Protocol
1. Fremstilling af Kultur Medier, Cytokiner og gelatiniseres Plader
- Forbered ES-celle medier ved hjælp af Dulbeccos modifikation af Eagles medium (DMEM) med højt glucoseindhold og natriumpyruvat. Tilsæt 20% ESC Kvalificerede føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin, 1% L-glutamin, 1% HEPES buffer, 1% ikke-essentielle aminosyrer, 0,1% gentamicin (50 mg / ml) og 0,1% ( 55 uM) β-mercaptoethanol. Steriliser ES-celle medier ved filtrering.
- Forbered OP9 medier ved at 1 L Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) fra pulver i henhold til producentens anvisninger. Tilsæt 20% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin. Invert at blande. Der steriliseres ved filtrering i to 500 ml portioner.
BEMÆRK: Det anbefales og forventes at give en forbedret vedligeholdelse OP9 celle og in vitro differentiering påfører Brugen af medier lavet af pulver. Denne tilgang er blevet vores standard procedure. Men vi bemærker også that vi har til tider brugt pre-made flydende α-MEM med tilstrækkelig succes. - Forbered frysning medier ved tilsætning af 10% dimethylsulfoxid (DMSO) til 90% FBS. Bland forsigtigt, og der steriliseres ved filtrering. Opbevares ved 4 ° C.
- Forbered 2,000x Flt-3-ligand (10 ug / ml) ved at opløse rekombinant human Flt-3-ligand (Flt-3L) i komplet OP9 medier 10 ug / ml. Alikvot i 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved -80 ° C. Følg leverandørens anbefalinger vedrørende stabilitet og opbevaring.
BEMÆRK: Stabiliteten af Flt-3L er kort (1 måned ved 4 ° C eller 3 måneder ved -80 ° C). - Forbered 1.000 x IL-7 (1 ug / ml) ved hjælp af komplet OP9 medier. Alikvot i 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved -80 ° C. Følg leverandørens anbefalinger om stabilitet og opbevaring (IL-7 er stabil i op til 12 måneder ved -80 ° C).
- Forbered 1.000 x leukæmi inhibitorisk faktor (LIF) (10 ug / ml) ved en 1:10 fortynding af 10 7 enheder af LIF in ES-celle medier. Opbevares alikvot ved 4 ° C. Vær sikker på at notere udløbsdatoen leveret af producenten på alikvote hætteglas.
BEMÆRK: Produktet er stabilt i koncentrerede eller fortyndet form mindst 18 måneder fra datoen for fremstillingen. - Forbered gelatinerede plader med 6 brønde ved tilsættes 1,5 ml 0,1% gelatineopløsning i hver brønd i en 6-brønds plade. Lad retter i den sterile hætte ved stuetemperatur med låg på, så mindst 30 minutter til belægning. Skålene kan også efterlades i en fugtig inkubator natten over. Fjern eventuelle rester af gelatine løsning lige før cellepodning. Lad ikke gelatineopløsningen helt tørre ud i brønden.
2. Udarbejdelse og vedligeholdelse af feederceller og mus embryonale stamceller (Mesc)
BEMÆRK: Inkuber alle celler i en befugtet 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Optøning Mouse embryofibroblaster (MEF)
- Quick-tø en frossen hætteglas (~ 5 x 10 6
- Tilføj 8 ml ES-celle medie til de optøede celler i en dråbevis måde til gradvist at fortynde DMSO fra frysemedium.
- Centrifuger cellerne ved 400 x g ved 4 ° C i 5 min. Fjern forsigtigt supernatanten og resuspender cellepelleten i 3 ml ES-celle medier.
- Forbered en 50 ml centrifugerør med 33 ml forvarmet ES-celle medier. Tilsæt 3 ml resuspenderet MEF'er at bringe det endelige volumen til 36 ml.
- Fordel 3 ml af de resuspenderede MEF'er i hver brønd i to gelatinerede plader med 6 brønde. Placer pladerne i inkubatoren i mindst seks timer for at tillade cellerne at vedhæfte og spredt ud før podning af mESCs på dem. Disse mitotisk stoppede fødelag kan være anvendelige til flere dage efter den første podning, hvis deres medier skiftes hver 2-3 dage.
BEMÆRK: Frisk arresterede MEF'er kan også anvendes. </ Ol>
- Seeding mESCs
- Quick-tø et hætteglas med en frossen Mesc klon i 37 ° C vandbad og forberede celler som beskrevet i 2.1.1-2.1.3.
BEMÆRK: Vi fryse 2 hætteglas Mesc fra et sammenflydende brønd i en 6-brønds plade. - Fjern medier fra en brønd (per Mesc klon) i 6-brønds plade med arresteret MEF monolag (fremstillet i trin 2.1.5) og pode 3 ml mESCs oven MEF monolag. Tilsæt 3 pi 1.000 x LIF (10 ng / ml). Retur retter i rugemaskine.
- Quick-tø et hætteglas med en frossen Mesc klon i 37 ° C vandbad og forberede celler som beskrevet i 2.1.1-2.1.3.
- ES-celle vedligeholdelse og trypsin medieret passage
BEMÆRK: Skift medier dagligt eller split baseret på sammenløbet af Mesc. Optimalt, høst og split / re-plade cellerne hver anden dag.- Fjern ES-celle medier og vaske mESCs med 2 ml PBS. Fjern PBS. Tilsæt 1 ml 0,25% trypsin og inkuberes ved 37 ° C i 3-5 min.
- Saml trypsiniserede celler og overføre dem til et 15 ml centrifugerør. Energisk pipetteres cellesuspensionen til at bryde op klumper af mØkonomiske og sociale råd. Tilsæt 2 ml komplet ES-celle medier til cellesuspensionen for at neutralisere trypsin.
- Spin celler ved 400 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten og pellet resuspenderes i 3 ml ES-celle medier.
- Fjern medier fra 6-brønds plader indeholdende forberedt anholdt MEF monolag. Tilsæt en passende mængde af cellesuspensionen (baseret på den ønskede delingsforholdet) i 3 ml ES-celle medier til hver brønd, der skal podes. Tilsæt 3 pi 1.000 x LIF. Et sammenflydende Mesc godt split 1: 6 vil være klar til passage i 2 dage.
- OP9 / OP9-DL1 celle vedligeholdelse
- Optø et hætteglas med OP9 celler (følg trinene 2.1.1-2.1.3 hjælp OP9 medier)
- Tilføj 7 ml OP9 medier til 10 cm vævsdyrkningsskål. Tilsæt 3 ml resuspenderede celler i en drop-klog måde, distribuere celler i hele pladen. Anbring cellerne natten over i inkubatoren.
- Kontroller sammenløbet af OP9 celler næste dag. Hvis skålen indeholder mange døde flydende celler, remove medierne og tilsættes 10 ml frisk OP9 medier. Retur skålen til inkubatoren hvis næsten fuld sammenløb ikke overholdes. Split (ved hjælp af trypsin) 1: 4 nær sammenflydende OP9 monolag.
BEMÆRK: Plader skal nå samme sammenløb niveau igen i ca 2 dage. Pas på ikke at lade OP9 celler bliver over-sammenflydende. - Frys de tidlige passager i OP9 celler som ekspansion bestande.
BEMÆRK: Vi fryse 2 hætteglas med OP9 celler fra en nær sammenflydende 10 cm skål. Hvert hætteglas med ekspansion lager kan formeres yderligere at skabe arbejdsvilkår bestande, der senere bruges i Mesc co-kultur eksperimenter. Hold alle OP9 lagre frosset i flydende nitrogen i stedet for i -80 ° C fryseren, da svingende temperaturer kan have en negativ indflydelse på kvaliteten af de fryser.
3. OP9-DL1 Co-kultur Procedure
- Præparater co-kultur
- Cirka en uge før påbegyndelse af en co-kultur, optø MEF'er, mESCs og OP9 celle arbejder stocks. Siden OP9-DL1 cellerne ikke er behov for, før co-kultur dag 8, optø de OP9-DL1 celler i løbet af de første tre dage efter co-kultur indvielse. Opretholde eller fryse alle celler efter behov.
- Bestem det oprindelige antal 10 cm plader med OP9 cellemonolagene indstillet på at nå 80% konfluens på co-kultur dag 0 baseret på omfanget af forsøget (f.eks antal Mesc kloner differentieres og antallet af co-kultur tidspunkter til analyseres). For at forberede en co-kultur, delt nær sammenflydende fad af OP9 celler mellem 1: 4 og 1: 6 to dage foran, når der vil være behov monolagene.
BEMÆRK: Man skal bruge mindst én plade pr ESC klon. Typisk en enkelt ESC klon podet på en enkelt plade (som beskrevet nedenfor) på dag 0 bør give nok celler til at pode seks plader på dag 5 passage. Hver dag 5 plade vil muliggøre en efterfølgende analyse tidspunkt. - Da OP9 monolag vil løbende blive behov for co-kultur passage, sørge for at altid maintai et tilstrækkeligt antal yderligere OP9 kultur plader parallelt med co-kultur.
- Dag 0: Iværksættelse af co-kultur
- Saml Mesc som i 2.3.1-2.3.4. Tæl cellerne.
- For hver Mesc klon forberede 5 x 10 4 Mesc i 10 ml OP9 medier pr plade.
BEMÆRK: Selvom vi ikke har brugt det, kan vi konstatere, at en alternativ medium bestående af α-MEM, 10% FBS, og 5 x 10 -5 M β-mercaptoethanol er også blevet rapporteret til brug i differentiering co-kulturer 10. - Fjern gammelt medier fra OP9 skåle og tilsæt 10 ml Mesc suspensionen til de retter, der tager sig at fordele cellerne jævnt over hele pladen. Placer servicet i 37 ° C inkubator.
- Dag 3: Medier forandring
- Fjern retter fra inkubatoren og observere under mikroskop. Kolonier bør begynde at miste shininess og se fladtrykt.
- Fjern medier fra fade og forsigtigt tilsættes 10 ml frisk OP9medier.
- Returnér co-kultur retter til inkubatoren. Visuelt overvåge mesoderm-lignende kolonidannelsen dagligt at informere timingen af OP9 feeder monolag forberedelse til den næste passage (dag 5), som ikke bør udføres indtil ~ 80-90% af kolonierne visuelt vise mesoderm-lignende morfologi. Maksimal udsættelse af dag 5 trin celleoverførslen er 2 dage.
- Dag 5: trypsin medieret passage med pre-plating.
BEMÆRK: Forbered på forhånd et passende antal 10 cm skåle med optimalt sammenflydende OP9 celler. Fortsæt med næste trin, hvis de co-kulturer visuelt viser de funktioner, der er beskrevet i trin 3.3.3 (se også Repræsentative resultater).- Fjern medier fra co-dyrkningsskåle. Tilsæt 4 ml PBS at vaske. Swirl PBS og fjern. Tilsæt 4 ml 0,25% trypsin og placere retterne i inkubator for ~ 5 min.
- Forstyrrer det lag af trypsinerede celler ved kraftig pipettering, pas på ikke at indføre for store luftbobler, indtil enhomogen, hovedsagelig enkelt celle suspension er opnået.
- Tilsæt 4 ml komplet OP9 medier og bland ved pipettering. Overfør celler i en ny, tom 10 cm skål og sted i inkubatoren i 30 min for at tillade OP9 celler til at holde sig til fadet. Denne "pre-plating" trin reducerer antallet af OP9 celler overført til det næste trin i co-kultur.
- Forbered 50 ml centrifugerør med 40 um celle harper.
- Saml ikke-klæbende celler fra præ-belagte fad og passere dem gennem cellefilter ind i røret. Vask skålen forsigtigt med 6 ml PBS og passere det gennem den samme si, hvilket efterlader de vedhæftede OP9 cellerne bag.
- Centrifuger cellerne ved 400 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspender pelleterede celler i 3 ml komplet OP9 medier. Tæl cellerne.
- Fjern mediet fra 10 cm plader med optimalt sammenflydende OP9 celler.
- For hver analyse tidspunkt, frø 5 x 10 5 celler på OP9 monolag i 10 ml slutvolumen.
- Tilføj 5 ng / ml human rekombinant Flt-3L og placere retterne i kuvøse.
- Dag 8: hæmatopoietiske celle (HPC) indsamling
BEMÆRK: Forbered på forhånd et tilstrækkeligt antal plader med 6 brønde med OP9 eller OP9-DL1 cellemonolag, så de vil være ~ 80% sammenflydende i tide til dette trin.- Forbered 50 ml centrifugerør med 40 um harper.
- Fjern retter fra rugemaskinen, og observere under mikroskop. Shiny klynger af HPCs bør være løst knyttet til OP9 monolag. Saml så mange af disse celler som muligt ved vask (men ikke overdrevent forstyrre) den OP9 farves med en pipette og eksisterende medier på skålen. For at undgå skumdannelse, altid efterlade mindst 1 ml af medierne i spidsen af pipetten under denne HPC indsamling / vaske trin.
- Pass cellerne gennem 40 um si i et rør. Tilføj 8 ml PBS til den samme plade og tjek under mikroskop hvis alle HPCs vire samlet. Gentag trin vask / samling med PBS og (om nødvendigt) med mere insisterende vask. Strain cellerne ind i røret, der allerede indeholder celler fra den samme plade.
- Centrifuger cellerne ved 400 x g i 5 minutter ved 4 ° C.
- Forbered en master blanding af 3 ml (per plade podet på dag 5) i OP9 medier med 5 ng / ml Flt-3L og 1 ng / ml IL-7.
- Fjern supernatanten og resuspender pellet i OP9 medier med Flt-3L + IL-7 masterblanding (3 ml for hver 10 cm skål forarbejdede). Overfør opsamlede celler fra hver plade i en brønd af en 6-brønds plade med OP9 celler.
- For at drive celler mod monocytisk, B-celle eller erythroide afstamninger, frø de indsamlede celler på OP9 celler. At udlede T-celler, frø cellerne på OP9-DL1 cellemonolag.
- Placer plader med 6 brønde i kuvøse.
- Dag 10: Medier forandring
- Forbered en 15 ml centrifugerør til hvert enkelt Mesc klon-feeder celletype kombination i co-kultur.
- Der fremstilles en master-blanding af OP9 medier med 5 ng / ml af Flt-3L og 1 ng / ml IL-7. Forbered 3 ml til hver brønd.
- Forsigtigt indsamle medier fra hver brønd i 6-brønds plade kombinerer medier fra flere brønde indeholdende den samme ESC klon feeder celletype kombination.
- Tilsæt 2 ml OP9 Media Master mix (se 3.6.2) i hver brønd.
- Centrifuger indsamlede medier ved 400 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspender hver pellet (meget lille, hvis synlig) i 1 ml OP9 Media Master mix (se 3.6.2) pr godt oprindeligt er indsamlet i trin 3.6.3.
- Fordel 1 ml celler tilbage i hver brønd, hvorfra mediet oprindeligt blev opsamlet bringe mængden i hver brønd til 3 ml. Retur retter til inkubatoren.
- Dag 12: Ingen trypsin passage
BEMÆRK: Forbered på forhånd et tilstrækkeligt antal 6-godt retter med OP9 eller OP9-DL1 celler, så de vil være optimalt sammenflydende i tide til denne sTEP. Dag 12 er ideel til flowcytometri analyser af udviklingen erythroid, monocytær og nyuddannede T-celler.- Forbered en master mix (3 ml til hver brønd, der vil fortsætte i co-kultur) i OP9 medier med 5 ng / ml Flt-3L og 1 ng / ml IL-7.
- Forbered 50 ml centrifugerør med 40 um sier (en for hver ESC klon-feeder celletype kombination i co-kultur).
- Kraftigt pipetteres de eksisterende medier i hver brønd at skelne alle celler (herunder monolaget) i brønden. Fortsæt med kraftig pipettering, indtil en tilstand, der ligner en enkelt celle suspension er opnået.
- Pass de indsamlede celler gennem sien ned i glasset. Tilsæt 3 ml PBS i hver brønd for at vaske og indsamle alle tilbageværende celler. Pass celler gennem den samme si. Kombiner celler fra flere brønde indeholdende samme ESC klon-feeder celletype kombination.
- Kassér den brugte celle si og fjerne en portion svarende til en brønd (~ 6 ml) for ethvert ønsketflowcytometri (eller andre) analyser, der skal udføres på den pågældende dag. Opbevar disse portioner på is før anvendelse.
- Centrifuger cellerne ved 400 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten. Pellet resuspenderes fra 50 ml centrifugerør i 3 ml masterblanding per brønd for at blive re-seedede. Tilsæt 3 ml pr brønd i hver celle suspension til den relevante feeder celletype og placere retterne i inkubatoren.
- Dag 14: Medier forandring
- Følg trinene i afsnit 3.6.
- Dag 16: Ingen trypsin passage
BEMÆRK: Forbered på forhånd 6 brønde retter optimalt sammenflydende OP9 eller OP9-DL1 celler til dette trin.
BEMÆRK: Dag 16 er ideel til flowcytometri analyser af B-lymfocytter og mellemste trin T-celler.- Følg trinene i afsnit 3.7.
- Dag 18: Medier forandring
- Følg trinene i afsnit 3.6.
- Dag 20: Ingen trypsin passage
BEMÆRK: Dag 20 is ideel til flowcytometri analyser af midten til slutningen af fase udvikler T-celler.- Følg trinene i afsnit 3.7. Hvis det ønskes, foretage differentierende celler tidligere dag 20 alternerende skift af medium og ingen trypsin passager hver to dage, med daglig overvågning af lymfocyt udvidelseshastighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når der dyrkes på MEF'er i nærvær af LIF kan mESCs holdes i en udifferentieret tilstand. Under ideelle betingelser, vises de som kompakte kolonier af celler omgivet af en skinnende halogen i fasekontrastmikroskopi (figur 1). Disse kulturer skal overvåges dagligt. Afhængigt sammenløbet af cellerne, kan mediet ændres eller celler kan opdeles. Tilstødende Mesc kolonier bør ikke komme til det punkt i kontakt med hinanden. En normal, sund kultur af udifferentierede mESCs er et vigtigt udgangspunkt for in vitro T-celle-differentiering. Ved indledning af co-kultur, anbefales det, at cellerne er fuldt sammenflydende uden at være overfyldte. Dette er så størstedelen af cellerne høstede podning celler på OP9 monolag er Mesc (snarere end fødeceller). Hvis der observeres store forskelle i sammenløbet blandt differentieres på dag 0 de forskellige Mesc kloner, så ville det være bedst at fjerne MEF'er ved præ-tilslutning til tisSue dyrkningsskåle (som i trin 3.4.3-3.4.6 hjælp komplet ES-celle medier) før tælle mESCs til co-kultur såning.
OP9 celler skal være godt vedligeholdt, før den co-kultur indledning (som beskrevet i afsnit 2.4). Desuden menes det, at OP9 celler mister nogle af deres egenskaber med langvarig kultur og / eller markante stigninger i deres proliferation på 7 Undgå split nøgletal over 1:. 5 under vedligeholdelse af OP9 celler, og kassere kontinuerlige OP9 kulturer efter seks uger, vil bidrage til at undgå disse faldgruber.
Ved indledende cellepodning og celleoverførsel trin i co-kultur (dag 0, 5, 8, 12, 16), OP9 monolag være inden for et optimalt område af konfluens. Figur 2 viser den lave (figur 2A) og høj (figur 2B) ender af den vifte af OP9 cellekonfluens tilrådeligt for brug som co-kultur monolag. Et eksempel på et over-sammenflydende plade er vist i figURE 2C. Manglende opretholde en optimal sammenløb kan inducere dannelse af adipocytter (figur 2D), at der i store mængder, negativt kan påvirke co-kultur.
På dag 0, er co-kultur startede den OP9 celler snarere end OP9-DL1 celler siden mesoderm dannelse er begunstiget på OP9 celler. Celler udplades på OP9-DL1 celler monolag begynder på dag 8 til at inducere T-celle produktion. Mens nogle Mesc kloner visuelt vil vise robust og kvantitative (~ 90%) dannelse af mesoderm-lignende kolonier på dag 5 i co-kultur (figur 3A-B), kan andre vise forsinkelser på dette trin (figur 3C-F). Under mikroskopet har mesoderm-lignende kolonier afledt i dette assay er variabelt beskrevet som ligner vognhjul eller kratere (figur 4A) eller starbursts eller florets (figur 4B).
Mens den offentliggjorte OP9-DL1 protokol afspejler en norm for kvantitativ mesoderm formation ved dag 5 af co-kultur, 7 finder vi, at ikke alle ESC kloner nå dette normen inden for denne tidsramme. I disse tilfælde vi ændre mediet på dag 5 og vente i yderligere 1-2 dage før udførelse af "dag 5" cellehøst / overførsel protokol. Målet med denne forsinkelse er at tillade ~ 80-90% af ES-celle kolonier til visuelt blive mesodermal før overførsel. Det er vigtigt at gøre det klart, at dette 80-90% tal afspejler en strengt visuel kriterium mærkbar ved simpel fasekontrast mikroskopisk inspektion af koloni morfologi i co-kultur retter. Den henviser blot til den andel af ESC kolonier, der ligner dem vist i figur 4. Det er muligt, at nogle ESC kloner ikke vil nå denne visuelle kriterium, selv efter en to-dages forsinkelse. I et sådant tilfælde er det muligt at berige for bloddannende mesodermale forstadier ved hjælp af flowcytometri cellesortering til FLK-1 +-celler, som er blevet beskrevet tidligere. 6,11 Under alle omstændigheder, for saKE nomenklatur skyld har vi "nulstille uret" og henviser til den dag, mesoderm-lignende koloni overførsel som "dag 5."
Når flere ESC-kloner bliver differentieret parallelt, er det muligt, at nogle co-kulturer vil være klar til den dag 5 passagen på tid, mens andre halter bagefter. I dette tilfælde er det tilrådeligt at forsinke passagen af alle de co-kulturer indtil langsommere kloner fange op til de andre. Forsinkelsen synes ikke at gøre nogen skade på de "til tiden" co-kulturer, men gavner den efterfølgende differentiering af de langsommere kloner en hel del.
Dag 8 (dvs. tre dage efter mesodermal koloni Transfer) ser fremkomsten og akkumulering af HPCs. HPC'er er synlige som skinnende klynger af celler, der er løst adhæreret til OP9 feeder-celler (figur 5). En omhyggelig vask procedure, ved hjælp af en pipette og medierne på fadet, vil løsne og indsamle de HPCs mensden OP9 monolag meste intakt (figur 6A-C). Dette er måske den mest teknik-følsomme trin af protokollen. Det tager lidt øvelse at finde passende bevægelser og medier udstødning pres for at opnå den ønskede balance af maksimal høst af HPC'er med minimal afbrydelse af fødelag. Det er acceptabelt, hvis nogle af OP9 monolag løfter slukket, da hovedparten af enhver omstrejfende monolag vil blive fanget i 40 um nylonnet efter filtrering. 6D viser et monolag efter overdreven pipettering fører til større monolag forstyrrelser end nødvendigt. Under dette vasketrin, er det vigtigt at kontrollere under mikroskop, hvorvidt alle HPC'er er blevet indsamlet, og juster vask tryk i overensstemmelse hermed.
Fremskridt i co-kultur kan overvåges ved flowcytometri. Til specifikt at analysere de ikke-erytroide hæmatopoietisk afkom af ESC, er det vigtigt at første port på live CD45 + celler.Dette trin skærme Kampene OP9 celler fra analyserne, mens brugen af DAPI eller anden nuklear farvning farvestof muliggør udelukkelse af ikke-levedygtige celler. Ved dag 12, bør mange klynger af små, runde, skinnende celler være synlige. Det er ikke nødvendigt at tælle cellerne på dette stadium. Men vi har observeret, at levende, gated flowcytometri begivenhedstælling er typisk i området 1-3 x 10 5 per dag 12 co-kultur godt. Flowcytometri analyser af levende-gatede celler differentieres på OP9 monolag vil give erythroide (CD45 neg, TER119 +) og monocytiske (CD45 +, CD11 hi) slægter (figur 7A). Analyser af levende, CD45 + celler differentiere på OP9-DL1 monolag skal afsløre markører karakteristiske af CD4 / CD8 dobbelt negativ (DN) -1 (CD44 +, CD25 neg, CD4 neg, CD8 neg) og DN2 (CD44 +, CD25 + CD4 neg, CD8 neg) etape T-celler (figur 7B ng>). Ved dag 16, er der en betydelig stigning i mængden af små, runde, skinnende celler i kulturerne. På OP9-DL1s, T-celle differentiering produkter fremskridt til DN3 (CD44 neg, CD25 +, CD4 neg, CD8 neg) og DN4 (CD44 neg, CD25 neg, CD4 neg, CD8 neg) etaper. Nogle DP (CD4 +, CD8 +) T-celler kan også begynde at opstå ved dag 16 (figur 7B). HPC'er podet på OP9 celler giver B-celler (CD19 +) ved dag 16. Ved dag 20 af OP9-DL1-Mesc co-kultur, vil der være store mængder af DP T-celler og enkelt positiv (SP) CD8 + T-celler til stede ( Figur 7B). Figur 8 giver et diagram skitserer de vigtigste trin i ovenstående procedure, og de foreslåede analyse tidspunkter i løbet af co-kultur.
ghres.jpg "/>
Figur 1. fasekontrastmikroskopi billede af udifferentierede mESCs (skarpkantede kolonier) vokser på toppen af en MEF monolag (100X forstørrelse).
Figur 2:. Fasekontrastmikroskopi billeder af OP9 monolag sammenflydning (A) Laveste og (B) højeste sammenflydning niveauer tilrådeligt for co-kultur passage / såning (40X forstørrelse) (C) Eksempel på en over-sammenflydende OP9 monolag (40X forstørrelse. ). (D) Over-sammenflydende OP9 monolag (200X forstørrelse) med adipocyt dannelse (store, vesikel indeholdende celler).
Figur 3: Fase kontrast mikroskopety billeder af mesoderm-lignende kolonidannelsen på "dag 5" co-kultur. (A) 40X og (B) 100X visninger af co-kultur plader med> 90% mesodermal koloni differentiering. Disse plader er klar til dag 5 passage. (CF) Eksempler på Dag 5 co-kultur plader, der kræver 1-2 dages udsættelse før overførsel (C & E 40X forstørrelse, D & F, 100X forstørrelse).
Figur 4: fasekontrast mikroskopi billeder af forskellige mesoderm-lignende koloni formationer på dag 5 i co-kultur (A) kolonimorfologi benævnt "kratere" eller (B) kolonimorfologi henvist til. "Vognhjul". som "starburst" eller "buketter" (200X forstørrelse).
Figur 5. fasekontrastmikroskopi billede af dag 8 co-kultur plade med klynger af små, runde, skinnende HPCs på en OP9 monolag (40X forstørrelse).
Figur 6:.. OP9 éncellelag efter HPCs samling på co-kultur dag 8 (AC) passende vifte af afbrydelse af OP9 monolag efter omhyggelig vask at høste HPCs (D) Et eksempel på en OP9 monolag, der har været over-forstyrret af dagen 8 HPC høst procedure.
Figur 7: Repræsentativ flowcytometri (FACS) analyse på bestemte tidspunkter i løbetMesc differentiering in vitro. (A) Farvning for erythroide (venstre), monocytisk (i midten) og B-celle (højre) produkter fra Mesc-OP9 co-kultur på dag 12 eller 16 som angivet. (B) farvning for udvikling af T-celler i de angivne tidspunkter for Mesc-OP9-DL1 co-kultur. Se tekst for detaljerede beskrivelser af de immunfænotyper.
Figur 8. Diagram over de trin i proceduren Mesc-OP9 co-kultur. (A) De vigtigste celleoverførsel trin i de første otte dage af co-kultur. Det omtrentlige antal celler podet på OP9 celler på dag nul og fem er angivet. (B) dag 8 overførsel skridt De og de forventede cellulær differentiering produkter påvist ved flowcytometri på centrale tidspunkter i co-kultur. Se tekst for detaljerede beskrivelser af de immunfænotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den OP9-DL1 co-kultur-systemet er blevet anvendt til at undersøge den rolle, de forskellige genprodukter under udviklingen af blod celletyper fra stamceller. 8,12,13 Det har også vist sig en effektiv model til at studere funktionen af genet regulatorisk DNA under cellulær differentiering. 9,14 Med denne fremgangsmåde som et alternativ til hele musemodeller kan give betydelige besparelser i tid og omkostninger til forsøg, der vedrører mange grundlæggende spørgsmål i hematopoiese. Men tilpasning af denne protokol til disse formål forudsætter kendskab til den potentielle variabilitet blandt Mesc kloner, der ville blive anvendt i disse procedurer. Tidslinjen af den offentliggjorte protokol er expectable fra gennemsnittet, velholdt, ikke-manipulerede Mesc linje. 7 Desuden Mesc kloner udvalgt til generering af kimære mus sædvanligvis er af højere kvalitet og vil udføre meget håndfast i OP9 co-kultur . På den anden side, Mesc kloner vej direkte fra staldtransfektion med en ectopically integreret transgen vil vise varierende grader af indledende differentiering effektivitet spænder fra gennemsnit til under gennemsnittet. Protokollen beskrevet her giver en strategisk 1-2 dages forsinkelse af dagen trin 5 passage at udjævne disse potentielle forskelle inden induktion af hæmatopoiese in vitro.
Dagen 8 passage er det trin, hvor gennemførelsen af denne protokol har det største potentiale for fejl. Tålmodighed, praksis og omhyggelig observation vil gøre det muligt at udvikle den teknik, der optimerer HPC høst samtidig minimere OP9 monolag forstyrrelser. Ud over de vigtigste dag 5 og dag 8 trin, de kritiske parametre involverer omhyggelig vedligeholdelse cellekultur (især OP9 celler, som beskrevet ovenfor) og særlig opmærksomhed på de anvendte reagenser i protokollen. Det mest kritiske reagens er FBS. Distinct masser af FBS vil variere markant i deres evne til at understøtte denne procedure. Flere partier skal testes i order at bestemme, hvilke vil give solid differentiering i dette assay.
Denne co-kultur-systemet har sine begrænsninger. For eksempel er denne model ikke understøtter differentiering af enkelte positive CD4-celler. En grund til dette er manglen på ekspression af det større histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse II antigenpræsentation infrastruktur i OP9 celler. 1 Celleoverfladeekspression præsentation af antigener af MHC-klasse II er nødvendig for korrekt udvikling af CD4 SP-celler. De CD8 SP celler, der opstår repræsenterer en blanding af modne og umodne CD8 SP thymocyt etaper. 1. Endvidere vellykkede transplantation af Mesc afledt T-stamceller i en mus kræver forudgående passage gennem føtal thymus orgel kultur. 1 desto mindre er denne teknologi har bevist sin lover som en stærk undersøgende tilgang til både cellulære og molekylære spørgsmål i blod og immunsystem udvikling, der tidligere kun er muligt at udforske i vIvo. Således bortset fra at give en ny måde at gøre hurtigere fremskridt på disse spørgsmål, bredere anvendelse af den OP9-ESC co-kultur system vil have den almene virkning af at reducere brugen af forsøgsdyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Stem cell qualified FBS | Gemini | 100-125 | Heat inactivated |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| L-alanyl L-glutamine | Corning | 25-015-CI | |
| HEPES buffer | Millipore | TMS-003-C | |
| Non-Essential Amino Acids | ThermoScientific | SH30853.01 | |
| Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml) | Life Technologies | 15750-060 | |
| β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS | Life Technologies | 21985-023 | |
| Filter Unit | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm PES membrane |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CM | |
| α-MEM | Life Technologies | 12000-022 | Powder, reconstitute per manufacture recommendation |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| FBS | ThermoScientific | SH 30396.03 | Testing of individual lots required |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma | D2650 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand | R&D Systems | 308-FK | |
| Recombinant Murine IL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| Utrapure water with 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| MEFs mitomycin C treated | Millipore | PMEF-CF | Any mitotically arresteded MEFs can be used |
| DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| Cell strainer (40 μm) | Fisher | 22363547 | |
| Tissue culture dish 100 x 20 mm | BD Falcon | 353003 | |
| Multiwell 6-well | BD Falcon | 353046 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | Tubes for FACS |
| ES R1 cells | ATCC | SCRC-1011 | |
| OP9 cells | Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan). | ||
| OP9-DL1 cells | Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory. | ||
| FlowJo software | Tree Star | FACS data analyses | |
| Flow Cytometer | BD | FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab |
References
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
- Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
- de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
- Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
- Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
- Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
- Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
- de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
- Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
- Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).
