Protocol
1 приготовления питательных сред, цитокинов и клейстеризованный Плиты
- Подготовьте ES клеток носителя с помощью Модификация Дульбеко из Орла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы и пирувата натрия. Добавить 20% ESC квалифицированных эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина / стрептомицина, 1% L-глутамина, 1% HEPES буфера, 1% заменимых аминокислот, 0,1% гентамицин (50 мг / мл) и 0,1% ( 55 мкМ) β-меркаптоэтанола. Стерилизовать ES клеток СМИ фильтрацией.
- Подготовьте OP9 СМИ, сделав 1 л Альфа минимальной основной среде (α-MEM) из порошка в соответствии с инструкциями изготовителя. Добавить 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина. Обратить перемешать. Стерилизовать фильтрацией на две 500 мл аликвоты.
ПРИМЕЧАНИЕ: использование средств массовой информации, изготовленных из порошка рекомендуется и, вероятно, обеспечить улучшенное обслуживание OP9 клеток и в пробирке результатов дифференциации. Этот подход стал нашим стандартная процедура. Тем не менее, мы также отмечаем, тхат мы порой используется предварительно сделанные жидкие α-MEM с адекватной успеха. - Подготовка замораживания носитель путем добавления 10% диметилсульфоксид (ДМСО) до 90% FBS. Вихревой нежно и стерилизовать фильтрацией. Хранить при 4 ° С.
- Подготовка 2,000x Flt-3 лиганд (10 мкг / мл), раствор человеческого рекомбинантного Flt-3 лиганд (Flt-3 л) в полном OP9 сред до 10 мкг / мл. Алиготе в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках и хранить при -80 ° C. Следуйте рекомендациям поставщика относительно стабильности и хранения.
Примечание: Стабильность FLT-3L короткий (1 месяц при 4 ° С или 3 месяца при температуре -80 ° С). - Подготовка 1,000x IL-7 (1 мкг / мл) с помощью полного OP9 носитель. Алиготе в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках и хранить при -80 ° C. Следуйте рекомендациям поставщика о стабильности и хранения (IL-7 является стабильным в течение 12 месяцев при -80 ° С).
- Подготовьте 1,000x фактор ингибирования лейкоза (LIF) (10 мкг / мл) на разведении 10 7 единиц LIF I 1:10н ES клеток СМИ. Магазин аликвоту при 4 ° С. Обязательно обратите внимание на дату окончания срока действия, предоставляемая производителем на аликвотные флаконах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продукт устойчив в концентрированных или разбавленном виде, по крайней мере 18 месяцев с даты изготовления. - Подготовка желатинизированный пластины 6-хорошо добавить 1,5 мл 0,1% раствора желатина в каждую лунку 6-луночного планшета. Оставьте посуду в стерильных капот при комнатной температуре с крышками на, что позволяет по меньшей мере 30 мин для покрытия. Блюда могут быть также оставили в увлажненном инкубаторе в течение ночи. Удалите остатки раствора желатина прямо перед посева клеток. Не позволяйте раствор желатина полностью высохнуть в скважине.
2 Подготовка и обслуживание фидерных клеток и эмбриональных стволовых клеток мыши (Mesc)
ПРИМЕЧАНИЕ: Выдержите все клетки в увлажненной 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2.
- Размораживание эмбриональных фибробластов мыши (MEF)
- Быстрый таять замороженный флакон (~ 5 х 10 6
- Добавить 8 мл ЭС клеток СМИ к талых клеток, в каплям моды постепенно разбавить ДМСО из морозильного среды.
- Центрифуга клетки при 400 х г при 4 ° С в течение 5 мин. Осторожно удалите супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 3 мл ЭС клеток СМИ.
- Приготовьте 50 мл центрифужную пробирку с 33 мл подогретого клеток СМИ ES. Добавьте 3 мл ресуспендированных MEFs довести до конечного объема 36 мл.
- Распределить 3 мл ресуспендированных MEFs в каждую лунку двух желатинизированный 6-луночных планшетах. Место пластин в инкубаторе в течение не менее шести часов, чтобы позволить клеткам прикрепляться и распространено до посева mESCs на них. Эти митотически арестованные фидерные слои можно будет использовать в течение нескольких дней после первоначального посева, если их СМИ меняется каждые 2-3 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Только что арестованные MEFs также может быть использован. </ Ол>
- Посев mESCs
- Быстрый таять пузырек с замороженной Mesc клона в C водяной бане 37 ° и подготовить клетки, как описано в 2.1.1-2.1.3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы заморозить 2 флаконов мЭСК от сливной лунку 6-луночного планшета. - Удалить материал из одной скважины (за MESC клона) на 6-луночный планшет с задержанных MEF монослоев (полученного на стадии 2.1.5) и семян в 3 мл mESCs на верхней части MEF монослое. Добавить 3 мкл 1,000x LIF (10 нг / мл). Возвращение блюда в инкубатор.
- Быстрый таять пузырек с замороженной Mesc клона в C водяной бане 37 ° и подготовить клетки, как описано в 2.1.1-2.1.3.
- Обслуживание сотового ES и трипсин опосредованной проход
ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение СМИ в день, или раскол на основе слияния мЭСК. Оптимально, урожай и сплит / повторно пластины клетки через день.- Удалить среда клеток ES и мыть mESCs с 2 мл PBS. Удалить PBS. Добавить 1 мл 0,25% трипсина и инкубировали при 37 ° С в течение 3-5 мин.
- Соберите трипсинизируют клетки и перенести их в 15 мл центрифужную пробирку. Энергично пипетки клеточной суспензии, чтобы разбить комки мЭСК. Добавить 2 мл полной клеток СМИ ES к клеточной суспензии для нейтрализации трипсина.
- Побочные клетки при 400 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 3 мл ЭС клеток средах.
- Удалить носитель из 6-луночные планшеты, содержащие приготовленные монослои задержанных MEF. Добавить соответствующее количество клеточной суспензии (в расчете на желаемом соотношении Split) в 3 мл ЭС клеток средах в каждую лунку быть заполнена. Добавить 3 мкл 1,000x интегратором. Конфлюэнтную Mesc хорошо разделить 1: 6 будет готов для прохода в 2 дня.
- OP9 / обслуживание OP9-DL1 клетки
- Оттепель флакон OP9 клеток (следуйте инструкциям 2.1.1-2.1.3 помощью OP9 СМИ)
- Добавить 7 мл OP9 СМИ до 10 см блюдо культуры ткани. Добавьте 3 мл ресуспендировали клеток в каплям образом, распределение клеток по всей пластине. Поместите клеток в течение ночи в инкубаторе.
- Проверьте впадении OP9 клеток на следующий день. Если блюдо содержит много мертвых плавающих клеток, Ремове СМИ и добавляют 10 мл свежего OP9 СМИ. Вернуться блюдо в инкубатор, если почти полный слияние не наблюдается. Сплит (используя трипсин) 1: 4 рядом сливающийся OP9 монослоя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плиты должны достичь такой же уровень слияния снова приблизительно 2 дней. Старайтесь не позволить OP9 клетки становятся более-сливной. - Замораживание ранние отрывки из OP9 клеток как акции расширения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы заморозить 2 флаконов OP9 клеток от одного возле сливной 10 см блюдо. Каждый флакон расширения складе может быть дополнительно распространяется создавать рабочие запасы, которые позднее используются в Mesc сокультуры экспериментов. Храните все OP9 запасы замороженных в жидком азоте, а не в -80 ° C морозильник, так как колебания температуры могут негативно повлиять на качество замерзает.
3 OP9-DL1 Порядок Co-культура
- Сотрудничество культуры препараты
- Примерно за неделю до начала со-культуры, оттепель MEFs, mESCs и OP9 клеток рабочую STOCKS. С OP9-DL1 клетки не нужны, пока сокультуры день 8, оттепель клетки OP9-dL1 в течение первых трех дней после сокультуры инициации. Поддерживать или заморозить все клетки по мере необходимости.
- Определите начальное количество 10 см пластинах с OP9 монослоев клеток, подготовленных для достижения 80% слияния на сокультуре день 0 исходя из шкалы эксперимента (например, количество миллисекунд клонов должны быть дифференцированы и количество со-культуры временных точках, чтобы быть проанализированы). Для подготовки к совместной культуры, разделить возле сливной блюдо OP9 клеток между 1: 4 и 1: 6 на два дня раньше, когда монослои будут необходимы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Один понадобится как минимум одну пластинку за ESC клона. Как правило, один клон, ESC, высевали на одной пластине (как описано ниже) на день 0 должно дать достаточное количество клеток, чтобы отобрать шесть пластин в день 5 прохода. Каждый день 5 пластина позволит один последующий момент времени анализ. - С OP9 монослоя будет постоянно необходимы для сокультуры прохождения, заботиться, чтобы всегда maintaв достаточном количестве дополнительных OP9 пластин культуры параллельно с совместной культуре.
- День 0: Инициирование совместного культивирования
- Соберите Mesc как в 2.3.1-2.3.4. Граф клеток.
- Для каждого Mesc клона подготовить 5 х 10 4 миллисекунд в 10 мл OP9 СМИ за тарелку.
Примечание: Несмотря на то, что мы не использовали его, следует отметить, что альтернатива среду, состоящую из α-MEM, 10% FBS, и 5 х 10 -5 М β-меркаптоэтанола Сообщалось также, для использования в дифференциации совместных культурах 10. - Удалить старые СМИ от OP9 блюд и добавьте 10 мл мЭСК подвески к блюдам, заботящихся распространять клетки равномерно по всей пластине. Поместите посуду в 37 ° С инкубатор.
- День 3: изменение Медиа
- Удалить блюда из инкубатора и наблюдать под микроскопом. Колонии должны начать терять блеск и выглядят плоские.
- Удалить носитель из блюд и осторожно добавляют 10 мл свежего OP9СМИ.
- Возврат к со-чашки для культивирования в инкубатор. Визуально контролировать образование колоний мезодермы, как ежедневно, чтобы сообщить об этом сроки OP9 подготовки подачи монослоя для следующего прохода (день 5), который не должен быть проведен до ~ 80-90% колоний визуального отображения мезодермы-подобную морфологию. Максимальная отсрочка стадии переноса клеток день 5 2 дня.
- День 5: Трипсин опосредованной проход с предварительной металлизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте заранее достаточное количество 10 см чашки с оптимально сливающихся OP9 клеток. Продолжайте следующих шагах, только если со-культуры визуального отображения функций, описанных в шаге 3.3.3 (см также Представитель Результаты).- Удалить носители из со-чашки для культивирования. Добавить 4 мл PBS мыть. Вихревой PBS и удалить. Добавить 4 мл 0,25% трипсина и поместите посуду в инкубаторе в течение ~ 5 мин.
- Лишить слой трипсинизируют клеток энергичным пипетки, заботясь не вводить чрезмерные пузырьки воздуха, покаоднородным, в основном суспензию отдельных клеток достигается.
- Добавить 4 мл полных OP9 СМИ и перемешать с помощью пипетки. Передача клеток в новый пустой 10 см блюдо и поставьте в инкубаторе в течение 30 мин, чтобы позволить OP9 клетки придерживаться блюдо. Это "предварительно покрытие" шаг уменьшает количество клеток OP9 переданных к следующему шагу со-культуры.
- Подготовьте пробирками 50 мл с фильтров 40 мкм клеток.
- Сбор неприкрепленных клеток из предварительно покрытием блюдо и передавать их через ячейки сетчатого фильтра в трубке. Вымойте блюдо аккуратно с 6 мл PBS и передать его через тот же сито, оставив прилагаемые OP9 клетки сзади.
- Центрифуга клеток при 400 х г 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют клетки осаждали в 3 мл полной OP9 массовой информации. Граф клеток.
- Выньте материал из 10 см пластинах с оптимально сливающихся OP9 клеток.
- Для каждого анализа временной точке, семян 5 х 10 5 клеток на OP9 моноСлой в 10 мл конечного объема.
- Добавить 5 нг / мл человеческого рекомбинантного FLT-3L и поместите посуду в инкубаторе.
- День 8: гемопоэтических клеток-предшественников (HPC) коллекция
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте заранее достаточное количество 6-луночные планшеты с OP9 или OP9-DL1 монослоев клеток так, что они будут ~ 80% сливной времени для этого шага.- Подготовьте пробирками 50 мл с 40 мкм фильтров.
- Снимите посуду из инкубатора и наблюдать под микроскопом. Блестящие кластеры HPCS следует косвенное отношение к OP9 монослоя. Собрать как многие из этих клеток, как это возможно путем промывки (но не чрезмерно нарушая) монослой OP9 с пипеткой и существующий СМИ на блюдо. Для предотвращения вспенивания, всегда оставляйте по крайней мере, 1 мл СМИ в кончике пипетки в течение этого сбора HPC / стадии промывки.
- Pass клеток через 40 мкм сито в трубку. Добавить 8 мл PBS в одной тарелке и проверить под микроскопом, если все HPCS мыповторно собраны. Повторите шаг стиральная / сбора с PBS и (при необходимости) с более принудительный мытья. Процедить клетки в трубу уже содержащей клетки из одной тарелки.
- Центрифуга клетки при 400 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
- Подготовка основной смеси из 3 мл (на пластину высевали на 5-й день) в OP9 средах с 5 нг / мл Flt-3L и 1 нг / мл IL-7.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в OP9 сред с Flt-3L + IL-7 мастер-микс (3 мл для каждого 10 см блюдо обработанного). Передача собранных клеток от каждой пластины в одну лунку 6-луночного планшета с клетками OP9.
- В целях продвижения клеток к моноцитарно, В-клетки или эритроидных линий, семена собранные клеток на OP9 клеток. Для вывода Т-клеток, семян клетки на клеточных монослоев OP9-DL1.
- Поместите 6-луночных с в инкубаторе.
- День 10: изменение Медиа
- Приготовьте 15 мл центрифужную пробирку для каждого отдельного Mesc клон-фидерного типа клеток COMBINAния в совместной культуре.
- Подготовка мастер смесь OP9 средах с 5 нг / мл FLT-3 л и 1 нг / мл IL-7. Подготовьте 3 мл на каждую лунку.
- Аккуратно собрать средства массовой информации из каждой лунки 6-луночного планшета объединения средств массовой информации из нескольких скважин, содержащих одинаковое ESC клон-питатель типа клеток комбинацию.
- Добавить 2 мл OP9 СМИ мастер-микс (см 3.6.2) в каждую лунку.
- Центрифуга собранные средства массовой информации при 400 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют каждый шарик (очень маленький, если видна) в 1 мл OP9 мастер СМИ смеси (см 3.6.2) на лунку первоначально собранной на этапе 3.6.3.
- Распределить 1 мл клеток обратно в каждую лунку, из которых носитель первоначально была собрана в результате чего объем в каждой лунке до 3 мл. Вернуться посуду в инкубатор.
- День 12: Нет трипсина проход
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте заранее достаточное количество 6-а блюда с OP9 или OP9-DL1 клетки так, что они будут оптимально конфлюэнтны времени для этого SТЭП. День 12 идеально подходит для проточной цитометрии анализа развивающихся эритроидных, моноцитов, и на ранних стадиях развития Т-клеток.- Подготовка основной смеси (3 мл на каждую лунку, которая будет продолжать во взаимодействии культуры) OP9 средах с 5 нг / мл FLT-3 л и 1 нг / мл IL-7.
- Подготовьте пробирками 50 мл с 40 мкм фильтров (один для каждого ESC клон-фидерного типа клеток комбинации в совместной культуре).
- Энергично пипетки существующие средства массовой информации в каждую лунку разбить все клетки (в том числе монослоя) в скважине. Продолжить с силового пипетки до состояния, напоминающие суспензии отдельных клеток не достигается.
- Pass Собранные клетки через сито в трубу. Добавить 3 мл PBS в каждую лунку мыть и собрать все оставшиеся клетки. Pass клетки через то же сито. Объединить ячейки из нескольких скважин, содержащих одинаковое ESC клон-питатель типа клеток комбинацию.
- Утилизируйте использованный клеточный фильтр и удалить кратный, эквивалентную одной скважины (~ 6 мл) для любой желаемойпроточной цитометрии (или другой) анализирует будет осуществляться в тот день. Храните эти аликвоты на льду перед использованием.
- Центрифуга клетки при 400 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант. Ресуспендируют гранул из центрифуги труб 50 мл в 3 мл мастер-микс на лунку для повторного посева. Добавить 3 мл на лунку каждой клеточной суспензии на соответствующем типе клеток-фидеров и поместить посуду в инкубаторе.
- День 14: изменение Медиа
- Выполните действия, указанные в разделе 3.6.
- День 16: Нет трипсина проход
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте заранее 6-а блюда оптимально сливающихся OP9 или OP9-DL1 клетки для этого шага.
ПРИМЕЧАНИЕ: День 16 идеально подходит для проточной цитометрии анализ В-лимфоцитов и средней стадии Т-клеток.- Выполните действия, указанные в разделе 3.7.
- День 18: изменение Медиа
- Выполните действия, указанные в разделе 3.6.
- День 20: Нет трипсина проход
ПРИМЕЧАНИЕ: День 20 яс идеально подходит для проточной цитометрии анализ середины до поздней стадии развивающегося Т-клеток.- Выполните действия, указанные в разделе 3.7. При желании нести дифференциации клеткам прошедшие сутки 20 изменения переменного СМИ и не трипсина не каналы каждые два дня, с ежедневного мониторинга скорости расширения лимфоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При выращивании на MEFs в присутствии LIF, mESCs может поддерживаться в недифференцированном состоянии. В идеальных условиях, они появляются в виде компактных колоний клеток, окруженных блестящей гало в фазу контрастной микроскопии (рисунок 1). Эти культуры должны контролироваться ежедневно. В зависимости от места слияния клеток, средства массовой информации могут быть изменены или клетки могут быть разделены. Соседние колонии Mesc не должны прийти к точке соприкосновения друг с другом. Нормальный, здоровый культура недифференцированных mESCs является важной отправной точкой для экстракорпорального дифференциации Т-клеток. После начала сотрудничества культуру, рекомендуется клетки полностью сливающиеся не будучи переполненными. Это объясняется тем, что большинство клеток, полученных для посева клеток на OP9 монослои миллисекунд (а не фидерных клеток). Если существенные различия в слиянии наблюдаются среди различных клонов Mesc быть дифференцированным в день 0, то это было бы лучше, чтобы удалить MEFs по предварительной приверженности тисСью культуры блюда (как в шаге 3.4.3-3.4.6, используя полный клеток СМИ ES) до подсчета mESCs для сокультуры посева.
OP9 клетки должны быть в хорошем состоянии до ко-культуры посвящение (как описано в разделе 2.4). Кроме того, считается, что OP9 клетки теряют некоторые их свойства при длительном культуры и / или выраженных увеличением их скорости пролиферации 7 избежать разделения коэффициентов превышает 1: 5. Течение поддержания OP9 клеток, и отбрасывания непрерывные культуры OP9 после шести недель, поможет избежать этих ловушек.
В начальных посева клеток и передачи сотового шагов совместного культивирования (день 0, 5, 8, 12, 16), OP9 монослоя должна быть в пределах оптимального диапазона слияния. Рисунок 2 показывает низкий (рисунок 2А) и высокий (Рисунок 2B) концы диапазоне OP9 клеток слияния целесообразно для использования в качестве со-культуры монослоев. Пример чрезмерно сливной пластины показана на фигЮр 2C. Неспособность поддерживать оптимальную слияние может индуцировать образование адипоцитов (Рисунок 2D), что, в больших количествах, может негативно повлиять на сотрудничество культуру.
В день 0, со-культура началась OP9 клеток, а не OP9-DL1 клеток с образованием мезодерма благоприятствования на OP9 клеток. Клетки высевают на OP9-DL1 клеток монослоев начинающихся 8 день, чтобы вызвать T производство клеток. В то время как некоторые клоны MESC визуально отображать надежную и количественный (~ 90%) образование мезодермы, как колоний на 5-й день совместного культивирования (фиг.3А-B), другие могут отображать задержки на этой стадии (3С-F). Под микроскопом, мезодермы, как колонии, полученные в этом тесте, были описаны как переменно напоминающие колеса вагона или кратеров (фиг.4А) или, Starbursts или цветков (фиг.4В).
В то время как опубликованные протокол OP9-DL1 отражает норму количественного мезодермы FORMAция по 5-й день совместного культивирования, 7 мы видим, что не все клоны ESC достижения этой нормы в течение этого периода. В этих случаях, мы меняем среду на 5-й день и ждать еще 1-2 дня до проведения протокол "день 5" Сбор клеток / передачи. Цель этой задержки, чтобы позволить ~ 80-90% колоний ES клеток визуально стать мезодермальной до передачи. Важно дать понять, что это 80-90% цифра отражает строго визуальный критерий распознаваемые при простой фазового контраста микроскопического обследования морфологии колоний в со-чашки для культивирования. Это относится только к доле ЭСК колоний, которые напоминают показано на рисунке 4. Вполне возможно, что некоторые клоны ESC не достигнет этого визуальный критерий, даже после двух-дневным опозданием. В таком случае, можно обогатить для формирования крови предшественников мезодермальных с использованием проточной цитометрии сортировки клеток по FLK-1 + клеток, как это было описано ранее. 6,11 В любом случае, для SAке номенклатуры удобства мы "сбросить часы" и относятся к день мезодермы подобного переданного колонии как "день 5"
Когда несколько клонов ЭСК дифференцируются параллельно, не исключено, что некоторые со-культуры будет готов в течение дня 5 прохождения по времени, в то время как другие отстают. В этом случае, желательно, чтобы задержать проход всех совместных культурах, пока медленнее клонов не успеть до других. Задержка, кажется, не делать никакого вреда "на время" сокультурах, но приносит пользу последующую дифференцировку медленных клонов много.
День 8 (т.е., через три дня после мезодермальной передачи колонии) видит появление и накопление HPCS. HPCs видны как блестящие кластеров клеток, которые свободно присоединившимся к OP9 фидерных клеток (рисунок 5). Тщательное процедура промывки, с помощью пипетки и СМИ на блюдо, будет отсоединить и собирать HPCS, оставляяOP9 монослой основном нетронутыми (фиг.6А-С). Это, пожалуй, наиболее техника чувствительных шаг протокола. Это требует некоторой практики, чтобы найти соответствующие движения и давление СМИ выброса для достижения желаемого баланса максимального урожая HPCS с минимальными помехами фидерного слоя. Это приемлемо, если некоторые из OP9 монослоя взлетает, так как большинство любой шальной монослоя будут захвачены в нейлоновой сетке 40 мкм после фильтрации. Рисунок 6D показывает монослой после чрезмерного пипетки, ведущей к большей нарушения монослоя, чем это необходимо. В течение этого этапа промывки, важно проверить под микроскопом или нет были собраны все HPCs, и отрегулировать давление стиральная соответственно.
Прогресс в совместной культуре можно контролировать с помощью проточной цитометрии. Чтобы специально анализировать не-эритроидного кроветворную потомство ESC, важно первые ворота в прямом CD45 + клеток.На этом этапе на экраны вышел OP9 клеток из анализа, в то время как использование DAPI или других ядерных окрашивания красителя позволяет исключение нежизнеспособных клеток. К 12 день, многие кластеры малых, круглых, блестящих клеток должны быть видны. Не стоит рассчитывать клетки на этой стадии. Но мы обнаружили, что живут, рассчитывает событий закрытого цитометрии потока, как правило, в диапазоне 1-3 х 10 5 в день 12 сокультуре хорошо. Проточной цитометрии анализ живых закрытого клеток дифференцированных по OP9 монослоя даст эритроидных (CD45 отр, Ter119 +) и моноцитов (CD45 +, CD11b привет) клоны (7А). Анализы живых, CD45 + клеток дифференциации на OP9-DL1 монослоев должны выявить маркеры, характерные для CD4 / CD8 Double Negative (DN) -1 (CD44 +, CD25 отр, CD4 отр, CD8 отр) и DN2 (CD44 +, CD25 +, CD4 отр, CD8 отр) стадии Т-клетки (7В нг>). К 16-й день, существует значительное увеличение количества мелких, круглые, блестящие клеток в культурах. На OP9-DL1s, Т-клеток продуктов прогресса в DN3 (CD44 нег, CD25 +, CD4 нег, CD8 отр) и DN4 (CD44 нег, CD25 нег, CD4 нег, CD8 отр) этапов. Некоторые DP (CD4 +, CD8 +) Т-клетки также могут начать возникающих на 16 день (Рисунок 7b). HPCs высевают на OP9 клетки дают В-клеток (CD19 +) по 16-го дня Днем 20 OP9-DL1-Mesc сокультуре, будет большое количество DP Т-клеток и одного положительного (SP) CD8 + Т-клеток, присутствующих ( 7В). Рисунок 8 представлена схема, содержащий ключевые этапы вышеуказанных процедур, и предлагаемые временные точки анализ во время совместного культивирования.
ghres.jpg "/>
Рисунок 1 Фаза контрастной микроскопии образ недифференцированных mESCs (с острыми краями колоний), растущих на вершине MEF монослоя (увеличение в 100 раз).
Рисунок 2:. Фазово-контрастной микроскопии образы OP9 монослоя слияния (A) низкая и (B) высокие уровни слияния рекомендуемые для сокультуры прохода / посева (40-кратном увеличении) (C) Пример над-сливной OP9 монослоя (40-кратном увеличении. ). (D) За-сливной OP9 монослоя (200-кратное увеличение) с образованием адипоцитов (большой, пузырька, содержащего, клеток).
Рисунок 3: контраст microscop Фазау образы образования колоний мезодермы, как в "день 5" совместного культивирования. (A) 40X и (B) 100X виды со-планшеты для культивирования с> 90% мезодермальный колонии дифференциации. Эти пластины готовы к день 5 прохождения. (CF) Примеры День 5 со-планшеты для культивирования, которые требуют 1-2 день отсрочки до переноса (C & E, 40-кратном увеличении, D & F, 100-кратном увеличении).
Рисунок 4: фазово-контрастной микроскопии образы различных мезодермы, как колонии образований в 5-й день совместного культивирования () Колония морфология называют «кратеров» или (B) Колония морфология называют. "Универсал колеса." как "звездообразования" или "цветочков" (200-кратное увеличение).
Рисунок 5 Фаза контрастной микроскопии образ день 8 сокультуры пластины с кластерами малых, круглых, блестящих HPCS на OP9 монослоя (40-кратном увеличении).
Рисунок 6:.. OP9 монослоя после HPCS коллекции на сокультуры день 8 (AC) соответствующего диапазона срыва OP9 монослоя после тщательного мытья чтобы собрать HPCS (D) Пример OP9 монослоя, который был над разрушенным в день Процедура заготовки 8 HPC.
Рисунок 7: представитель цитометрии потока (FACS) анализ в конкретных временных точках в течениеMesc дифференциация в пробирке. (А) Окрашивание на эритроидных (слева), моноцитарного (среднего) и В-клетки (справа) продукты MESC-OP9 совместного культивирования на 12 день или 16, как указано. (B) Окрашивание для разработки Т-клеток в указанных временных точках в Mesc-OP9-DL1 совместно культуры. Пожалуйста, смотрите текст подробными описаниями иммунофенотипами.
Рисунок 8 Схема из этапов процедуры Mesc-OP9 сокультуры. () Ключевые этапы передачи сотового первых восьми дней совместного культивирования. Приблизительное количество клеток, посеянных на OP9 клеток в дни нулю и пять обозначены. (B) шаг передачи день 8 и ожидаемые клеточной дифференцировки продукты, обнаруженные с помощью проточной цитометрии в ключевых моментов времени совместного культуры. Пожалуйста, смотрите текст подробными описаниями иммунофенотипами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Система OP9-DL1 совместно культуры была использована для изучения роли различных генных продуктов при разработке типов клеток крови из стволовых клеток. 8,12,13 Он также доказали свою эффективность модель для изучения функции генов регуляторной ДНК во время клеточной дифференцировки. 9,14 Используя этот подход в качестве альтернативы целых мышиных моделях может дать значительную экономию во времени и стоимости экспериментов, направленных многие основные вопросы кроветворения. Однако адаптация этого протокола для этих целей требуется ознакомившись с потенциальной изменчивости среди Mesc клонов, которые будут использоваться в этих процедурах. Сроки опубликованной протокола следует ожидать от среднего, благоустроенный, не манипулировать Mesc линия. 7 Кроме того, Mesc клоны отбирали для генерации химерных мышей обычно имеют более высокое качество и будет выполнять очень решительно в OP9 сокультуре . С другой стороны, MESC клонов возникающих непосредственно из стабильнатрансфекции с эктопически интегрированной трансгена покажет различную степень начальной эффективности дифференцировки, начиная от среднего до ниже среднего. Протокол, описанный здесь предусматривает стратегического 1-2 день задержки дня 5 канала шага, чтобы выровнять эти потенциальные различия до индукции кроветворения в пробирке.
День 8 проход шаг, при котором выполнение этого протокола имеет наибольший потенциал для ошибки. Терпение, практика и тщательное наблюдение будет позволяют развить технику, которая оптимизирует урожай HPC, минимизируя нарушение OP9 монослоя. Помимо ключевых день 5 день и 8 шагов, критические параметры включают тщательное обслуживание для культивирования клеток (особенно OP9 клетки, как описано выше) и особое внимание к реагентов, используемых в протоколе. Наиболее важным реагентом является FBS. Четкие много FBS будет заметно различаются по своей способности поддерживать эту процедуру. Несколько лотов должны быть проверены в оRDER, чтобы определить, какой будет давать надежные дифференциацию в данном анализе.
Эта система со-культура имеет свои ограничения. Например, эта модель не поддерживает дифференциацию отдельных положительных клеток CD4. Одна из причин этого является отсутствие экспрессии главного комплекса гистосовместимости инфраструктуры презентации антигена (MHC) класса II в OP9 клеток. 1 сотовый поверхность презентация антигенов МНС класса II необходим для правильного развития CD4 SP клеток. В CD8 SP элементов, появляются представляют собой смесь зрелых и незрелых стадий тимоцитов CD8 SP. 1 Кроме того, успешная трансплантация мЭСК получены Т-клеток предшественников в мышь требует предварительного прохождения через эмбрионального тимуса органной культуре. 1 Тем не менее, эта технология доказала свою обещают в качестве мощного следственного подхода к обоих клеточных и молекулярных вопросов в развитии крови и иммунной системы, которые ранее были возможно только для изучения в стИво. Таким образом, помимо обеспечения новый способ сделать более быстрого продвижения по этим вопросам, широкому внедрению системы сокультуры OP9-ESC будет иметь широкое воздействие сокращения использования подопытных животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Stem cell qualified FBS | Gemini | 100-125 | Heat inactivated |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| L-alanyl L-glutamine | Corning | 25-015-CI | |
| HEPES buffer | Millipore | TMS-003-C | |
| Non-Essential Amino Acids | ThermoScientific | SH30853.01 | |
| Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml) | Life Technologies | 15750-060 | |
| β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS | Life Technologies | 21985-023 | |
| Filter Unit | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm PES membrane |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CM | |
| α-MEM | Life Technologies | 12000-022 | Powder, reconstitute per manufacture recommendation |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| FBS | ThermoScientific | SH 30396.03 | Testing of individual lots required |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma | D2650 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand | R&D Systems | 308-FK | |
| Recombinant Murine IL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| Utrapure water with 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| MEFs mitomycin C treated | Millipore | PMEF-CF | Any mitotically arresteded MEFs can be used |
| DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| Cell strainer (40 μm) | Fisher | 22363547 | |
| Tissue culture dish 100 x 20 mm | BD Falcon | 353003 | |
| Multiwell 6-well | BD Falcon | 353046 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | Tubes for FACS |
| ES R1 cells | ATCC | SCRC-1011 | |
| OP9 cells | Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan). | ||
| OP9-DL1 cells | Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory. | ||
| FlowJo software | Tree Star | FACS data analyses | |
| Flow Cytometer | BD | FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab |
References
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
- Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
- de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
- Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
- Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
- Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
- Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
- de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
- Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
- Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).
