Protocol
.1 הכנת תרבות מדיה, ציטוקינים וצלחות gelatinized
- הכן תקשורת בתאי גזע עובריים באמצעות השינוי של Dulbecco של בינוני של הנשר (DMEM) עם גלוקוז גבוה ופירובט נתרן. להוסיף ESC 20% מוסמכים בסרום שור העוברי (FBS), 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 1% L-גלוטמין, 1% HEPES הצפת, 1% שאינם חיוניות חומצות אמינו, 0.1% גנטמיצין (50 מ"ג / מ"ל) ו0.1% ( 55 מיקרומטר) β-mercaptoethanol. לעקר תקשורת בתאי גזע עובריים על ידי סינון.
- הכן תקשורת OP9 על ידי הפיכת 1 ליטר של אלפא בינוני מינימום הכרחי (α-MEM) מאבקה על פי הוראות היצרן. הוסף 20% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין. הפוך לערבב. לעקר על ידי סינון לשני 500 aliquots מ"ל.
הערה: השימוש במדיה עשויים מאבקה מומלצת וצפוי להניב תחזוקת תא OP9 משופרת ובתוצאות בידול מבחנה. גישה זו הפכה ההליך הרגיל שלנו. עם זאת, אנחנו גם לציין that יש לנו בזמנים המשמשים נוזל שהוכן מראש, α-ממ עם הצלחה מספקת. - הכן הקפאת תקשורת על ידי הוספת 10% דימתיל sulfoxide (DMSO) ל90% FBS. מערבולת בעדינות ולעקר על ידי סינון. חנות ב 4 ° C..
- הכן 2,000x יגנד Flt-3 (10 מיקרוגרם / מ"ל) על ידי המסת Flt-3 יגנד רקומביננטי האנושי (Flt-3L) בתקשורת OP9 מלאה ל10 מיקרוגרם / מ"ל. Aliquot לתוך צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. עקוב אחר ההמלצות של הספק בנוגע ליציבות ואחסון.
הערה: היציבות של Flt-3L היא קצרה (1 חודש על 4 מעלות צלזיוס או 3 חודשים ב -80 מעלות צלזיוס). - הכן 1,000x IL-7 (1 מיקרוגרם / מ"ל) על ידי שימוש בתקשורת OP9 מלאה. Aliquot לתוך צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. עקבו אחר המלצותיו של הספק על יציבות ואחסון (IL-7 הוא יציב עד 12 חודשים ב -80 מעלות צלזיוס).
- הכן 1,000x לוקמיה מעכב פקטור (LIF) (10 מיקרוגרם / מ"ל) על ידי דילול 1:10 10 7 יחידות של i LIFn תקשורת בתאי גזע עובריים. aliquot החנות ב 4 ° C.. הקפד לשים לב לתאריך התפוגה הניתן על ידי היצרן בבקבוקוני aliquot.
הערה: המוצר הוא יציב בצורה 18 חודשים לפחות מרוכזים או מדוללים ממועד הייצור. - הכן 6 גם צלחות gelatinized ידי להוסיף 1.5 פתרון ג'לטין מ"ל של 0.1% לבאר כל צלחת 6 היטב. משאיר את הכלים בשכונה סטרילי בטמפרטורת חדר עם מכסים על, המאפשר לפחות 30 דקות לציפוי. המנות גם ניתן להשאיר בלילה חממת humidified. הסר את כל פתרון ג'לטין שאריות ממש לפני זריעת תאים. אל תתנו פתרון ג'לטין להתייבש לחלוטין בבאר.
2 הכנה ותחזוקה של תאים מזין ותאי עכבר גזע עובריים (המסקלין)
הערה: דגירה כל התאים ב37 מעלות צלזיוס חממת humidified עם 5% CO 2.
- הפשרת Fibroblasts העכבר עוברי (MEF)
- Quick-להפשיר בקבוקון קפוא (~ 5 x 10 6
- הוסף 8 מ"ל של תקשורת בתאי גזע עובריים לתאים המופשרים, בצורה טיפה חכמה כדי לדלל בהדרגה את DMSO ממדיום ההקפאה.
- תאי צנטריפוגה ב400 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מוציאים בזהירות את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 3 מ"ל של תקשורת בתאי גזע עובריים.
- הכן צינור צנטריפוגה 50 מ"ל עם 33 מ"ל של תקשורת בתאי גזע עובריים מראש חימם. מוסיף את 3 מ"ל של MEFs המושעה להביא את הנפח הסופי 36 מ"ל.
- הפץ 3 מ"ל של MEFs המושעה לכל טוב משני לוחות gelatinized 6 היטב. מקם את הצלחות לאינקובטור במשך לפחות שש שעות על מנת לאפשר לתאים לצרף ונפרשו לפני זריעת mESCs עליהם. שכבות מזין נעצרו mitotically אלה עשויות להיות שמישים במשך כמה ימים לאחר זריעה ראשונית, אם אמצעי התקשורת שלהם משתנה כל 2-3 ימים.
הערה: יכול לשמש גם MEFs נעצר טרי. </ Ol>
- mESCs זריעה
- Quick-להפשיר בקבוקון עם שיבוט המסקלין קפוא באמבט המים 37 מעלות צלזיוס ולהכין תאים כפי שמתואר ב2.1.1-2.1.3.
הערה: אנו להקפיא 2 בקבוקונים של המסקלין מבאר ומחוברות של צלחת 6 היטב. - הסר את המדיה מהיטב אחד (מחיר לשיבוט המסקלין) של הצלחת 6 היטב עם monolayers MEF נעצר (מוכן בשלב 2.1.5) וזרעי 3 מ"ל של mESCs על גבי monolayer MEF. הוסף 3 μl של 1,000x LIF (מ"ל / 10 ng). חזור מנות לתוך החממה.
- Quick-להפשיר בקבוקון עם שיבוט המסקלין קפוא באמבט המים 37 מעלות צלזיוס ולהכין תאים כפי שמתואר ב2.1.1-2.1.3.
- תחזוקת תאי גזע עובריים והמעבר טריפסין תיווך
הערה: המדיה שינוי יומי, או פיצול המבוסס על מפגש של המסקלין. בצורה אופטימלית, קציר ופיצול / מחדש צלחת תאים בכל יום אחר.- הסר את המדיה בתאי גזע עובריים ולשטוף mESCs עם 2 מ"ל של PBS. הסר PBS. הוסף 1 מ"ל של טריפסין 0.25% ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות.
- איסוף תאי trypsinized ולהעביר אותם לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. במרץ pipet ההשעיה התא לפרק את הגושים של mESCs. הוסף 2 מ"ל של תקשורת בתאי גזע עובריים מלאה להשעית התא על מנת לנטרל את טריפסין.
- תאי ספין בx גרם 400 למשך 5 דקות ב 4 ° C.. הסר supernatant וresuspend גלולה ב 3 מ"ל תקשורת בתאי גזע עובריים.
- הסר את המדיה מ6 צלחות המכילות גם הכין monolayers MEF נעצר. להוסיף את הכמות המתאימה של ההשעיה התא (המבוססת על יחס הפיצול הרצוי) ב 3 מ"ל של תקשורת בתאי גזע עובריים לכל טוב שזרע. הוסף 3 μl של LIF 1,000x. מחוברות המסקלין לפצל גם 1: 6 תהיה מוכן למעבר ב2 ימים.
- OP9 / תחזוקת תא OP9-DL1
- להפשיר בקבוקון של תאי OP9 (בצע את השלבים 2.1.1-2.1.3 באמצעות מדיה OP9)
- הוסף מדיה OP9 7 מ"ל לצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטר. מוסיף את 3 מ"ל של תאי resuspended באופן טיפה חכמה, הפצת תאים בכל הצלחת. מניחים את תאי לילה בחממה.
- בדוק את נקודת המפגש של תאי OP9 למחרת. אם המנה מכילה הרבה תאים צפים מתים, רמוve התקשורת ולהוסיף 10 מ"ל של תקשורת OP9 הטרי. להחזיר את הצלחת לחממה אם מפגש כמעט מלא לא נצפה. פיצול (באמצעות טריפסין) 1: 4 monolayer OP9 המחוברות הקרוב.
הערה: צלחות צריכה להגיע באותה רמת מפגש שוב בכ -2 ימים. יש להיזהר שלא לתת לתאי OP9 להיות מעל ומחוברות. - להקפיא את הקטעים המוקדמים של תאי OP9 כמניות הרחבה.
הערה: אנו להקפיא 2 בקבוקונים של תאי OP9 מאחד ליד מחוברות 10 צלחת סנטימטר. כל בקבוקון של מניית הרחבה יכול להיות מופץ נוסף כדי ליצור מניות עבודה שמאוחר יותר השתמשו בניסויי שיתוף תרבות המסקלין. שמור את כל מניות OP9 קפואות בחנקן נוזלי ולא ב-80 ° C המקפיא, מאז טמפרטורות משתנים באופן שלילי יכולות להשפיע על האיכות של קופא.
.3 נוהל משותף תרבות OP9-DL1
- הכנות משותפת התרבות
- כשבוע לפני תחילת שיתוף תרבות, להפשיר MEFs, mESCs ואבני תא OP9 עובדיםcks. מאחר ותאי OP9-DL1 אין צורך עד שיום התרבות משותפת 8, להפשיר את תאי OP9-DL1 במהלך שלושת הימים הראשונים לאחר תחילת שיתוף התרבות. לשמור או להקפיא את כל התאים בהתאם לצורך.
- לקבוע את המספר הראשוני של 10 צלחות סנטימטר עם monolayers תא OP9 מוכן להגיע 80 מפגש% על שיתוף תרבות יום 0 מבוססים על הסולם של הניסוי (למשל, מספר השיבוטים המסקלין להיות מובחן ומספר נקודות זמן שיתוף תרבות ל להיות מנותח). כדי להתכונן לשיתוף תרבות, לפצל ליד צלחת ומחוברות של OP9 תאים בין 1: 4 ו 1: 6 יומיים לפני כאשר יהיה צורך monolayers.
הערה: אחת יצטרך צלחת אחת לפחות לשיבוט ESC. בדרך כלל, שיבוט ESC יחיד זורעים על צלחת אחת (כמפורט להלן) ביום 0 אמורים להניב מספיק תאי זרע שש צלחות במעבר יום 5. כל צלחת יום 5 תאפשר נקודת זמן ניתוח שלאחר מכן אחד. - מאז monolayers OP9 יהיה צורך ללא הרף למעבר שיתוף התרבות, דואג לתמיד maintaבמספר מספק של צלחות תרבות OP9 נוספות במקביל לתרבות המשותפת.
- יום 0: ייזום של תרבות המשותפת
- לאסוף המסקלין כמו ב2.3.1-2.3.4. ספירת התאים.
- לכל שיבוט המסקלין להכין 5 x 10 4 המסקלין ב10 מ"ל של תקשורת OP9 לכל צלחת.
הערה: למרות שאנו לא השתמשנו בו, נציין, כי מדיום אלטרנטיבי בהיקף של α-MEM, 10% FBS, ו5 x 10 -5 M β-mercaptoethanol דווח גם לשימוש בשיתוף תרבויות בידול 10. - הסר את המדיה ישנה מOP9 מנות ולהוסיף 10 מ"ל של ההשעיה המסקלין את הכלים לטפל כדי להפיץ את התאים באופן שווה בכל הצלחת. מניחים את הכלים ב37 מעלות צלזיוס החממה.
- יום 3: שינוי מדיה
- הסר מנות מהחממה ולבחון תחת מיקרוסקופ. מושבות צריכה להתחיל לאבד זוהר ונראה שטוח.
- הסר את המדיה ממנות ובעדינות להוסיף 10 מ"ל של OP9 הטריתקשורת.
- להחזיר את מנות שיתוף התרבות לחממה. מבחינה ויזואלית לעקוב אחר הקמת מושבה כמו המזודרם ביום ליידע את העיתוי של הכנת monolayer מזין OP9 למעבר הבא (יום 5), שלא צריכה להתבצע עד ~ 80-90% מהמושבות חזותי להציג מורפולוגיה כמו המזודרם-. דחייה המרבית של צעד העברת תא יום 5 היא 2 ימים.
- יום 5: מעבר בתיווך טריפסין עם טרום ציפוי.
הערה: הכן מראש מספר מספיק של 10 מנות סנטימטר עם תאי OP9 בצורה אופטימלית ומחוברות. המשך בביצוע השלבים הבאים רק אם שיתוף התרבויות חזותית להציג את התכונות מתוארות בשלב 3.3.3 (ראה תוצאות גם נציג).- הסר את המדיה ממנות התרבות המשותפת. הוסף 4 מ"ל PBS לשטוף. לערבל את PBS ולהסיר. הוסף 4 מ"ל של 0.25 טריפסין% ומקום הכלים בחממה ל~ 5 דקות.
- לשבש את השכבה של תאי trypsinized ידי pipetting הנמרץ, נזהר שלא להכניס בועות אוויר חריגות, עד שהשעיה הומוגנית, בעיקר תא בודד מושגת.
- הוסף 4 מ"ל של תקשורת OP9 המלאה ומערבבים על ידי pipetting. העברת תאים לתוך צלחת חדשה, ריקה 10 סנטימטר ומקום בחממה במשך 30 דקות, כדי לאפשר לתאי OP9 לדבוק בצלחת. זה צעד "טרום ציפוי" מפחית את מספר התאים OP9 הועברו לצעד הבא של התרבות המשותפת.
- הכן 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה עם מסננות תא 40 מיקרומטר.
- איסוף תאים שאינם חסיד מהצלחת מצופה מראש ולהעביר אותם דרך מסננת התא לתוך הצינור. שטוף את הצלחת בעדינות עם 6 מ"ל של PBS ולהעביר אותו דרך אותו המסננת, ומשאיר את תאי OP9 המצורפים מאחורי.
- תאי צנטריפוגה בדקות 5 גרם 400 x ב 4 ° C.. הסר supernatant ו resuspend תאי pelleted ב3 מ"ל של תקשורת OP9 המלאה. ספירת התאים.
- הסר את המדיה מ10 צלחות סנטימטר עם תאי OP9 בצורה אופטימלית ומחוברות.
- עבור כל נקודת זמן ניתוח, זרע 5 x 10 5 תאים במונו OP9שכבה ב10 נפח סופי מ"ל.
- הוסף 5 ng / Flt-3L רקומביננטי האנושי מ"ל ולמקם את הכלים בחממה.
- אוסף נייד אבות היווצרות דם (HPC): יום 8
הערה: הכן מראש מספר מספיק של 6 צלחות גם עם monolayers OP9 או OP9-DL1 תא, כך שהם יהיו ~ 80% ומחוברות בזמן לצעד זה.- הכן 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה עם 40 מיקרומטר מסננות.
- הסר את המנות מהחממה ולבחון תחת מיקרוסקופ. אשכולות מבריקים של HPCs צריכים להיות מחוברים באופן רופף לmonolayer OP9. לאסוף כמה שיותר תאים אלה ככל האפשר על ידי שטיפה (אך לא יתר על מידת שיבוש) monolayer OP9 עם טפטפת והמדיה הקיימת בצלחת. כדי למנוע הקצפה, תמיד להשאיר לפחות 1 מ"ל של התקשורת בקצה pipet במהלך איסוף HPC / צעד זה כביסה.
- להעביר את התאים דרך מסננת 40 מיקרומטר לתוך צינור. הוסף 8 מ"ל PBS לאותה הצלחת ולבדוק תחת מיקרוסקופ אם כל HPCsמחדש שנאסף. חזור על שלב כביסה / אוסף עם PBS ו( במידת צורך) עם כביסה תקיפה יותר. מסננים את התאים לתוך הצינור כבר מכיל את התאים מאותה הצלחת.
- תאי צנטריפוגה ב g x 400 למשך 5 דקות ב 4 ° C..
- הכן תערובת הורים של 3 מ"ל (לכל צלחת נזרעה ביום 5) של תקשורת OP9 עם 5 ng / ml Flt-3L ו1 ננוגרם / מ"ל IL-7.
- הסר supernatant וגלול גלולים בתקשורת OP9 עם Flt-3L תמהיל הורים + IL-7 (3 מ"ל לכל מנה 10 סנטימטר מעובד). להעביר את התאים שנאספו מכל צלחת ולאחת מצלחת 6 היטב עם תאי OP9.
- על מנת לנהוג תאים כלפי monocytic, תא B או שושלות erythroid, זרע התאים שנאספו על תאי OP9. לגזור תאי T, זרע התאים על גבי monolayers תא OP9-DL1.
- מניחים את 6 גם הצלחות לאינקובטור.
- יום 10: שינוי מדיה
- הכן צינור צנטריפוגות 15 מ"ל לכל קומבינה המסקלין ברורה שיבוט-מזין סוג התאtion בשיתוף התרבות.
- הכן תערובת הורים של תקשורת OP9 עם 5 / מ"ל ng של Flt-3L ו1 / מ"ל ng של IL-7. הכן 3 מ"ל לכל טוב.
- בעדינות לאסוף מדיה מכל טוב של הצלחת 6 היטב שילוב מדיה מבארות מרובות המכילות את אותו שילוב סוג תא שיבוט-מזין ESC.
- הוסף 2 מ"ל של תערובת אב תקשורת OP9 (ראה 3.6.2) לתוך כל אחד.
- צנטריפוגה התקשורת שנאסף בx גרם 400 למשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. הסר supernatant ו resuspend כל גלולה (קטנה מאוד, אם גלוי) ב 1 מ"ל של תערובת אב תקשורת OP9 (ראה 3.6.2) לכל טוב שנאסף במקור בשלב 3.6.3.
- הפץ 1 מ"ל של תאים בחזרה לכל באר שממנה מדיה נאספה במקור מביאה את עוצמת הקול בכל טוב ל3 מ"ל. להחזיר את המנות לחממה.
- יום 12: אין מעבר טריפסין
הערה: הכן מראש מספר מספק של מנות 6 גם עם תאי OP9 או OP9-DL1, כך שהם יהיו מחוברים בצורה אופטימלית בזמן לזה זהTEP. יום 12 הוא אידיאלי עבור cytometry זרימת ניתוחים של erythroid פיתוח, monocytic, ותאי T שלב מוקדם.- להכין תערובת שני (3 מ"ל לכל טוב שימשיך בשיתוף התרבות) של תקשורת OP9 עם 5 / מ"ל ng של Flt-3L ו1 / מ"ל ng של IL-7.
- הכן 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה עם 40 מיקרומטר מסננות (אחד לכל צירוף סוג תא שיבוט-מזין ESC בשיתוף התרבות).
- במרץ פיפטה המדיה הקיימת בכל אחד גם לdisaggregate כל התאים (כולל monolayer) בבאר. המשך עם pipetting הכוחני עד מדינה שמזכירה השעיה תא בודדת מושגת.
- להעביר את התאים שנאספו דרך המסננת לתוך הצינור. הוסף 3 מ"ל של PBS לתוך זה גם לשטוף ולאסוף את כל התאים הנותרים. עובר תאים דרך אותה המסננת. שלב את התאים מבארות מרובות המכילות את אותו שילוב סוג תא שיבוט-מזין ESC.
- מחק את מסננת התא משמשת ולהסיר שווה ערך aliquot לטוב אחד (~ 6 מ"ל) לכל רצויcytometry זרימה (או אחרים) מנתחת להתבצע באותו יום. אחסן aliquots אלה על קרח לפני השימוש.
- תאי צנטריפוגה ב g x 400 למשך 5 דקות ב 4 ° C.. הסר supernatant. Resuspend גלולה מ50 צינורות מ"ל צנטריפוגות ב3 מ"ל של תערובת אב לכל גם להיות מחדש זרע. הוסף 3 מ"ל לכל טוב של כל השעיה תא לסוג תא המזין המתאים ולמקם את הכלים בחממה.
- יום 14: שינוי מדיה
- בצע את הצעדים המפורטים בסעיף 3.6.
- יום 16: אין מעבר טריפסין
הערה: הכן מראש מנות 6 גם של תאי OP9 או OP9-DL1 בצורה אופטימלית ומחוברות לצעד זה.
הערה: יום 16 הוא אידיאלי עבור cytometry זרימת הניתוחים של לימפוציטים מסוג B ותאי T שלב אמצע.- בצע את הצעדים המפורטים בסעיף 3.7.
- יום 18: שינוי מדיה
- בצע את הצעדים המפורטים בסעיף 3.6.
- יום 20: אין מעבר טריפסין
הערה: יום 20 iאידיאלי עבור cytometry זרימת ניתוחים של האמצע עד השלב מאוחר בפיתוח תאי T.- בצע את הצעדים המפורטים בסעיף 3.7. אם ארצה בכך, לשאת הבחנה תאי תקשורת לשנות לסירוגין עבר יום 20 ולא טריפסין מעברים בכל יומיים, עם ניטור יומיומי של קצב התפשטות הלימפוציטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאשר גדל על MEFs בנוכחות LIF, יכול להישמר mESCs במדינה שלא עברה התמיינות. בתנאים אידיאליים, הם מופיעים כמושבות קומפקטיות של תאים מוקפים בהילה נוצצת במיקרוסקופ לעומת שלב (איור 1). תרבויות אלה חייבים להיות במעקב יומי. בהתאם לנקודת המפגש של התאים, ניתן לשנות תקשורת או ניתן לפצל תאים. מושבות המסקלין שכנים לא צריכה להגיע לנקודת מגע זו עם זו. תרבות נורמלית, בריאה של mESCs מובחן היא נקודת התחלה חיונית במבחנת התמיינות תאי T. על ייזום שיתוף התרבות, מומלץ שהתאים להיות מחוברות באופן מלא מבלי להיות צפוף. זה כל כך את רוב התאים שנקטפו לזריעת תאים על גבי monolayers OP9 הם המסקלין (ולא תאים מזינים). אם הבדלים גדולים במפגש הם נצפו בין השיבוטים המסקלין השונים לבידול ביום 0, אז זה יהיה הטוב ביותר להסיר MEFs ידי מראש דבקות tisמנות תרבות לתבוע (כמו בשלב 3.4.3-3.4.6 באמצעות תקשורת בתאי גזע עובריים מלאה) לפני ספירת mESCs לזריעת שיתוף התרבות.
תאי OP9 יש לשמור היטב לפני תחילת שיתוף התרבות (כפי שתואר בסעיף 2.4). בנוסף, הוא חשב שזה שOP9 תאים מאבדים עם תרבות ממושכת ו / או עליות בולטות בקצב ההתפשטות שלהם חלק מהנכסים שלהם 7 הימנעות יחסי פיצול מעבר 1:. 5 במהלך התחזוקה של OP9 תאים, ושלכת תרבויות OP9 רציפות לאחר שישה שבועות, יעזור להימנע ממלכודות אלה.
בצעדי זריעת תאים והעברת תא ראשוניים של התרבות המשותפת (היום 0, 5, 8, 12, 16), monolayers OP9 צריך להיות בתוך טווח אופטימלי של מפגש. איור 2 מראה (איור 2 א) הנמוך וגבוה (איור 2B) מסתיים בטווח של מפגש תא OP9 מומלץ לשימוש כmonolayers שיתוף התרבות. דוגמא של צלחת מעל ומחוברות מוצגת באיור2C יור. כישלון לשמור על מפגש אופטימלי עשוי לגרום להיווצרות של תאי שומן (איור 2 ד) כי, בכמויות גדולות, עלול להשפיע לרעה על התרבות המשותפת.
ביום 0, התרבות המשותפת הוא התחילה בOP9 תאים ולא OP9-DL1 תאים מאז היווצרות המזודרם היא מועדף על OP9 תאים. תאים מצופה בOP9-DL1 monolayers תאים המתחיל ביום 8 כדי לגרום לייצור תאי T. בעוד כמה שיבוטים המסקלין יהיו חזותי להציג היווצרות חזקה וכמותי (~ 90%) של מושבות כמו המזודרם-ליום 5 של תרבות המשותפת (איור 3A-B), אחרים יכולים להציג עיכובים בשלב זה (איור 3 ג-F). מתחת למיקרוסקופ, המושבות כמו המזודרם שמקורם בassay זה תוארו variably כדומה גלגלי עגלה או מכתשים (איור 4 א) או, מטר כוכבים או פרחים (איור 4).
בעוד פרוטוקול OP9-DL1 פורסם משקף נורמה של פורם המזודרם כמותייםtion על ידי יום 5 של התרבות המשותפת, 7 אנו מוצאים כי לא כל השיבוטים ESC להשיג נורמה שבתוך מסגרת זמן זו. במקרים אלה, אנו משנים בינוניים ביום 5 ולחכות 1-2 ימים נוספים לפני ביצוע "יום 5" קציר התא / פרוטוקול העברה. המטרה של עיכוב זה היא לאפשר ~ 80-90% ממושבות בתאי גזע עובריים לmesodermal הפך חזותי לפני ההעברה. חשוב להבהיר כי דמות 80-90% זה משקפת להבחין קריטריון חזותי בקפדנות על ידי בדיקה פשוטה בניגוד השלב מיקרוסקופית של מורפולוגיה מושבה במנות התרבות המשותפת. זה מתייחס רק לחלקן של מושבות ESC דומות לאלו שמוצגים באיור 4. יתכן שחלק משיבוטי ESC לא יגיעו קריטריון חזותי זו, גם לאחר עיכוב של יומיים. במקרה כזה, ניתן להעשיר למבשרי mesodermal דם להרכיב באמצעות cytometry זרימת תא המיון לflk-1 + תאים, כפי שתוארו קודם לכן. 6,11 בכל מקרה, לsake נוחות מינוח, אנחנו "לאפס את השעון" ומתייחסים ליום העברת מושבה כמו המזודרם-כמו "יום .5"
כאשר השיבוטים ESC מרובים שמתבצע מובחנים במקביל, זה אפשרי, כי שיתוף תרבויות מסוימות תהיה מוכנות למעבר ביום 5 בזמן, בעוד שאחרים משתרכים מאחור. במקרה זה, מומלץ לדחות את המעבר של כל שיתוף התרבויות עד השיבוטים איטיים יותר להדביק אחרים. נראה העיכוב לא לעשות שום נזק ל" בזמן "שיתוף התרבויות, אבל יתרונות הבידול הבא של השיבוטים איטיים הרבה.
יום 8 (כלומר, שלושה ימים לאחר העברת המושבה mesodermal) רואה את ההופעה והצטברות של HPCs. HPCs נראה כמו אשכולות מבריקים של תאים שהם דבקו התאים מזינים OP9 (איור 5) באופן רופף. הליך כביסה זהיר, באמצעות פיפטה והתקשורת על הצלחת, תנתק ולאסוף HPCs תוך השארה(6A-C איור) monolayer OP9 בעיקר ללא פגע. זה אולי צעד הטכניקה רגישה ביותר של הפרוטוקול. זה לוקח חלק באימון כדי למצוא את התנועות המתאימות ובלחץ פליטת תקשורת כדי להשיג את האיזון הרצוי של קציר המקסימאלי של HPCs, עם הפרעה מינימאלית של שכבת המזין. זה מקובל, אם חלק מmonolayer OP9 מרים את, שכן הרוב של כל monolayer התועה יהיה שנתפס ברשת ניילון 40 מיקרומטר לאחר סינון. איור 6 ד תערוכות monolayer לאחר pipetting המופרז שמוביל לשיבוש monolayer גדול יותר ממה שצריך. במהלך שלב זה כביסה, זה חשוב לבדוק תחת מיקרוסקופ או אם לא כל HPCs כבר נאסף, ולהתאים את לחץ הכביסה בהתאם.
התקדמות של שיתוף התרבות יכולה להיות במעקב על ידי cytometry זרימה. במיוחד כדי לנתח את צאצאי hematopoietic לא erythroid של ESC, חשוב השער הראשון בCD45 + תאי חיים.מסכי צעד זה את תאי OP9 מהניתוחים, ואילו שימוש בDAPI או צבע הכתמה גרעינית אחר מאפשר ההרחקה של תאי nonviable. ביום 12, אשכולות רבים של תאים קטנים, עגולים, מבריקים צריכים להיות גלויים. אין צורך לספור את התאים בשלב זה. אבל יש לנו ציינתי כי לחיות, ספירות אירוע cytometry זרימה מגודרת הן בדרך כלל בטווח של 1-3 x 10 5 יום 12 שיתוף תרבות לכל טוב. Cytometry זרימת מנתח של תאים מגודרת חיים המובחנים על monolayer OP9 יניב erythroid (neg CD45, TER119 +) וmonocytic (CD45 +, CD11b היי) שושלות (איור 7 א). ניתוח של תאי הבחנה על OP9-DL1 monolayers צריך לחשוף סמנים אופייניים שלילי כפול מסוג CD4 / CD8 חיים, CD45 + (DN) -1 (CD44 +, נג CD25, נג CD4, CD8 נג) וDN2 (CD44 +, CD25 +, נג CD4, CD8 נג) תאי T שלב (איור 7 ng>). ביום 16, יש עלייה משמעותית בכמות תאים קטנים, עגולים, מבריקים בתרבויות. על OP9-DL1s, התקדמות מוצרי התמיינות תאי T ל( neg CD44, CD25 +, נג CD4, CD8 נג) DN3 וDN4 (neg CD44, CD25 נג, נג CD4, CD8 נג) שלבים. חלק מתאי T DP (מסוג CD4 +, CD8 +) יכולים גם להתחיל מתעוררים ביום 16 (איור 7). HPCs זורעים על OP9 תאים להניב תאי B (CD19 +) ביום 16. ביום 20 של התרבות המשותפת OP9-DL1-המסקלין, יהיו כמויות גדולות של תאי DP T וחיובי יחידים (SP) תאי CD8 + T הנוכחיות ( איור 7). איור 8 מספק תרשים המסכם את השלבים העיקריים של התהליך המתואר לעיל, ונקודות זמן ניתוח הציעו במהלך התרבות משותפת.
ghres.jpg "/>
תמונת איור 1 שלב מיקרוסקופ לעומת של mESCs מובחן (מושבות קצוות חדים) גדל על גבי monolayer MEF (הגדלה 100X).
איור 2:. תמונות שלב מיקרוסקופ לעומת של confluency monolayer OP9 () הנמוך ביותר ו( B) הרמות הגבוהות ביותר confluency מומלצת למעבר / זריעה (הגדלה 40X) שיתוף תרבות לדוגמא (ג) (הגדלה 40X מעל מחוברות monolayer OP9. ). ((הגדלה 200X יתר מחוברות monolayer OP9 D)) עם היווצרות adipocyte (גדולה, שלפוחית המכילה, תאים).
איור 3: microscop בניגוד שלב תמונות y של הקמת מושבה כמו המזודרם-ב" יום 5 "של התרבות המשותפת. () צפיות ב40X ו (ב) 100X של צלחות התרבות המשותפת עם> 90% בידול המושבה mesodermal. צלחות אלה הן מוכנות ליום 5 מעבר. דוגמאות (CF) של צלחות יום 5 תרבות המשותפת הדורשות דחיית יום 1-2 לפני ההעברה (C & E, הגדלה 40X, D & F, הגדלת 100x).
איור 4: תמונות מיקרוסקופ לעומת שלב של מגוון רחב של תצורות מושבה כמו המזודרם-ביום 5 של התרבות המשותפת () מורפולוגיה המושבה מכונה "מכתשים" או (ב) מורפולוגיה המושבה המכונות. "גלגל עגלה." כ" מספרים "או" פרחים "(הגדלה 200X).
page = "תמיד"> 
תמונת איור 5 שלב מיקרוסקופ לעומת יום 8 צלחת שיתוף תרבות של עם אשכולות של HPCs הקטן, עגול, מבריק על monolayer OP9 (הגדלה 40X).
איור 6:.. Monolayer OP9 לאחר איסוף HPCs ביום התרבות משותפת 8 (AC) הטווח המתאים של שיבוש monolayer OP9 לאחר כביסה זהירה למסוק HPCs (ד ') דוגמא של monolayer OP9 ששובש מעל מהיום ליום הליך קציר 8 HPC.
איור 7: cytometry זרימת נציג (FACS) מנתח בנקודות זמן מסוימים במהלךבידול המסקלין במבחנה. (א) מכתים לerythroid (משמאל), monocytic (באמצע) ותא B (מימין) מוצרים של התרבות המשותפת המסקלין-OP9 ביום 12 או 16 כפי שצוין. (B) מכתים לפיתוח תאי T בנקודות זמן המצוינת של המסקלין-OP9-DL1 שיתוף התרבות. אנא ראה טקסט עבור תיאורים מפורטים של immunophenotypes.
תרשים איור 8 מהצעדים של הליך שיתוף תרבות המסקלין-OP9. () צעדי העברת תא המפתח של שמונה הימים הראשונים של התרבות המשותפת. המספר המשוער של תאי זרע על תאי OP9 בימים אפס וחמש מצוינים. (ב ') צעד העברת יום 8 ומוצרי ההתמיינות הצפויות זוהו על ידי cytometry זרימה בנקודתי זמן מרכזי של התרבות המשותפת. אנא ראה טקסט עבור תיאורים מפורטים של immunophenotypes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכת שיתוף תרבות OP9-DL1 נוצלה כדי ללמוד את התפקיד של מוצרי גנים שונים במהלך הפיתוח של סוגי תאי דם מתאי גזע. 8,12,13 זה הוכח גם מודל יעיל כדי ללמוד את הפונקציה של DNA הרגולציה הגן במהלך התמיינות תאים. 9,14 שימוש בגישה זו כחלופה למודלים של עכברים כל יכול להניב חיסכון משמעותי בזמן ועלויות של ניסויים העוסקים בשאלות רבות בסיסיות בhematopoiesis. עם זאת, עיבוד של פרוטוקול זה למטרות אלה מחייב ידיעה של השתנות פוטנציאל בין השיבוטים המסקלין שישמשו בהליכים אלה. ציר הזמן של הפרוטוקול שפורסם הוא expectable מהממוצע, מתוחזק היטב שורת המסקלין לא מניפולציות,. 7 בנוסף, השיבוטים המסקלין נבחרו לדור של עכברי chimeric בדרך כלל הם באיכות גבוהה יותר ויבצע מאוד וחסונה בשיתוף תרבות OP9 . מצד השני, שיבוטים המסקלין מתעוררים ישירות מיציבtransfection עם transgene המשולב ectopically יציג דרגות שונות של יעילות בידול ראשונית הנעה בין ממוצע לממוצע מתחת. הפרוטוקול המתואר כאן מספק לעיכוב 1-2 יום אסטרטגי של שלב 5 מעבר היום כדי לאזן את הבדלים פוטנציאליים אלה לפני הגיוס של hematopoiesis במבחנה.
מעבר יום 8 הוא הצעד שבו הביצוע של פרוטוקול זה יש רוב הפוטנציאל לטעויות. סבלנות, תרגול והתבוננות זהירה תאפשר אחד כדי לפתח את הטכניקה אשר מייעלת קציר HPC תוך מזעור ההפרעה monolayer OP9. מעבר ליום 5 ויום 8 שלבים העיקריים, הפרמטרים הקריטיים כרוכים תחזוקה קפדנית תרבית תאים (תאים במיוחד OP9, כפי שתואר לעיל) ותשומת לב מיוחדת לחומרים הכימיים המשמשים בפרוטוקול. מגיב הקריטי ביותר הוא FBS. הרבה מובהק של FBS ישתנו במידה ניכרת ביכולתם לתמוך בהליך זה. הרבה מרובים חייבים להיבדק בoבצו כדי לקבוע אילו יניב בידול חזק בassay זה.
מערכת שיתוף התרבות זו יש מגבלות משלה. לדוגמא, מודל זה אינו תומך בהתמיינות של תאי CD4 חיוביים יחידים. אחת סיבות לכך היא חוסר הביטוי של מתחם histocompatibility הגדול תשתית מצגת אנטיגן (MHC) Class II בתאי OP9. מצגת משטח נייד 1 של אנטיגנים על ידי MHC Class II נדרשת להתפתחות תקינה של תאי CD4 SP. תאי CD8 SP שעושים לצאת מייצגים שילוב של שלבי thymocyte CD8 SP בוגרים ולא בשלה. 1 יתר על כן, השתלה מוצלחת של המסקלין נגזרת אבות תא T לעכבר דורש מעבר לפני דרך תרבות איבר הרתי עוברית. 1 עם זאת, טכנולוגיה זו הוכיחה אותה מבטיח כגישת מחקר רב עוצמה לשתי השאלות התאיות ומולקולריות בהתפתחות מערכת חיסונית בדם ושהיו אפשריים בעבר רק כדי לחקור בנאיבו. כך, מלבד מתן דרך רומן להתקדם יותר מהירים על שאלות אלה, אימוץ רחב יותר של מערכת שיתוף תרבות OP9-ESC תהיה ההשפעה הרחבה יותר של הפחתת השימוש בחיות ניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Stem cell qualified FBS | Gemini | 100-125 | Heat inactivated |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| L-alanyl L-glutamine | Corning | 25-015-CI | |
| HEPES buffer | Millipore | TMS-003-C | |
| Non-Essential Amino Acids | ThermoScientific | SH30853.01 | |
| Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml) | Life Technologies | 15750-060 | |
| β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS | Life Technologies | 21985-023 | |
| Filter Unit | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm PES membrane |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CM | |
| α-MEM | Life Technologies | 12000-022 | Powder, reconstitute per manufacture recommendation |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| FBS | ThermoScientific | SH 30396.03 | Testing of individual lots required |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma | D2650 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand | R&D Systems | 308-FK | |
| Recombinant Murine IL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| Utrapure water with 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| MEFs mitomycin C treated | Millipore | PMEF-CF | Any mitotically arresteded MEFs can be used |
| DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| Cell strainer (40 μm) | Fisher | 22363547 | |
| Tissue culture dish 100 x 20 mm | BD Falcon | 353003 | |
| Multiwell 6-well | BD Falcon | 353046 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | Tubes for FACS |
| ES R1 cells | ATCC | SCRC-1011 | |
| OP9 cells | Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan). | ||
| OP9-DL1 cells | Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory. | ||
| FlowJo software | Tree Star | FACS data analyses | |
| Flow Cytometer | BD | FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab |
References
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
- Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
- de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
- Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
- Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
- Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
- Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
- de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
- Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
- Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).
