Protocol
1. Utarbeidelse av Culture Media, cytokiner og gelatinized Plates
- Forbered ES cell media ved å bruke Dulbeccos Modifisering av Eagles medium (DMEM) med høy glukose og natrium pyruvat. Tilsett 20% ESC kvalifisert Fetal Bovine Serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin, 1% L-glutamin, 1% HEPES-buffer, 1% ikke-essensielle aminosyrer, 0,1% gentamicin (50 mg / ml) og 0,1% ( 55 pM) β-mercaptoethanol. Sterilisere ES cell media ved filtrering.
- Forbered OP9 media ved å lage 1 L av Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) fra pulver i henhold til produsentens instruksjoner. Tilsett 20% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin. Invertere å blande. Steriliser ved filtrering i to 500 ml porsjoner.
MERK: Bruk av media laget av pulver er anbefalt og sannsynligvis vil gi bedre OP9 celle vedlikehold og in vitro differensiering resultater. Denne tilnærmingen har blitt vår standard prosedyre. Men vi er også oppmerksom that vi har til tider brukt pre-laget flytende α-MEM med tilstrekkelig suksess. - Forbered frysing medier ved tilsetning av 10% dimetylsulfoksyd (DMSO) til 90% FBS. Virvle forsiktig og sterilisere ved filtrering. Oppbevar ved 4 ° C.
- Forbered 2,000x Flt-3-ligand (10 ug / ml) ved oppløsning av humant rekombinant Flt-3-ligand (Flt-3L) i fullstendig OP9 medier til 10 ug / ml. Delmengde i 1,5 ml mikrosentrifugerør og oppbevar ved -80 ° C. Følg leverandørens anbefalinger om stabilitet og lagring.
MERK: Stabiliteten i Flight-3L er kort (1 måned ved 4 ° C eller 3 måneder ved -80 ° C). - Forbered 1,000x IL-7 (1 pg / ml) ved hjelp av komplette OP9 medier. Delmengde i 1,5 ml mikrosentrifugerør og oppbevar ved -80 ° C. Følg leverandørens anbefalinger om stabilitet og lagring (IL-7 er stabil i opp til 12 måneder ved -80 ° C).
- Forbered 1,000x leukemi hemmende faktor (LIF) (10 ug / ml) av en 1:10 fortynning av 10 7 enheter av LIF in ES cell media. Butikken delmengde ved 4 ° C. Pass på å merke utløpsdatoen levert av produsenten på alikvoten ampuller.
MERK: Produktet er stabilt i konsentrerte eller fortynnet form minst 18 måneder fra produksjonsdato. - Forbered gelatinerte 6-brønners plater ved å tilsett 1,5 ml 0,1% gelatinløsning i hver brønn av en 6-brønns plate. La retter i det sterile hetten ved romtemperatur med lokk på, slik at minst 30 min for belegg. Rettene kan også stå i en fuktet inkubator over natten. Fjern eventuelle left gelatin løsning rett før celle seeding. Ikke la gelatin løsning helt tørke ut i brønnen.
2. Utarbeidelse og vedlikehold av mateceller og mus embryonale stamceller (Mesc)
MERK: Inkuber alle celler i en fuktet 37 ° C inkubator med 5% CO 2.
- Tining mus embryonale Fibroblaster (MEF)
- Quick-tine en frossen hetteglass (~ 5 x 10 6
- Legg 8 ml ES cell media til de tinte celler, i en drop-klok måte å gradvis fortynne DMSO fra frysemedium.
- Sentrifuger cellene ved 400 x g ved 4 ° C i 5 min. Fjern forsiktig supernatanten og cellepelleten suspenderes i 3 ml ES celle medier.
- Forbered en 50 ml sentrifugerør med 33 ml forvarmet ES cell media. Tilsett 3 ml resuspendert MEFs for å bringe det endelige volumet til 36 ml.
- Fordel 3 ml av de resuspenderte MEFs i hver brønn av to gelatinized 6-brønns plater. Plasser platene inn i inkubatoren i minst seks timer for å tillate cellene å feste og spredt ut før såing de mESCs på dem. Disse mitotisk arrestert næringslag kan være brukbare for flere dager etter første seeding, hvis deres media er endret etter 2-3 dager.
MERK: Freshly arrestert MEFs kan også brukes. </ Ol>
- Seeding mESCs
- Hurtig-tine en ampulle med en frossen Mesc klon i 37 ° C vannbad og forberede celler som beskrevet i 2.1.1-2.1.3.
MERK: Vi fryse to ampuller med Mesc fra en konfluent godt av en 6-brønns plate. - Fjern mediet fra en brønn (per Mesc klon) av 6-brønns plate med arrestert MEF monolag (fremstilt i trinn 2.1.5) og frø i 3 ml mESCs på toppen av MEF monolayer. Tilsett 3 mL av 1,000x LIF (10 ng / ml). Returnere retter inn i kuvøsen.
- Hurtig-tine en ampulle med en frossen Mesc klon i 37 ° C vannbad og forberede celler som beskrevet i 2.1.1-2.1.3.
- ES celle vedlikehold og trypsin mediert passasje
MERK: Endre medier daglig, eller split basert på samløpet av Mesc. Optimalt, høste og dele / re-plate cellene annenhver dag.- Fjern ES cellemedier og vaske mESCs med 2 ml PBS. Fjern PBS. Tilsett 1 ml av 0,25% trypsin og inkuberes ved 37 ° C i 3-5 min.
- Samle celler trypsinisert og overføre dem til et 15 ml sentrifugerør. Kraftig pipettér cellesuspensjonen til å bryte opp klumper av mESCs. Tilsett 2 ml komplett ES celle media til cellesuspensjonen for å nøytralisere trypsin.
- Spin cellene ved 400 x g i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatant og resuspender pelleten i 3 ml ES celle medier.
- Ta ut mediet fra seks-brønns plater som inneholder forberedt arrestert MEF monolagene. Tilsett passende mengde av cellesuspensjonen (basert på det ønskede deleforhold) i 3 ml av ES cellen media til hver brønn for å bli sådd. Tilsett 3 mL av 1,000x LIF. En konfluent Mesc godt splittet 1: 6 vil være klar for passasje i 2 dager.
- OP9 / OP9-DL1 celle vedlikehold
- Tine en ampulle med OP9 celler (følg trinnene 2.1.1-2.1.3 bruker OP9 media)
- Legg 7 ml OP9 media til 10 cm vev kultur parabolen. Tilsett 3 ml resuspenderte celler i en dråpevis måte, fordele cellene gjennom hele platen. Plasser cellene over natten i inkubatoren.
- Sjekk samløpet av OP9 celler neste dag. Hvis parabolen inneholder mange døde flytende celler, remohar media og legge til 10 ml friskt OP9 medier. Tilbake fatet til inkubatoren hvis nesten full samløpet ikke er observert. Split (ved hjelp av trypsin) 1: 4 nær konfluent OP9 monolayer.
MERK: Plater skal nå samme samløpet nivået igjen i ca 2 dager. Pass på å ikke la OP9 celler blir over-konfluent. - Fryse de tidlige passasjer av OP9 celler som ekspansjons aksjer.
MERK: Vi fryse to ampuller med OP9 celler fra en nær konfluent 10 cm parabolen. Hvert hetteglass med ekspansjon lager kan bli ytterligere spredd til å skape arbeids aksjer som er senere brukt i Mesc co-kultur eksperimenter. Hold alle OP9 stocks frosset i flytende nitrogen i stedet for i -80 ° C-fryseren, siden varierende temperaturer kan negativt påvirke kvaliteten av de fryser.
3. OP9-DL1 Co-kultur Prosedyre
- Preparater co-kultur
- Omtrent en uke før oppstart av en co-kultur, tine MEFs, mESCs og OP9 celle arbeider stocks. Siden OP9-DL1 cellene ikke er nødvendig før co-kultur dag 8, tine OP9-DL1 celler i løpet av de tre første dagene etter co-kultur innvielse. Opprettholde eller fryse alle celler etter behov.
- Bestemme start antall 10 cm plater med OP9 cellemonolagene forberedt på å nå 80% samløpet på co-kultur dag 0 basert på omfanget av forsøket (f.eks antall Mesc kloner å være differensiert og antall co-kultur tidspunkter til bli analysert). For å forberede seg på en co-kultur, Split, nær konfluent rett av OP9 celler mellom 1: 4 og 1: 6 to dager i forkant av når vil være behov monolagene.
MERK: Man trenger minst én plate per ESC klone. Vanligvis er en enkelt klon ESC utsådd på en enkelt plate (som beskrevet nedenfor) på dag 0 bør gi nok celler til frø seks plater på dag 5 passasje. Hver dag 5 plate vil muliggjøre en påfølgende analyse tidspunkt. - Siden OP9 monolagene vil være kontinuerlig behov for co-kultur passasje, ta vare å alltid maintai et tilstrekkelig antall ekstra OP9 kultur plater parallelt med co-kultur.
- Dag 0: Oppstart av co-kultur
- Samle Mesc som i 2.3.1-2.3.4. Tell cellene.
- For hver Mesc klon forberede 5 x 10 4 Mesc i 10 ml OP9 medium per plate.
MERK: Selv om vi ikke har brukt det, ser vi at en alternativ medium bestående av α-MEM, 10% FBS, og 5 x 10 -5 M β-mercaptoethanol har også blitt rapportert for bruk i differensiering co-kulturer 10. - Fjern gammel media fra OP9 retter og tilsett 10 ml Mesc suspensjon til rettene ta vare å fordele cellene jevnt utover platen. Plasser rettene i 37 ° C inkubator.
- Dag 3: endring Media
- Fjern retter fra inkubatoren og observere under mikroskop. Kolonier bør begynne å miste shininess og se flatt ut.
- Ta ut mediet fra retter og tilsett 10 ml frisk OP9media.
- Returner co-kultur retter til inkubatoren. Visuelt overvåke mesoderm lignende koloni formasjon daglig for å informere tidspunktet for OP9 mater monolayer forberedelse til neste passasje (dag 5), som ikke bør gjennomføres før ~ 80-90% av koloniene visuelt vise mesoderm-lignende morfologi. Maksimal utsettelse av dagen fem celle overføring trinnet er 2 dager.
- Dag 5: Trypsin mediert passasje med pre-plating.
MERK: Forbered på forhånd et tilstrekkelig antall 10 cm retter med optimalt konfluente OP9 celler. Fortsett med de neste trinnene bare hvis co-kulturer visuelt vise funksjonene som beskrives i trinn 3.3.3 (se også Representative Resultater).- Fjern media fra co-kultur retter. Tilsett 4 ml PBS for å vaske. Virvle PBS og fjern. Tilsett 4 ml 0,25% trypsin og plassere retter i inkubator for ~ 5 min.
- Forstyrre lag av trypsinert cellene ved kraftig pipettering, tar seg ikke å innføre overdreven luftbobler, inntil enhomogen, hovedsakelig enkeltcellesuspensjon blir oppnådd.
- Tilsett 4 ml av komplette OP9 media og bland ved pipettering. Overfør cellene inn i en ny, tom 10 cm oppvaskmaskin og plass i inkubatoren i 30 min for å la OP9 celler til å følge parabolen. Denne "pre-plating" trinnet reduserer antallet OP9 celler overført til det neste trinn i ko-kulturen.
- Forbered 50 ml sentrifugerør med 40 mikrometer celle siler.
- Samle ikke-adherente celler fra den pre-belagt form og sender dem gjennom cellen silen inn i røret. Vask fatet forsiktig med 6 ml PBS og passerer det gjennom den samme sil, slik vedlagte OP9 celler bak.
- Sentrifuger cellene ved 400 x g i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatant og resuspender pelleterte celler i 3 ml komplett OP9 medier. Tell cellene.
- Fjern materialet fra 10 cm plater med optimalt konfluente OP9 celler.
- For hver analyse tidspunkt, frø 5 x 10 5 celler på OP9 monosjikt i 10 ml sluttvolum.
- Tilsett 5 ng / ml humant rekombinant Flt-3L og plassere retter i kuvøse.
- Dag 8: Hematopoetiske stamceller (HPC) samling
MERK: Forbered på forhånd et tilstrekkelig antall 6-brønners plater med OP9 eller OP9-DL1 cellemonolagene slik at de vil være ~ 80% konfluent i tid for dette trinnet.- Forbered 50 ml sentrifugerør med 40 mikrometer siler.
- Fjern rettene fra inkubatoren og observere under mikroskop. Blanke klynger av HPCS bør være løst festet til OP9 monolag. Samle så mange av disse cellene som mulig ved å vaske (men ikke altfor forstyrre) den OP9 monolayer med en pipette og eksisterende medier på fatet. For å hindre skum, la alltid minst 1 ml av media i spissen av pipetten i løpet av denne HPC samling / vasketrinn.
- Før cellene via 40 mikrometer silen inn i et rør. Legg 8 ml PBS til samme plate og sjekk under mikroskop Hvis alle HPCS vire samlet. Gjenta vaskingen / samlingen trinn med PBS og (om nødvendig) med mer kraftig vasking. Sil cellene inn i røret som allerede inneholdende celler fra den samme plate.
- Sentrifuger cellene ved 400 x g i 5 min ved 4 ° C.
- Forbered en mester blanding av 3 ml (per plate seeded på dag 5) av OP9 media med 5 ng / ml Flt-3L og 1 ng / ml IL-7.
- Fjern supernatanten og resuspender pellet i OP9 media med Flt-3L + IL-7 mester mix (3 ml for hver 10 cm tallerken behandlet). Overfør de innsamlede celler fra hver plate til en brønn i en 6-brønn plate med OP9 celler.
- For å drive cellene mot monocyttisk, B-celle eller erythroide linjene, seede de innsamlede cellene på OP9 celler. Å utlede T-celler, frø cellene på OP9-DL1 cellemonolagene.
- Plasser 6-brønners plater i inkubatoren.
- Dag 10: endring Media
- Forbered en 15 ml sentrifugerør for hver distinkt Mesc klone-feeder celletype selsksjon i co-kultur.
- Forbered en mester blanding av OP9 media med 5 ng / ml Flt-3L og 1 ng / ml IL-7. Forbered 3 ml for hver brønn.
- Forsiktig samle mediet fra hver brønn på 6-brønners plate kombinere mediet fra flere brønner inneholdende den samme ESC klone-matecelletype kombinasjon.
- Tilsett 2 ml OP9 media mester mix (se 3.6.2) i hver brønn.
- Sentrifuger oppsamlet mediet ved 400 x g i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspender hver pellet (svært liten hvis synlig) i 1 ml OP9 media mester mix (se 3.6.2) per brønn opprinnelig samlet i trinn 3.6.3.
- Fordel 1 ml celler tilbake i hver brønn hvorfra mediet var opprinnelig samlet bringe volumet i hver brønn til 3 ml. Returnere rettene til inkubatoren.
- Dag 12: Ingen trypsin passasje
MERK: Forbered på forhånd et tilstrekkelig antall 6-brønn retter med OP9 eller OP9-DL1 cellene slik at de vil være optimalt sammenflytende i tid for denne sTEP. Dag 12 er ideell for flowcytometri analyser av utviklingen erythroid, monocyttisk, og tidlige T-celler.- Forbered en master mix (3 ml for hver brønn som vil fortsette i co-kultur) av OP9 media med 5 ng / ml Flt-3L og 1 ng / ml IL-7.
- Forbered 50 ml sentrifugerør med 40 mikrometer siler (en for hver ESC klone-feeder celletype kombinasjon i co-kultur).
- Kraft pipettere de eksisterende mediet i hver brønn for å disaggregert alle celler (inkludert monolaget) i brønnen. Fortsett kraftig pipettering inntil en tilstand som ligner en enkelt cellesuspensjon blir oppnådd.
- Før de innsamlede celler gjennom silen inn i røret. Tilsett 3 ml PBS til hver brønn for å vaske og samle alle gjenværende celler. Før cellene gjennom samme sil. Kombiner celler fra flere brønner som inneholder samme ESC klone-feeder celletype kombinasjon.
- Kast den brukte celle sil og fjerne en alikvot tilsvarer en brønn (~ 6 ml) i en hvilken som helst ønsketflowcytometri (eller annet)-analyser som skal utføres på denne dagen. Lagre disse alikvotene på is før bruk.
- Sentrifuger cellene ved 400 x g i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten. Resuspender pelleten fra 50 ml sentrifugerør i 3 ml konsentrat-blanding per brønn for å bli re-foret. Tilsett 3 ml per brønn av hver cellesuspensjon til den aktuelle matecelletype og plassere rettene i inkubatoren.
- Dag 14: endring Media
- Følg fremgangsmåten som er beskrevet i punkt 3.6.
- Dag 16: Ingen trypsin passasje
MERK: Forbered på forhånd seks-brønns retter av optimalt konfluente OP9 eller OP9-DL1 celler for dette trinnet.
MERK: Dag 16 er ideell for flowcytometri analyser av B-lymfocytter og mellomtrinn T-celler.- Følg fremgangsmåten som er beskrevet i punkt 3.7.
- Dag 18: endring Media
- Følg fremgangsmåten som er beskrevet i punkt 3.6.
- Dag 20: Ingen trypsin passasje
MERK: Dag 20 is ideelt for flowcytometri analyser av midten til slutten av scenen utvikle T-celler.- Følg fremgangsmåten som er beskrevet i punkt 3.7. Hvis ønskelig, bære differensierende celler forbi dag 20 vekslende medier forandring og ingen trypsin passasjer hver to dager, med daglig overvåking av lymfocytt utvidelsesverdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når dyrket på MEFs i nærvær av LIF, kan mESCs bli opprettholdt i en udifferensiert tilstand. Under ideelle forhold, vises de som kompakte kolonier av celler omgitt av en skinnende glorie i fase kontrast mikroskopi (Figur 1). Disse kulturer må overvåkes daglig. Avhengig av samløpet av cellene, kan mediet endres eller celler kan deles. Nabo Mesc kolonier bør ikke komme til det punktet av kontakt med hverandre. En normal, frisk kultur av udifferensierte mESCs er et viktig utgangspunkt for in vitro T-celle-differensiering. Ved oppstart av co-kultur, anbefales det at cellene være fullt konfluent uten å være overbefolket. Dette er slik at mesteparten av cellene høstet for såing av cellene på OP9 monolag er Mesc (heller enn mateceller). Hvis store forskjeller i samløpet er observert blant de ulike Mesc kloner å bli differensiert i dag 0, så det ville være best å fjerne MEFs av pre-tilslutning til tissue kultur retter (som i trinn 3.4.3-3.4.6 bruker komplett ES cell media) før telle mESCs for co-kultur seeding.
OP9 celler må være godt vedlikeholdt før co-kultur innvielsen (som beskrevet i kapittel 2.4). I tillegg er det tenkt at OP9 cellene mister noen av sine egenskaper med langvarig kultur og / eller uttalt økninger i sine proliferasjonsrate 7 Unngå split forholdstall utover. 1: 5 under vedlikehold av OP9 celler, og forkaster kontinuerlige OP9 kulturer etter seks uker, vil bidra til å unngå disse fallgruvene.
Ved innledende celle såing og celleoverføringsfremgangsmåten i ko-kultur (dag 0, 5, 8, 12, 16), burde OP9 monolag være innenfor et optimalt rekke løpet. Figur 2 viser den lave (figur 2A) og høy (figur 2B) ender av omfanget av OP9 celle samløpet tilrådelig for bruk som co-kultur monolagene. Et eksempel på en over-konfluent plate er vist i figurure 2C. Unnlatelse av å opprettholde optimal løpet kan indusere dannelse av adipocytter (figur 2D) som, i store mengder, kan negativt påvirke ko-kulturen.
På dag 0, er co-kulturen startet på OP9 celler i stedet for OP9-DL1 celler siden mesoderm formasjonen er favorisert på OP9 celler. Cellene er belagt på OP9-DL1 celler monolayers begynner på dag 8 å indusere T-celleproduksjon. Mens noen Mesc kloner vil visuelt vise robust og kvantitativ (~ 90%) dannelse av mesoderm-lignende kolonier etter dag 5 av co-kultur (figur 3A-B), andre kan vise forsinkelser på dette trinnet (Figur 3C-F). Under mikroskopet, har mesoderm lignende kolonier avledet i denne analysen er variabelt beskrevet som likner vognhjul eller kratere (figur 4A) eller, Starbursts eller buketter (Figur 4B).
Mens den publiserte OP9-DL1 protokollen gjenspeiler en norm av kvantitativ mesoderm formasjon etter dag 5 av co-kultur, 7 finner vi at ikke alle ESC kloner oppnå at normen innenfor denne tidsrammen. I disse tilfellene, vi bytter mediet på dag 5 og vente ytterligere 1-2 dager før gjennomføring av "dag 5" celleinnhøstningsutstyr / overføringsprotokoll. Målet med denne forsinkelsen er å tillate ~ 80-90% av ES cellekolonier å visuelt bli mesodermal før overføring. Det er viktig å gjøre det klart at dette 80-90% tallet reflekterer en strengt visuell kriterium merkbar ved enkel fase kontrast mikroskopisk undersøkelse av koloni morfologi i co-kultur retter. Det refererer kun til andel ESC kolonier som ligner de som er vist i figur 4. Det er mulig at noen ESC kloner ikke vil nå dette visuelle kriteriet, selv etter en to-dagers forsinkelse. I et slikt tilfelle, er det mulig å anrike for bloddannende mesodermal forløpere ved hjelp av strømningscytometri cellesortering for FLK-1 +-celler, som er blitt beskrevet tidligere. 6,11 I alle fall, for sake av nomenklatur bekvemmelighet, vi "stille klokken" og refererer til dag mesoderm lignende koloni overføring som "dag 5."
Når flere MGP kloner blir differensiert i parallell, er det mulig at noen co-kulturer vil være klar for dagen fem passasje på tid, mens andre henger etter. I dette tilfellet, er det tilrådelig å utsette passering av alle co-kulturer til tregere kloner nå opp til de andre. Forsinkelsen synes ikke å gjøre noen skade på de "på gang" co-kulturer, men fordeler den påfølgende differensiering av de tregere kloner mye.
Dag 8 (dvs. tre dager etter mesodermal koloni transfer) ser fremveksten og akkumulering av HPCS. HPCS er synlige som skinnende klynger av celler som er løst følges til OP9 mateceller (figur 5). En forsiktig vaskemetoder ved hjelp av en pipette og media på fatet, vil løsne og samle HPCS samtidig laden OP9 monolaget stort sett intakt (figur 6A-C). Dette er kanskje den mest teknikk-sensitive trinn i protokollen. Det tar litt øvelse for å finne de riktige bevegelser og media utstøting trykk for å oppnå den ønskede balanse av maksimal høsting av HPCS med minimal forstyrrelse av matersjikt. Det er akseptabelt dersom noen av OP9 monolag løfter seg, siden de fleste av noen streif monolaget vil bli fanget opp i 40 mikrometer nylon mesh etter filtrering. Figur 6D viser et monolag etter dreven pipettering fører til større monolag avbrudd enn nødvendig. Under dette vasketrinn, er det viktig å kontrollere under mikroskopet hvorvidt eller ikke alle HPCS har blitt samlet, og justere vasketrykket tilsvarende.
Fremdriften av ko-kulturen kan overvåkes ved strømningscytometri. For å analysere spesifikt ikke-erytroide hematopoietisk avkommet av ESC, er det viktig å først port på live CD45 + celler.Dette trinnet skjermer ut OP9 celler fra analysene, mens bruk av DAPI eller annen nukleær farging fargestoff gjør at utelukkelse av ikke-levedyktige celler. Ved dag 12, bør mange klynger av små, runde, skinnende celler være synlig. Det er ikke nødvendig å telle celler på dette stadium. Men vi har observert at lever, gated flowcytometri hendelses teller er typisk i størrelsesorden 1-3 x 10 5 per dag 12 co-kulturen godt. Flowcytometri analyser av levende gated celler differensiert på OP9 monolaget vil gi erythroid (CD45 neg, TER119 +) og monocyttiske (CD45 +, CD11b hi) linjene (figur 7A). Analyser av levende, CD45 + celler differensiere på OP9-DL1 monolayers bør avsløre markører karakteristisk for CD4 / CD8 dobbel negativ (DN) -1 (CD44 +, CD25 neg, CD4 neg, CD8 neg) og DN2 (CD44 +, CD25 +, CD4 neg, CD8 neg) stadium T-celler (figur 7B ng>). Ved dag 16, er det en betydelig økning i mengden av små, runde, blanke celler i kulturer. På OP9-DL1s, T-celle differensiering produkter fremgang til DN3 (CD44 neg, CD25 +, CD4 neg, CD8 neg) og DN4 (CD44 neg, CD25 neg, CD4 neg, CD8 neg) stadier. Noen DP (CD4 +, CD8 +) T-celler kan også begynne å frem ved dag 16 (figur 7B). HPCS utsådd på OP9 celler ga B-celler (CD19 +) ved dag 16. Ved dag 20 av OP9-DL1-Mesc ko-kultur, vil det være store mengder DP T-celler og enkelt positiv (SP) CD8 + T-celler til stede ( Figur 7B). Figur 8 gir en skjematisk fremstilling som sammenfatter viktige trinn av de ovennevnte fremgangsmåter, og de foreslåtte analyse tidspunktene under ko-kulturen.
ghres.jpg "/>
Figur 1. Fase kontrast mikros bilde av udifferensierte mESCs (skarpe kanter kolonier) som vokser på toppen av en MEF monolayer (100X forstørrelse).
Figur 2:. Fase kontrast mikroskopi bilder av OP9 monolayer konfluens (A) Laveste og (b) høyeste konfluens nivåer tilrådelig for co-kultur passasje / seeding (40X forstørrelse) (C) Eksempel på en over-konfluent OP9 monolayer (40X forstørrelse. .) (D) Over-konfluent monolag OP9 (200X forstørrelse) Fettceller med formasjonen (store, vesikkel som inneholder, celler).
Figur 3: Phase kontrast mikroskopy bilder av mesoderm lignende koloni formasjon på "dag 5" av co-kultur. (A) 40X og (B) 100X utsikt over co-kultur plater med> 90% mesodermal koloni differensiering. Disse platene er klare for dag 5 passasje. (CF) Eksempler på Dag 5 co-kultur plater som krever 1-2 dagers utsettelse før overføring (C & E, 40X forstørrelse, D & F, 100X forstørrelse).
Figur 4: fase kontrast mikroskopi bilder av det mangfoldet av mesoderm lignende koloni formasjoner på dag 5 i co-kultur (A) Kolonien morfologi referert til som "kratere" eller (B) Kolonien morfologi referert til. "Vogn hjul." som "starburst" eller "buketter" (200X forstørrelse).
Figur 5. Fase kontrast mikros bilde av dag 8 co-kultur plate med klynger av små, runde, skinnende HPCS på en OP9 monolayer (40X forstørrelse).
Figur 6:.. OP9 monolayer etter HPCS samling på co-kultur dag 8 (AC) passende utvalg av forstyrrelse av OP9 monolayer etter nøye vasking å høste HPCS (D) Et eksempel på en OP9 monolayer som har vært over-avbrutt av dagen 8 HPC høsting prosedyre.
Figur 7: Representant flowcytometri (FACS) analyser på bestemte tidspunkter underMesc differensiering in vitro. (A) farging for erythroid (til venstre), monocyttisk (midten) og B-celle (høyre) produkter fra Mesc-OP9 co-kultur på dag 12 eller 16, som angitt. (B) farging for å utvikle T-celler på de angitte tidspunkter av Mesc-OP9-DL1 co-kultur. Vennligst se tekst for detaljerte beskrivelser av immunophenotypes.
Figur 8. diagram av trinnene i fremgangsmåten Mesc-OP9 ko-kulturen. (A) Nøkkelcelleoverføringsfremgangsmåten av de første åtte dager etter ko-kulturen. Omtrentlig antall celler sådd på OP9 celler på dag null og fem er indikert. (B) I åtte overføring trinnet og de forventede cellulær differensiering produkter oppdages av flowcytometri på viktige tidspunkter i co-kultur. Vennligst se tekst for detaljerte beskrivelser av immunophenotypes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den OP9-DL1 ko-kultur-system er blitt anvendt for å studere rollen til forskjellige genprodukter under utviklingen av blodcelletyper fra stamceller. 8,12,13 Det har også vist seg en effektiv modell for å studere funksjonen av genet regulatoriske DNA under cellulær differensiering. 9,14 Ved hjelp av denne metoden som et alternativ til hele musemodeller kan gi betydelige besparelser i tid og kostnader for eksperimenter som tar for mange grunnleggende spørsmål i hematopoiesis. Imidlertid tilpasning av denne protokoll for disse formål krever erkjennelse av den potensielle variabilitet blant Mesc kloner som ville bli brukt i disse fremgangsmåter. Tidslinjen for den publiserte protokollen er expectable fra gjennomsnittet, godt vedlikeholdt, ikke-manipulert Mesc linje. 7 I tillegg Mesc kloner valgt for generering av kimære mus vanligvis er av høyere kvalitet og vil utføre svært robust i OP9 co-kultur . På den annen side, Mesc kloner frem direkte fra stabiletransfeksjon med en ectopically integrert transgen vil vise varierende grad av innledende differensiering effektivitet varierer fra middels til under gjennomsnittet. Protokollen er beskrevet her gir en strategisk 1-2 dagers forsinkelse på dagen fem passasje skritt for å jevne ut disse potensielle forskjeller før induksjon av hematopoiesis in vitro.
Dagen 8 passasjen er det trinnet hvor utførelsen av denne protokollen har størst potensial for feil. Tålmodighet, praksis og nøye observasjon vil aktivere en å utvikle teknikken som optimaliserer HPC avling samtidig minimere OP9 monolayer avbrudd. Utover de sentrale dag 5 og dag 8 trinn, de kritiske parametrene omfatter nitid cellekultur vedlikehold (spesielt OP9 celler, som beskrevet ovenfor), og spesiell oppmerksomhet til de reagenser som brukes i protokollen. Den mest kritiske reagens er FBS. Distinkte masse FBS vil variere betydelig i deres evne til å støtte denne prosedyren. Flere masse må testes i order å bestemme hvilke vil gi robust differensiering i denne analysen.
Dette co-kultur systemet har sine begrensninger. For eksempel, gjør denne modellen støtter ikke differensiering av enkeltstående positive CD4-celler. En årsak til dette er mangelen på uttrykk for de store histocompatibility kompleks (MHC) klasse II antigen presentasjon infrastruktur i de OP9 celler. En Cell overflaten presentasjon av antigener av MHC klasse II er nødvendig for riktig utvikling av CD4 SP celler. CD8 SP celler som gjør dukke representerer en blanding av modne og umodne CD8 SP thymocyte etapper. En videre vellykket transplantasjon av Mesc avledet T-cellestamfedre til en mus krever forutgående passasje gjennom foster thymisk organ kultur. En likevel denne teknologien har bevist sin lover som en kraftig undersøkende tilnærming til både cellulære og molekylære spørsmål i blod og immunsystemet utvikling som var tidligere bare mulig å utforske i vIvo. Dermed, bortsett fra å gi en ny måte å gjøre raskere fremdrift på disse spørsmålene, bredere adopsjon av OP9-ESC co-kultur system vil ha bredere virkningen av å redusere bruken av forsøksdyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Stem cell qualified FBS | Gemini | 100-125 | Heat inactivated |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| L-alanyl L-glutamine | Corning | 25-015-CI | |
| HEPES buffer | Millipore | TMS-003-C | |
| Non-Essential Amino Acids | ThermoScientific | SH30853.01 | |
| Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml) | Life Technologies | 15750-060 | |
| β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS | Life Technologies | 21985-023 | |
| Filter Unit | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm PES membrane |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CM | |
| α-MEM | Life Technologies | 12000-022 | Powder, reconstitute per manufacture recommendation |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| FBS | ThermoScientific | SH 30396.03 | Testing of individual lots required |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma | D2650 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand | R&D Systems | 308-FK | |
| Recombinant Murine IL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| Utrapure water with 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| MEFs mitomycin C treated | Millipore | PMEF-CF | Any mitotically arresteded MEFs can be used |
| DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| Cell strainer (40 μm) | Fisher | 22363547 | |
| Tissue culture dish 100 x 20 mm | BD Falcon | 353003 | |
| Multiwell 6-well | BD Falcon | 353046 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | Tubes for FACS |
| ES R1 cells | ATCC | SCRC-1011 | |
| OP9 cells | Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan). | ||
| OP9-DL1 cells | Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory. | ||
| FlowJo software | Tree Star | FACS data analyses | |
| Flow Cytometer | BD | FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab |
References
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
- Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
- de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
- Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
- Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
- Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
- Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
- de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
- Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
- Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).
