt eine Monoschicht nach über Pipettieren was zu mehr Mono Störung als nötig. Während dieser Waschschritt ist es wichtig, unter dem Mikroskop, ob alle HPC gesammelt worden zu überprüfen, und passen Sie die Waschdruck.
Fortschritt der Co-Kultur kann durch Flusszytometrie überwacht werden. Gezielt analysieren die nicht-hämatopoetischen erythroid Nachkommen des ESC, ist es wichtig, zuerst zu Tor auf Live-CD45 +-Zellen.Dieser Schritt Bildschirme aus den OP9 Zellen aus den Analysen, während die Verwendung von DAPI oder andere Kernfärbung Farbstoff ermöglicht den Ausschluss von nicht lebensfähigen Zellen. Am Tag 12 sollten viele Cluster von kleinen, runden, glänzend Zellen sichtbar sein. Es ist nicht notwendig, um die Zellen in diesem Stadium zu zählen. Wir haben aber beobachtet, dass zu leben, sind gated Durchflusszytometrie Veranstaltung zählt in der Regel im Bereich von 1-3 x 10 5 pro Tag 12 Co-Kultur gut. Durchflusszytometrie-Analysen von Live-gesteuerten Zellen auf der OP9 Monoschicht unterschieden werden erythroiden ergeben (CD45 neg, TER119 +) und monozytären (CD45 +, CD11b hallo) Linien (7A). Analysen von Live-, CD45 +-Zellen differen auf OP9-DL1 Monoschichten sollte Marker charakteristisch für CD4 / CD8 doppelt negativ zu offenbaren (DN) -1 (CD44 +, CD25 neg, neg CD4, CD8 neg) und DN2 (CD44 +, CD25 +, CD4 neg, CD8 neg) Stufe T-Zellen (7B ng>). Nach Tag 16, gibt es eine signifikante Zunahme in der Menge von kleinen, runden, glänzend Zellen in den Kulturen. Auf OP9-DL1s, T-Zell-Differenzierung Produkte Fortschritt auf die DN3 (CD44 neg, CD25 + CD4 neg, CD8 neg) und DN 4 (CD44 neg, CD25 neg, neg CD4, CD8 neg) Stufen. Einige DP (CD4 +, CD8 +) T-Zellen können auch beginnen Schwellen Tag 16 (7B). HPC ausgesät auf OP9 Zellen ergeben B-Zellen (CD19 +) bei Tag 16. Am Tag 20 der OP9-DL1-MESC Co-Kultur, wird es große Mengen von DP T-Zellen und einzelne positive (SP) CD8 + T-Zellen vorhanden (sein 7B). Abbildung 8 zeigt ein Diagramm mit einer Zusammenfassung der wichtigsten Schritte der oben genannten Verfahren, und die vorgeschlagenen Analysezeitpunkten während der Co-Kultur.
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Abbildung 1. Phasenkontrastmikroskopie Bild von undifferenzierten mESCs (scharfkantige Kolonien) wächst auf einem MEF Monoschicht (100-facher Vergrößerung).
Abbildung 2:. Phasenkontrast-Mikroskopie-Aufnahmen von Mono OP9 Konfluenz (A) Niedrigster und (B) höchsten Ebenen Konfluenz ratsam für Co-Kultur-Passage / Aussaat (40-facher Vergrößerung) (C) Beispiel eines über konfluenten OP9 Monoschicht (40-facher Vergrößerung. ). (D) Über konfluenten OP9 Monoschicht (200-facher Vergrößerung) mit Adipozyten-Bildung (groß, Vesikel enthalten, Zellen).
Abbildung 3: Phasenkontrastmikroskopy Bilder von Mesoderm-wie Koloniebildung bei "Tag 5" der Co-Kultur. (A) 40x und (B) 100 x Ansichten von Co-Kulturplatten mit> 90% mesodermalen Differenzierung Kolonie. Diese Platten sind bereit für Tag 5 Gang. (CF) Beispiele für Tag 5 Co-Kultur-Platten, die 1-2 Tage Aufschub vor der Übertragung (C & E, 40-facher Vergrößerung, D & F, 100-facher Vergrößerung) erfordern.
Abbildung 4: Phasenkontrast-Mikroskopie-Aufnahmen von der Vielfalt der Mesoderm-Kolonie wie Formationen am Tag 5 der Co-Kultur (A) Die Koloniemorphologie als "Krater" bezeichnet oder (B) Die Kolonie Morphologie bezeichnet wird. "Wagon Wheel". als "Starburst" oder "Blümchen" (200-facher Vergrößerung).
Abbildung 5. Phasenkontrastmikroskopie Bild von Tag 8 Co-Kulturplatte mit Trauben von kleinen, runden, glänzend HPC auf einem OP9 Monoschicht (40-facher Vergrößerung).
Abbildung 6:.. OP9 Monolage nach HPC-Sammlung auf Co-Kultur-Tag 8 (AC) entsprechenden Bereich von Störungen des OP9 Monolage nach sorgfältigem Waschen zu ernten HPC (D) Ein Beispiel für eine Monolage, die OP9 gewesen ist von Tag zu Tag über gestört 8 HPC Ernteverfahren.
Abbildung 7: Repräsentative Durchflusszytometrie (FACS) analysiert zu bestimmten Zeitpunkten während derMESC Differenzierung in vitro. (A) Färbung auf erythroiden (links), monozytären (Mitte) und B-Zellen (rechts) Produkte MESC-OP9 Co-Kultur am Tag 12 bzw. 16, wie angegeben. (B) Färbung zu entwickeln T-Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten MESC-OP9-DL1 Co-Kultur. Bitte siehe Text detaillierte Beschreibungen der Immunphänotypen.
Figur 8. Schematische Darstellung der Schritte des MESC-OP9 Co-Kulturverfahren. (A) die Schlüssel-Zellenübertragungsschritte der ersten acht Tagen der Co-Kultur. Die ungefähre Anzahl der Zellen auf OP9 Zellen beimpft an den Tagen Null und fünf sind angegeben. (B) Am Tag 8 Übertragungsschritt und der erwarteten Zelldifferenzierung Produkte durch Durchflusszytometrie an wichtigen Zeitpunkten der Co-Kultur nachgewiesen. Bitte siehe Text detaillierte Beschreibungen der Immunphänotypen.
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Discussion
Die OP9-DL1 Co-Kultursystem wurde verwendet, um die Rolle der verschiedenen Genprodukte bei der Entwicklung von Blutzelltypen aus Stammzellen zu untersuchen. 8,12,13 Es wurde auch ein effektives Modell, um die Funktion des Gens regulatorischen DNA zu untersuchen erwiesen während der zellulären Differenzierung. 9,14 Mit diesem Ansatz als Alternative zum gesamten Mausmodelle können erhebliche Einsparungen an Zeit und Kosten für die Experimente, die viele grundlegende Fragen der Hämatopoese-Adresse zu erhalten. , Anpassung des Protokolls für diese Zwecke erfordert jedoch Kenntnis von der potentiellen Variabilität unter MESC Klone, die in diesen Verfahren verwendet werden würde. Die Zeitleiste der veröffentlichten Protokoll ist zu erwarten von der durchschnittlichen, 7 Neben gut gepflegt, nicht manipulierten MESC Linie., MESC Klone für die Erzeugung von chimären Mäusen ausgewählt sind in der Regel von höherer Qualität und sehr robust in OP9 Co-Kultur durchführen . Auf der anderen Seite, MESC Klone Schwellen direkt von stabilTransfektion mit einem ektopisch integrierte Transgen unterschiedlichem Grad der Differenzierung anfänglichen Wirkungsgrad von durchschnittlich bis unterdurchschnittlich an. Das hier beschriebene Protokoll sieht eine strategische 1-2 Tag Verzögerung des Tages 5 Gang Schritt zum Ausgleich von Potentialdifferenzen diese vor der Induktion der Blutbildung in vitro.
Der Tag 8 Durchgang ist der Schritt, bei dem die Ausführung dieses Protokoll hat das größte Potenzial für Fehler. Geduld, Übung und sorgfältige Beobachtung wird man ermöglichen, die Technik, die HPC Ernte optimiert und minimiert OP9 Mono Störung zu entwickeln. Über die Taste Tag 5 und Tag 8 Stufen, beinhalten die kritischen Parameter sorgfältige Wartung Zellkultur (insbesondere OP9 Zellen, wie oben beschrieben) und besonderes Augenmerk auf die im Protokoll verwendeten Reagenzien. Der kritischste Reagens der FBS. Deutliche viele FBS wird deutlich in ihrer Fähigkeit, dieses Verfahren unterstützen variieren. Mehrere Lose muss in o getestet werdenrder zu bestimmen, welche robust Differenzierung in diesem Test ergeben wird.
Diese Co-Kultursystem hat seine Grenzen. Zum Beispiel ist dieses Modell nicht unterstützt die Differenzierung der einzelnen positiven CD4-Zellen. Ein Grund dafür ist das Fehlen der Expression des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) Klasse-II-Antigen-Präsentation Infrastruktur in den OP9 Zellen. 1 Zelloberflächenpräsentation des Antigens durch MHC-Klasse II für die richtige Entwicklung der CD4 SP-Zellen erforderlich. Die CD8-Zellen, die entstehen SP tun stellen eine Mischung aus reifen und unreifen CD8 SP Thymozyten Stufen. 1 Darüber hinaus erfolgreiche Transplantation von MESC abgeleitet T-Zell-Vorläuferzellen in eine Maus bedarf der vorherigen Durchgang durch fetalen Thymus Organkultur. 1 Dennoch ist diese Technologie hat sich seine versprechen als eine mächtige Ermittlungsansatz beiden zellulären und molekularen Fragen im Blut und die Entwicklung des Immunsystems, die bisher nur möglich, in v erkunden warenivo. So, abgesehen von, einen neuen Weg, um raschere Fortschritte in diesen Fragen, breitere Annahme des OP9-ESC-Co-Kultursystem die weiteren Auswirkungen der Reduzierung der Verwendung von Versuchstieren haben zu machen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Stem cell qualified FBS | Gemini | 100-125 | Heat inactivated |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| L-alanyl L-glutamine | Corning | 25-015-CI | |
| HEPES buffer | Millipore | TMS-003-C | |
| Non-Essential Amino Acids | ThermoScientific | SH30853.01 | |
| Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml) | Life Technologies | 15750-060 | |
| β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS | Life Technologies | 21985-023 | |
| Filter Unit | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm PES membrane |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CM | |
| α-MEM | Life Technologies | 12000-022 | Powder, reconstitute per manufacture recommendation |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| FBS | ThermoScientific | SH 30396.03 | Testing of individual lots required |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma | D2650 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand | R&D Systems | 308-FK | |
| Recombinant Murine IL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| Utrapure water with 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| MEFs mitomycin C treated | Millipore | PMEF-CF | Any mitotically arresteded MEFs can be used |
| DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| Cell strainer (40 μm) | Fisher | 22363547 | |
| Tissue culture dish 100 x 20 mm | BD Falcon | 353003 | |
| Multiwell 6-well | BD Falcon | 353046 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | Tubes for FACS |
| ES R1 cells | ATCC | SCRC-1011 | |
| OP9 cells | Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan). | ||
| OP9-DL1 cells | Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory. | ||
| FlowJo software | Tree Star | FACS data analyses | |
| Flow Cytometer | BD | FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab |
References
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