Protocol
1 Preparazione della Cultura Media, Citochine e piatti gelatinizzato
- Preparare supporti cellule ES utilizzando Modifica Dulbecco di Eagle Medium (DMEM) con alte concentrazioni di glucosio e piruvato di sodio. Aggiungere 20% ESC Qualificato Fetal Bovine Serum (FBS), 1% di penicillina / streptomicina, 1% L-glutammina, 1% HEPES Buffer, 1% non-aminoacidi essenziali, gentamicina 0,1% (50 mg / ml) e 0,1% ( 55 mM) β-mercaptoetanolo. Sterilizzare supporti cellule ES per filtrazione.
- Preparare supporti OP9 facendo 1 L di Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) da polvere secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 20% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina. Miscelarlo. Sterilizzare per filtrazione in due aliquote da 500 ml.
NOTA: è consigliato e rischia di produrre una migliore manutenzione delle cellule OP9 e nei risultati di differenziazione in vitro L'uso di supporti a base di polvere. Questo approccio è diventato la nostra procedura standard. Tuttavia, notiamo anche that abbiamo a volte usato liquido pre-fatte α-MEM con un adeguato successo. - Preparare il congelamento dei media con l'aggiunta del 10% dimetilsolfossido (DMSO) al 90% FBS. Agitare delicatamente e sterilizzare per filtrazione. Conservare a 4 ° C.
- Preparare 2,000x Flt-3 ligando (10 mg / ml) sciogliendo ricombinante umano Flt-3 ligando (Flt-3L) in mezzi OP9 completo a 10 mcg / ml. Aliquota in provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -80 ° C. Seguire le raccomandazioni del fornitore per quanto riguarda la stabilità e lo stoccaggio.
NOTA: La stabilità di Flt-3L è breve (1 mese a 4 ° C o 3 mesi a -80 ° C). - Preparare 1,000x IL-7 (1 mg / ml) utilizzando mezzi OP9 completo. Aliquota in provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -80 ° C. Seguire le raccomandazioni del fornitore sulla stabilità e la conservazione (IL-7 è stabile fino a 12 mesi a -80 ° C).
- Preparare 1,000x leucemia inibitorio Factor (LIF) (10 mg / ml) da una diluizione 1:10 del 10 7 unità di LIF in supporti cellule ES. Conservare aliquota a 4 ° C. Assicurarsi di annotare la data di scadenza prevista dal fabbricante sulle fiale aliquote.
NOTA: Il prodotto è stabile in forma concentrata o diluita almeno 18 mesi dalla data di produzione. - Preparare 6 pozzetti gelatinizzati da aggiungere 1,5 ml di 0,1% soluzione di gelatina in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Lasciare piatti nella cappa sterile a temperatura ambiente con coperchi su, permettendo almeno 30 minuti per il rivestimento. I piatti possono anche essere lasciati in un incubatore umidificato durante la notte. Rimuovere eventuali residui di soluzione di gelatina a destra prima semina delle cellule. Non lasciate che la soluzione di gelatina completamente asciugare nel pozzo.
2 Preparazione e manutenzione di cellule di alimentazione e di cellule staminali embrionali di topo (Mesc)
NOTA: Incubare tutte le celle in un umidificata 37 ° C incubatore con il 5% di CO 2.
- Scongelamento fibroblasti embrionali di topo (MEF)
- Quick-scongelare una fiala congelata (~ 5 x 10 6
- Aggiungere 8 ml di mezzi di cellule staminali alle cellule scongelati, in modo goccia a goccia per diluire gradualmente il DMSO dal mezzo congelamento.
- Centrifugare le cellule a 400 x g a 4 ° C per 5 min. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3 ml di media cellulare ES.
- Preparare una provetta da centrifuga da 50 ml con 33 ml di supporti pre-riscaldato cellule ES. Aggiungere 3 ml di MEF risospeso a portare il volume finale di 36 ml.
- Distribuire 3 ml del MEF risospeso in ciascun pozzetto di due piastre gelatinizzato 6 pozzetti. Posizionare le piastre in incubatore per almeno sei ore per consentire alle cellule di fissare e sparsi prima della semina i mESCs su di loro. Questi strati alimentatore mitoticamente arrestati potrebbero essere utilizzabili per diversi giorni dopo la semina iniziale, se i loro media viene cambiato ogni 2-3 giorni.
NOTA: MEF di recente arrestati possono anche essere utilizzati. </ Ol>
- MESCs Semina
- Quick-scongelare un flaconcino con un clone Mesc congelato nel bagno di 37 ° C l'acqua e preparare le celle come descritto in 2.1.1-2.1.3.
NOTA: congelare 2 fiale di Mesc da un pozzo confluente di un 6-pozzetti. - Rimuovere i supporti da un pozzetto (per Mesc clone) del 6 pozzetti con monostrati MEF arrestati (preparati nel passaggio 2.1.5) e seminare il 3 ml di mESCs sulla parte superiore del monostrato MEF. Aggiungere 3 ml di 1,000x LIF (10 ng / ml). Piatti Rientro in incubatrice.
- Quick-scongelare un flaconcino con un clone Mesc congelato nel bagno di 37 ° C l'acqua e preparare le celle come descritto in 2.1.1-2.1.3.
- ES manutenzione delle cellule e il passaggio tripsina mediata
NOTA: Modificare supporti quotidiani, o Spalato sulla base di confluenza di Mesc. In modo ottimale, la raccolta e split / re-piastra le cellule a giorni alterni.- Rimuovere i supporti di cellule ES e lavare mESCs con 2 ml di PBS. Rimuovere PBS. Aggiungere 1 ml di 0,25% tripsina e incubare a 37 ° C per 3-5 min.
- Raccogliere le cellule trypsinized e trasferirli in una provetta da centrifuga 15 ml. Pipettare vigorosamente la sospensione cellulare per rompere ciuffi di mCES. Aggiungere 2 ml di completo supporto cellula ES alla sospensione cellulare per neutralizzare la tripsina.
- Cellule Spin a 400 x g per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 3 ml ES supporto cellulare.
- Rimuovere i supporti da 6 pozzetti contenenti preparati monostrati MEF arrestati. Aggiungere la quantità appropriata di sospensione cellulare (in base al rapporto di divisione desiderato) in 3 ml di supporti cellule ES in ciascun pozzetto per essere seminati. Aggiungere 3 ml di 1,000x LIF. Un confluenti Mesc ben diviso 1: 6 sarà pronto per il passaggio in 2 giorni.
- OP9 / mantenimento delle cellule OP9-DL1
- Scongelare una fiala di cellule OP9 (seguire la procedura 2.1.1-2.1.3 utilizzando supporti OP9)
- Aggiungere 7 ml OP9 media per 10 centimetri piatto di coltura di tessuti. Aggiungere 3 ml di cellule risospese in maniera goccia a goccia, la distribuzione di cellule in tutta la piastra. Posizionare le cellule durante la notte in incubatrice.
- Controllare la confluenza delle cellule OP9 il giorno successivo. Se il piatto contiene molte cellule galleggianti morte, remove media e aggiungere 10 ml di media OP9 fresco. Riportare il piatto per l'incubatore se quasi piena confluenza non si osserva. Split (utilizzando tripsina) 1: 4 prossimo monostrato confluente OP9.
NOTA: Le piastre devono raggiungere di nuovo allo stesso livello confluenza in circa 2 giorni. Fare attenzione a non lasciare che le cellule OP9 diventare over-confluenti. - Congelare i primi passaggi di cellule OP9 come scorte di espansione.
NOTA: congelare 2 fiale di cellule OP9 da un vicino confluenti 10 centimetri piatto. Ogni flaconcino di espansione magazzino può essere ulteriormente propagato per creare scorte di lavoro che vengono poi utilizzati in Mesc esperimenti di co-coltura. Tenere tutti gli stock OP9 congelati in azoto liquido piuttosto che nel -80 ° C freezer, dal momento che le temperature fluttuanti possono influenzare negativamente la qualità delle blocca.
3. OP9-DL1 Co-cultura Procedura
- Preparazioni di co-coltura
- Circa una settimana prima dell'inizio di una co-coltura, scongelare MEF, mESCs e sto lavorando cellulare OP9CKS. Poiché le cellule OP9-DL1 non sono necessari fino a co-coltura giorno 8, scongelare le cellule OP9-DL1 durante i primi tre giorni dopo co-coltura iniziazione. Mantenere o congelare tutte le cellule, se necessario.
- Determinare il numero iniziale di 10 cm piastre con monostrati cellulari OP9 pronti a raggiungere l'80% di confluenza in co-coltura giorno 0 in base alla scala dell'esperimento (ad esempio, il numero di cloni Mesc per differenziare e il numero di co-coltura punti di tempo a da analizzare). Per preparare una co-coltura, diviso nei pressi di piatto confluenti di cellule OP9 tra 1: 4 e 1: 6 due giorni prima di quando saranno necessari i monostrati.
NOTA: Uno sarà bisogno di almeno una piastra per ogni ESC clone. Tipicamente, un singolo clone ESC seminato su un singolo piatto (come descritto sotto) al giorno 0 dovrebbe produrre abbastanza cellule per seminare sei piatti al giorno 5 di passaggio. Ogni piastra giorno 5 consentirà un certo punto volta successiva analisi. - Dal monostrati OP9 saranno continuamente necessari per il passaggio co-coltura, aver cura di sempre maintain un numero adeguato di ulteriori piastre di coltura OP9 in parallelo con la co-coltura.
- Giorno 0: Avvio di co-coltura
- Raccogliere Mesc come in 2.3.1-2.3.4. Contare le cellule.
- Per ogni clone Mesc preparare 5 x 10 4 Mesc in 10 ml di OP9 supporti per piastra.
NOTA: Anche se non abbiamo usato, notiamo che un mezzo alternativo composto da α-MEM, 10% FBS, e 5 x 10 -5 M β-mercaptoetanolo è stato segnalato anche per l'uso in differenziazione co-colture 10. - Rimuovere vecchi media da OP9 piatti e aggiungere 10 ml di sospensione Mesc ai piatti avendo cura di distribuire le cellule in modo uniforme in tutta la piastra. Porre le capsule nella C incubatore 37 °.
- 3 ° giorno: Cambio media
- Togliere i piatti dal termostato e osservare al microscopio. Colonie dovrebbero cominciare a perdere lucentezza e appaiono appiattite.
- Rimuovere i supporti dai piatti e aggiungere delicatamente 10 ml di fresca OP9media.
- Restituire i piatti co-coltura per l'incubatrice. Visivamente monitorare la formazione di colonie mesoderma-come ogni giorno per informare i tempi di preparazione OP9 alimentatore monostrato per il passaggio successivo (giorno 5), che non deve essere effettuata fino a ~ 80-90% delle colonie visualizzare visivamente mesoderma simile morfologia. Massima rinvio della fase di trasferimento di cellule giorno 5 è di 2 giorni.
- Giorno 5: tripsina passaggio mediato con pre-placcatura.
NOTA: Preparare in anticipo un numero adeguato di 10 cm piatti con le cellule OP9 ottimale confluenti. Procedere con le fasi successive solo se le co-colture mostrano visivamente le caratteristiche descritte al punto 3.3.3 (vedi risultati anche Rappresentante).- Rimuovere i supporti dai piatti di co-coltura. Aggiungere 4 ml di PBS per lavare. Agitare il PBS e rimuovere. Aggiungere 4 ml di 0,25% tripsina e posizionare i piatti in incubatrice per ~ 5 min.
- Interrompere lo strato di cellule trypsinized di pipettaggio vigoroso, facendo attenzione a non introdurre eccessive bolle d'aria, fino a quando un, sospensione di cellule per lo più unico omogeneo si ottiene.
- Aggiungere 4 ml di media OP9 completi e mescolare pipettaggio. Trasferire le cellule in un nuovo, piatto 10 centimetri vuoto e posto in incubatrice per 30 minuti per permettere alle cellule OP9 di aderire al piatto. Questa fase "pre-plating" riduce il numero di cellule OP9 trasferiti alla fase successiva di co-coltura.
- Preparare 50 ml provette con filtri di cella di 40 micron.
- Raccogliere le cellule non aderenti dal piatto pre-plated e farli passare attraverso il filtro delle cellule nel tubo. Lavare il piatto delicatamente con 6 ml di PBS e farla passare attraverso lo stesso filtro, lasciando le cellule OP9 attaccate dietro.
- Centrifugare le cellule a 400 x g 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e sospendere nuovamente le cellule pellet in 3 ml di media OP9 completo. Contare le cellule.
- Rimuovere i supporti da 10 cm piastre con cellule OP9 ottimale confluenti.
- Per ogni punto di tempo di analisi, seminare 5 x 10 5 cellule in mono OP9strato in 10 ml di volume finale.
- Aggiungere 5 ng / ml umana ricombinante Flt-3L e posizionare i piatti in incubatrice.
- 8 ° giorno: emopoietiche progenitrici delle cellule (HPC) di raccolta
NOTA: Preparare in anticipo un numero adeguato di 6 pozzetti con monostrati OP9 o OP9-DL1 cellule in modo che essi saranno in ~ 80% confluenti in tempo per questa fase.- Preparare 50 ml provette da centrifuga con 40 micron filtri.
- Togliere i piatti dal termostato e osservare al microscopio. Cluster Shiny di HPC devono essere liberamente fissati alla monostrato OP9. Raccogliere il maggior numero di queste cellule come possibile lavando (ma non eccessivamente interrompere) il monostrato OP9 con una pipetta e la media esistenti sul piatto. Per evitare la formazione di schiuma, lasciare sempre almeno 1 ml di media nella punta della pipetta durante questa collezione HPC / fase di lavaggio.
- Far passare le cellule attraverso il filtro 40 micron in un tubo. Aggiungere 8 ml di PBS alla stessa piastra e controllare al microscopio se tutti HPC noiri raccolti. Ripetere la fase di lavaggio / collezione con PBS e (se necessario) con il lavaggio più forte. Scolare le cellule in provetta già contenente le cellule dallo stesso piatto.
- Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 minuti a 4 ° C.
- Preparare una master mix di 3 ml (per piastra seminata il giorno 5), dei mezzi di comunicazione OP9 con 5 ng / ml Flt-3L e 1 ng / ml di IL-7.
- Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in mezzi OP9 con Flt-3L + IL-7 Master Mix (3 ml per ogni piatto 10 centimetri trasformati). Trasferire le cellule raccolte da ogni piatto in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti con cellule OP9.
- Al fine di guidare le cellule verso monociti, cellule B o lignaggi eritroidi, seminare le cellule raccolte sulle cellule OP9. Per ricavare cellule T, seminare le cellule su monostrati di cellule OP9-DL1.
- Posizionare le piastre da 6 pozzetti in incubatrice.
- Giorno 10: Cambio media
- Preparare una provetta da centrifuga da 15 ml per ogni distinto mesc clone-alimentatore tipo di cellula combinazionizione in co-coltura.
- Preparare una master mix di mezzi OP9 con 5 ng / ml di Flt-3L e 1 ng / ml di IL-7. Preparare 3 ml per ogni bene.
- Raccogliere delicatamente i media da ciascun pozzetto della piastra da 6 pozzetti che combina supporti da più pozzetti contenenti la stessa combinazione di tipo cellulare ESC clone-alimentatore.
- Aggiungere 2 ml di master mix multimediale OP9 (vedi 3.6.2) in ogni pozzetto.
- Centrifugare la media raccolti a 400 x g per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere ogni pellet (molto piccola se visibile) in 1 ml di OP9 master mix dei media (vedi 3.6.2) per pozzetto originariamente raccolti nella fase 3.6.3.
- Distribuire 1 ml di cellule di nuovo in ogni pozzetto da cui il supporto è stato originariamente raccolti portando il volume in ogni pozzetto a 3 ml. Riportare i piatti per l'incubatrice.
- Giorno 12: Nessun passaggio tripsina
NOTA: Preparare in anticipo un numero adeguato di piatti 6 pozzetti con cellule OP9 o OP9-DL1 in modo che essi saranno in modo ottimale confluenti in tempo per questo step. Giorno 12 è ideale per la citometria di flusso analisi di sviluppo eritroide, monociti e cellule T early stage.- Preparare una master mix (3 ml per ogni bene che continuerà in co-coltura) dei media OP9 con 5 ng / ml di Flt-3L e 1 ng / ml di IL-7.
- Preparare 50 ml provette da centrifuga con 40 micron filtri (uno per ogni ESC clone-alimentatore tipo di cellula combinazione in co-coltura).
- Pipettare vigorosamente i media esistenti in ciascun pozzetto di disaggregare tutte le cellule (tra cui il monostrato) nel pozzo. Continuare con pipettaggio forte fino a raggiungere uno stato simile ad una sospensione di cellule singole.
- Passare le cellule raccolte attraverso il filtro nel tubo. Aggiungere 3 ml di PBS in ogni pozzetto per lavare e raccogliere tutte le cellule rimanenti. Passare cellule attraverso lo stesso filtro. Combinare le cellule da più pozzetti contenenti la stessa combinazione di tipo cellulare ESC clone-alimentatore.
- Eliminare il filtro cella utilizzata e rimuovere un equivalente aliquota da un pozzetto (~ 6 ml) per ogni desideratocitometria a flusso (o altro) analisi da effettuare in quel giorno. Conservare queste aliquote sul ghiaccio prima dell'uso.
- Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet dai tubi centrifuga da 50 ml a 3 ml di Master Mix per pozzetto di essere ri-seminato. Aggiungere 3 ml per pozzetto di ciascuna sospensione cellulare al tipo di cellula alimentatore appropriato e mettere i piatti in incubatrice.
- Giorno 14: Cambio media
- Seguire la procedura descritta nella sezione 3.6.
- Giorno 16: Nessun passaggio tripsina
NOTA: Preparare in anticipo piatti da 6 pozzetti di cellule OP9 o OP9-DL1 confluenti in modo ottimale per questo passo.
NOTA: Giorno 16 è ideale per citometria a flusso di analisi dei linfociti B e le cellule T fase centrale.- Seguire la procedura descritta nella sezione 3.7.
- Giorno 18: Cambio media
- Seguire la procedura descritta nella sezione 3.6.
- Giorno 20: Nessun passaggio tripsina
NOTA: Giorno 20 is ideale per citometria a flusso analisi di metà a fine fase di sviluppo le cellule T.- Seguire la procedura descritta nella sezione 3.7. Se lo si desidera, effettuare differenziazione delle cellule passato giorno 20 cambiamento alternata media e non tripsina passaggi ogni due giorni, con monitoraggio giornaliero del tasso di espansione dei linfociti.
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Representative Results
Quando coltivate su MEF, in presenza di LIF, mESCs possono essere mantenuti in uno stato indifferenziato. In condizioni ideali, appaiono come colonie compatti di cellule circondate da un alone lucido in microscopia a contrasto di fase (Figura 1). Tali colture devono essere monitorati quotidianamente. In base alla confluenza delle cellule, i media possono essere cambiati o cellule possono essere divise. Limitrofe colonie Mesc non dovrebbero venire al punto di contatto uno con l'altro. Un normale, sana cultura della mESCs indifferenziati è un punto di partenza essenziale per il differenziamento in vitro delle cellule T in. Dopo l'inizio della co-coltura, si raccomanda che le cellule siano completamente confluenti senza essere sovraffollata. Questo è così la maggior parte delle cellule raccolte per la semina di cellule su monostrati OP9 sono Mesc (piuttosto che cellule di alimentazione). Se grandi differenze di confluenza si osservano tra i vari cloni Mesc essere differenziati al giorno 0, allora sarebbe meglio rimuovere MEF pre-adesione al TISpiatti della cultura Sue (come nel passaggio 3.4.3-3.4.6 utilizzando completo supporto di cellule ES) prima di contare i mESCs per co-coltura semina.
Cellule OP9 devono essere ben mantenuti prima dell'inizio di co-coltura (come descritto nella sezione 2.4). Inoltre, si ritiene che OP9 cellule perdono alcune delle loro proprietà con la cultura prolungata e / o aumenti pronunciati nel loro tasso di proliferazione 7 Evitare rapporti spezzati oltre 1:. 5 durante la manutenzione di OP9 cellule, e scartando le culture OP9 continui dopo sei settimane, contribuirà a evitare queste trappole.
Alla semina cellulare e trasferimento cella fasi iniziali della co-coltura (giorno 0, 5, 8, 12, 16), monostrati OP9 dovrebbero essere entro un range ottimale di confluenza. Figura 2 mostra il basso (Figura 2A) e alto (Figura 2B) termina la gamma di OP9 confluenza delle cellule consigliato per l'uso come monostrati co-coltura. Un esempio di piastra su-confluente è mostrato in figURE 2C. Il mancato mantenimento confluenza ottimale può indurre la formazione di adipociti (Figura 2D) che, in grandi quantità, possono influenzare negativamente la co-coltura.
Il giorno 0, la co-coltura è iniziato il OP9 cellule piuttosto che OP9-DL1 cellule in quanto la formazione di mesoderma è favorito su OP9 cellule. Le cellule sono piastrate su OP9-DL1 cellule monostrati inizio il giorno 8 per indurre la produzione delle cellule T. Mentre alcuni cloni Mesc mostreranno visivamente (~ 90%), la formazione robusta e quantitativa delle colonie mesoderma-come di giorno 5 di co-coltura (Figura 3A-B), altri possono visualizzare ritardi in questa fase (Figura 3C-F). Sotto il microscopio, le colonie mesoderma-come derivati in questo saggio sono stati variamente descritto come somigliante ruote di carro o crateri (Figura 4A) o, starburst o ornamenti (Figura 4B).
Mentre il protocollo OP9-DL1 pubblicato riflette una norma di mesoderma forma quantitativazione di giorno 5 di co-coltura, 7 troviamo che non tutti i cloni CES raggiungere quella norma entro questo lasso di tempo. In questi casi, cambiamo il mezzo il giorno 5 e aspettiamo un ulteriore 1-2 giorni prima di effettuare l'/ protocollo di trasferimento "giorno 5", la raccolta delle cellule. L'obiettivo di questo ritardo è di consentire ~ 80-90% delle colonie di cellule ES di mesodermica diventare visivamente prima del trasferimento. E 'importante chiarire che questa figura 80-90% riflette un criterio riconoscibile strettamente visivo semplice contrasto di fase ispezione microscopica della morfologia delle colonie nei piatti co-coltura. Si riferisce solo alla percentuale di colonie CES che assomigliano a quelli mostrati in figura 4. E 'possibile che alcuni cloni CES non raggiungeranno tale criterio visivo, anche dopo un ritardo di due giorni. In tal caso, è possibile arricchire sangue per formare precursori mesodermiche mediante citometria a flusso delle cellule di smistamento per 1-FLK + cellule, come è stato precedentemente descritto. 6,11 In ogni caso, per la sake di nomenclatura convenienza, abbiamo "resettare l'orologio" e si riferisce al giorno del mesoderma simile trasferimento colonia come "il giorno 5"
Quando più cloni ESC vengono differenziati in parallelo, è possibile che alcuni co-colture saranno pronti per il giorno 5 passaggio sul tempo, mentre altri restano indietro. In questo caso, si consiglia di ritardare il passaggio di tutti i co-colture fino cloni lenti raggiungono gli altri. Il ritardo sembra non fare alcun danno ai "a tempo" co-culture, ma avvantaggia la successiva differenziazione dei cloni più lenti un grande affare.
Giorno 8 (cioè, tre giorni dopo mesodermica trasferimento colonia) vede la nascita e l'accumulo di HPC. HPC sono visibili come ammassi lucidi di cellule che sono liberamente aderito alle cellule di alimentazione OP9 (Figura 5). Una procedura di lavaggio attento, con una pipetta e dei media sul piatto, si staccherà e raccogliere le HPC lasciandoil monostrato OP9 per lo più intatto (Figura 6A-C). Questo è forse il più step tecnica sensibile del protocollo. Ci vuole un po 'di pratica per trovare i movimenti appropriati e pressione mediatica espulsione per raggiungere l'equilibrio desiderato di raccolta massima di HPC con il minimo disturbo dello strato dell'alimentatore. E 'accettabile se alcuni dei monostrato OP9 solleva, dal momento che la maggior parte di qualsiasi monostrato randagio verrà catturato nelle maglie di nylon di 40 micron dopo la filtrazione. Figura 6D mostra un monostrato dopo eccessivo pipettaggio portando ad una maggiore perturbazione monostrato del necessario. Durante questa fase di lavaggio, è importante controllare al microscopio o meno tutti gli HPC sono stati raccolti, e regolare la pressione di lavaggio di conseguenza.
Progressi della co-coltura può essere monitorato mediante citometria di flusso. Per analizzare in particolare la progenie ematopoietiche non-eritroide del CES, è importante primo cancello a CD45 + cellule dal vivo.Questi schermi uscire le cellule OP9 dalle analisi, mentre l'uso di DAPI o altri colorazione nucleare colorante permette l'esclusione delle cellule non vitali. Di giorno 12, molti ammassi di piccole, rotonde, cellule lucidi devono essere visibili. Non è necessario contare le cellule in questa fase. Ma abbiamo osservato che vivere, conteggi degli eventi citometria a flusso gated sono tipicamente nel range di 1-3 x 10 5 al giorno 12 co-coltura bene. Citometria a flusso analisi di cellule vive-gated differenziati in monostrato OP9 produrrà eritroide (CD45 neg, TER119 +) e monociti (CD45 +, CD11b hi) lignaggi (Figura 7A). Analisi di, CD45 + cellule vive differenziazione sul OP9-DL1 monostrati dovrebbe rivelare marcatori caratteristici di CD4 / CD8 doppio negativo (DN) -1 (CD44 +, CD25 neg, neg CD4, CD8 neg) e DN2 (CD44 +, CD25 +, neg CD4, CD8 neg) cellule fase T (Figura 7B ng>). Di giorno 16, vi è un aumento significativo della quantità di piccole, rotonde, cellule lucido in culture. Su OP9-DL1s, T prodotti di differenziazione cellulare progresso al (neg CD44, CD25 +, CD4 neg, CD8 neg) DN3 e DN4 (CD44 neg, CD25 neg, neg CD4, CD8) NEG fasi. Alcuni DP (CD4 +, CD8 +), le cellule T possono anche iniziare emergente dal giorno 16 (Figura 7B). HPC seminato su OP9 cellule producono cellule B (CD19 +) dal giorno 16 Di giorno 20 di OP9-DL1-mesc co-coltura, ci saranno grandi quantità di cellule T e DP singolo positivi (SP), le cellule T CD8 + (presenti Figura 7B). Figura 8 fornisce un diagramma che riassume i punti chiave delle procedure di cui sopra, ed i punti di tempo di analisi suggerite durante la co-coltura.
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Figura 1 Fase immagine microscopio a contrasto di mESCs indifferenziati (colonie taglienti) che crescono sulla cima di un monostrato MEF (ingrandimento 100X).
Figura 2:.. Immagini di fase microscopio a contrasto di OP9 monostrato confluenza (A) (B) più alti livelli di confluenza consigliabili per la co-coltura di passaggio / seeding (40X di ingrandimento) (C) Esempio di un over-confluenti OP9 monostrato (40X di ingrandimento più basso e ). (D) Over-confluenti OP9 monostrato (200 ingrandimenti) con formazione di adipociti (grande, vescicola contenente, le cellule).
Figura 3: Phase microscop contrastoimmagini y di formazione di colonie mesoderma simile al "giorno 5" di co-coltura. (A) e 40X (B) 100X vista su piastre di co-coltura con> 90% di differenziazione del mesoderma colonia. Questi piatti sono pronti per il giorno 5 di passaggio. (CF) Esempi di piastre Giorno 5 co-coltura che richiedono 1-2 giorni rimandare prima del trasferimento (C & E, 40X di ingrandimento, D & F, ingrandimento 100X).
Figura 4: Fase immagini di microscopia di contrasto della varietà di formazioni colonia mesoderma simile al giorno 5 di co-coltura (A) La morfologia delle colonie denominate "crateri" o (B) La morfologia delle colonie di cui. "Ruota del carro". come "starburst" o "ornamenti" (ingrandimento 200X).
Figura 5 Fase immagine microscopio a contrasto di giorno 8 piastra di co-coltura con grappoli di piccoli, rotondi, HPC lucido su un monostrato OP9 (40X di ingrandimento).
Figura 6:.. OP9 monostrato dopo la raccolta HPC in co-coltura giorno 8 (AC) appropriata gamma di interruzione di OP9 monostrato dopo un attento lavaggio a raccogliere HPC (D) Un esempio di un monostrato OP9 che è stato troppo sconvolto dal giorno procedura di raccolta 8 HPC.
Figura 7: citometria a flusso Rappresentante (FACS) analizza in particolare i punti di tempo durante iMesc differenziazione in vitro. (A) Colorazione per eritroide (a sinistra), monocitica (al centro) e cellule B (destra) prodotti di mesc-OP9 co-cultura al giorno 12 o 16, come indicato. (B) di colorazione per lo sviluppo di cellule T nei punti temporali indicati di mesc-OP9-DL1 co-coltura. Si prega di vedere il testo per le descrizioni dettagliate dei immunofenotipi.
Figura 8 Schema delle fasi della procedura mesc-OP9 co-coltura. (A) Le fasi di trasferimento delle cellule principali dei primi otto giorni di co-coltura. Il numero approssimativo di cellule seminate su cellule OP9 a giorni sono indicati zero e cinque. (B) La fase di trasferimento il giorno 8 ed i prodotti di differenziazione cellulare attesi rilevati mediante citometria di flusso a timepoints chiave di co-coltura. Si prega di vedere il testo per le descrizioni dettagliate dei immunofenotipi.
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Discussion
Il sistema OP9-DL1 co-coltura è stata utilizzata per studiare il ruolo dei vari prodotti genici durante lo sviluppo di tipi di cellule del sangue da cellule staminali. 8,12,13 Ha anche dimostrato un modello efficace per studiare la funzione del gene DNA normativo durante il differenziamento cellulare. 9,14 Usando questo approccio come alternativa ai modelli interi mouse possono produrre un notevole risparmio di tempo e costi di esperimenti che affrontano molte questioni fondamentali in ematopoiesi. Tuttavia, l'adattamento di questo protocollo per questi scopi richiede conoscenza del potenziale variabilità tra i cloni Mesc che sarebbero stati utilizzati in queste procedure. La timeline del protocollo pubblicato è prevedibile dalla media, ben curato, non manipolata linea Mesc. 7 Inoltre, cloni Mesc selezionati per la generazione di topi chimerici di solito sono di qualità superiore e si esibiranno molto robusta in OP9 co-coltura . D'altra parte, cloni Mesc emergente direttamente da stabiletrasfezione con un transgene ectopicamente integrato mostrerà diversi gradi di efficienza differenziazione iniziale che va da media a media sotto. Il protocollo qui descritto prevede un ritardo strategico 1-2 giorno del passaggio 5 giorno passo per appianare queste differenze di potenziale prima di induzione di emopoiesi in vitro.
Il giorno 8 il passaggio è la fase in cui l'esecuzione del presente protocollo ha il maggior potenziale di errore. Pazienza, la pratica e l'osservazione attenta consentirà di sviluppare una tecnica che ottimizza raccolto HPC riducendo al minimo disagi OP9 monostrato. Al di là delle chiavi il giorno 5 e il giorno 8 passi, i parametri critici riguardano meticolosa manutenzione di colture cellulari (cellule particolarmente OP9, come descritto sopra) e particolare attenzione ai reagenti utilizzati nel protocollo. Il reagente più critica è la FBS. Distinti lotti di FBS variano notevolmente nella loro capacità di sostenere questa procedura. Lotti multipli devono essere testati in order per determinare che produrrà la differenziazione robusta in questo test.
Questo sistema di co-coltura ha i suoi limiti. Ad esempio, questo modello non supporta la differenziazione delle singole cellule CD4 positive. Una ragione di questo è la mancanza di espressione del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) classe II infrastrutture presentazione dell'antigene nelle cellule OP9. È richiesta la presentazione di superficie 1 Cella di antigeni da MHC di classe II per il corretto sviluppo delle cellule CD4 SP. Le cellule CD8 SP che fanno emergere rappresentano un mix di fasi di timociti CD8 SP mature e immature. 1, inoltre, con successo il trapianto di Mesc derivato progenitori delle cellule T in un mouse richiede previo passaggio attraverso fetale cultura organistica timico. 1 Tuttavia, questa tecnologia ha dimostrato la sua promessa come un potente approccio investigativo a entrambe le domande cellulari e molecolari nel sangue e del sistema immunitario di sviluppo che in precedenza erano possibili solo da esplorare in vIvo. Così, oltre a fornire un nuovo modo di rendere più rapidi progressi su queste questioni, più ampia adozione del sistema di co-coltura OP9-ESC avrà l'impatto più ampio di ridurre l'uso di animali da esperimento.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Stem cell qualified FBS | Gemini | 100-125 | Heat inactivated |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| L-alanyl L-glutamine | Corning | 25-015-CI | |
| HEPES buffer | Millipore | TMS-003-C | |
| Non-Essential Amino Acids | ThermoScientific | SH30853.01 | |
| Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml) | Life Technologies | 15750-060 | |
| β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS | Life Technologies | 21985-023 | |
| Filter Unit | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm PES membrane |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CM | |
| α-MEM | Life Technologies | 12000-022 | Powder, reconstitute per manufacture recommendation |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| FBS | ThermoScientific | SH 30396.03 | Testing of individual lots required |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma | D2650 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand | R&D Systems | 308-FK | |
| Recombinant Murine IL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| Utrapure water with 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| MEFs mitomycin C treated | Millipore | PMEF-CF | Any mitotically arresteded MEFs can be used |
| DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| Cell strainer (40 μm) | Fisher | 22363547 | |
| Tissue culture dish 100 x 20 mm | BD Falcon | 353003 | |
| Multiwell 6-well | BD Falcon | 353046 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | Tubes for FACS |
| ES R1 cells | ATCC | SCRC-1011 | |
| OP9 cells | Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan). | ||
| OP9-DL1 cells | Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory. | ||
| FlowJo software | Tree Star | FACS data analyses | |
| Flow Cytometer | BD | FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab |
References
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
- Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
- de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
- Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
- Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
- Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
- Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
- de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
- Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
- Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).
