Abstract
Iboende processer Drosophila puppe udvikling kan flytte og fordreje øjet epitel på måder, der gør individuel celle adfærd vanskeligt at spore under Live cell imaging. Disse processer indbefatter: retinal rotation, cellevækst og organismal bevægelse. Derudover folder uregelmæssigheder i topologi af epitelet, herunder subtile stød og ofte indført som puppe er forberedt til billedbehandling, gør det til en udfordring at erhverve i fokus billeder af mere end et par ommatidia i et enkelt fokalplan. Arbejdsgangen er skitseret her retsmidler disse spørgsmål, giver let analyse af cellulære processer i Drosophila puppe øje udvikling. Tilstrækkeligt-iscenesat pupper er anbragt i et billeddannende rig, der let kan samles i de fleste laboratorier Ubiquitin-DE-Cadherin:. GFP og GMR-GAL4 rent faktisk sikrer UAS-α-catenin: GFP anvendes til at visualisere cellegrænser i øjet epitel 1 -3. Efter udfoldning eranvendt på fluorescerende billeder taget på flere fokusplaner, er maksimum projektion billeder genereret for hvert tidspunkt og forbedret ved hjælp af billedredigeringssoftware. Justeringsalgoritmer anvendes til hurtigt at stabilisere overflødig bevægelse, hvilket gør individuel celle adfærd lettere at spore.
Introduction
Forbindelsen Drosophila øje er kendetegnet ved stereotype arrangement af sine ~ 750 ommatidia adskilt af en honeycomb-gitter af accessoriske pigment celler 4,5. Disse pigment celler mønster af en koordineret kombination af begivenheder: lokale celle bevægelser, cellevækst, ændringer i celle form og apoptose. Levende visualisering af dette epitel gør det muligt at studere de molekylære mekanismer bag disse hændelser i en fysiologisk relevant og uforstyrret tredimensionale sammenhæng.
I modsætning til tidligere protokoller 6,7 teknikken beskrevet her omfatter en effektiv metode til stabilisering af uvedkommende væv bevægelse, der ikke kan kobles fra billeddannende proces. Denne metode forbedrer studier af celle adfærd i udviklingslandene Drosophila puppe eye epitel - et væv, der vokser, roterer og forskydninger i løbet af billeddannelse. Desuden motion-stabilisering teknik debeskrevet her, vil være nyttig for at studere celler i andre sammenhænge, hvor uvedkommende bevægelse forekommer.
At visualisere cellegrænser i Drosophila retinal område blev transgene flueliner genereres der udtrykker Ubi-DE-Cadherin: GFP samt UAS-α-catenin: GFP under kontrol af øje-specifikke driver GMR-GAL4 1-3. Anvendelsen af to GFP-mærkede membran markører muliggør visualisering af cellegrænser ved lavere intensitet lys. Dette minimerer vævsskade og fotoblegning på gentagen udsættelse for højenergi bølgelængder, således øget billedhastighed og film varighed. For at øge effektiviteten af RNAi transgener, UAS-DCR-2 blev også indarbejdet i en anden flue linje 8.
I et tredje opdatering fra tidligere protokoller, er en enklere imaging rig, der let samles i de fleste laboratorier beskrevet. Dette apparat undgår kravet om en specialiseret billedbehandling rig genereret af et universitets "maskinværksted" eller lignende tjeneste. Denne billeddannelse rig svarer til den, der anvendes til at afbilde andre puppe væv 9,10.
Præsenteres her, er en simpel live-cell imaging protokol, der kan anvendes til direkte at vurdere de morfogenetiske begivenheder, der bidrager til øjet mønsterdannelse fra ~ 17-42 timer efter puparium formation (HR APF). Konkret protokollen gør det muligt at vurdere konsekvenserne af at ændre genekspression under puppe udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 3 viser en oversigt over den eksperimentelle procedure.
1. Vævspræparat
- For at bestemme konsekvenserne af ændret ekspression af et gen af interesse, der er nedsat følgende kors i to eksemplarer og holdes ved 25 ° C: UAS-transgene (mænd) X GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, Ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (jomfruelige hunner) BEMÆRK: For at opnå kontrol væv cross UAS-lacZ hanner til GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, Ubi-DE-Cad: GFP hunner. β-galactosidase genererer ingen fejl i celle adfærd i nethinden.
- For at øge effektiviteten af RNAi transgener, cross UAS-RNAi hanner til GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, Ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b jomfruelige hunner.
BEMÆRK: Lejlighedsvis defekter i celle adfærd i retinae udtrykker ektopisk DCR-2 er blevet observeret (data ikke vist). Årvågenhed anbefales, hvis du bruger denne metode. - Sudvalgte hvide pre-pupper af passende genotyper og sted i 1,5 ml mikrocentrifugerør. Hvis pupper udtrykker DCR-2, skal du vælge enten mand eller kvinde pupper: ekspression af UAS-DCR-2, en indsats på X-kromosomet, er stærkere hos mænd. Pupper bør kønssorteret ved 0 time APF før pigmentering af puppe tilfælde - kønskirtlerne af hanner er synlige som store gennemskinnelige glober på de laterale sider af puppe (ca. en tredjedel fra den bageste).
- Inkuber mikrocentrifugerør indeholdende pupper, i en ren plastik tip-box ved 25 ° C. For at forhindre udtørring af pupper sted 10 cm2 stykke væv, dyppet i destilleret vand i spidsen-box.
BEMÆRK: hvis fugtigheden i tip-boksen bliver for høj puppe tilfælde kan blive soggy og vanskeligt at dissekere i efterfølgende trin. - Inkuber i passende tid. For at fange celle adfærd forbundet med mønstring øjet, forberede pupper til billeddannelse på omkring 17 timer APF, 20 timer APF eller 24 timers APF. Se Repræsentative resultater for yderligere drøftelser om, når specifikke celle adfærd er bedst overholdes.
- Læg et stykke frisk dobbeltklæbende tape på en sort Sylgard dissektion fad. Placer en puppe, dorsale side op, med lederen af puppe klæbet til dobbeltklæbende tape (figur 1A) haft.Prøv ikke at klæbe bryst- og abdominale regioner i puppe til dobbeltklæbende tape. Med pincet forsigtigt løfte og fjern Laag at blotlægge puppe hoved. Riv langs siden af den puppe sag at eksponere området omkring det ene øje.
- Fjern forsigtigt puppe fra tapen. Hvis puppe forbliver klæbende, anvende en lille mængde destilleret vand til krydset mellem puppe sag og tape til at svække vedhæftning.
2. Montering
- Konstruere en lille 15 mm 2 ramme fra trækpapir og punch et hul i middlethat er 5,5 mm i diameter (figur 1B). Fordyb i destilleret vand og plads imidten af et objektglas. Anvendelse af en 30 ml sprøjte, presse en ensartet ring vaseline til at omgive trækpapir rammen. Sørg for at vaseline ring er marginalt højere end bredden af puppe, og at diameteren af ringen er en anelse mindre end bredden af et dækglas.
- Tilføj en lille perle af vaseline direkte på dias, i hullede i trækpapir (Figur 1C) .Carefully arrangere puppe, på sin side, støttet af vaseline perle (figur 1D).
- Placer et dækglas på toppen af vaseline ring, således at den kommer i kontakt epitelet over øjet neuroepithelium (figur 1D). Komprimere forsigtigt forberedelse til at forsegle dækglasset mod vaseline og generere en lille flad kontaktflade mellem puppe øjet regionen og dækglasset.
3. Fluorescens Imaging
- Image puppe præparat under anvendelse af enfluorescerende mikroskop. Hver 7 min capture serielle snit gennem den apikale domæne af øjet neuroepithelium i området af adherensovergange.
BEMÆRK: a) Passende serielle sektioner er normalt 4-5 per z-stak bestående af 0,2 um z-trin. b) Uregelmæssigheder i topologi af epitelet, herunder milde stød og folder, kan gøre det udfordrende at erhverve i fokus billeder af store områder af væv. Mens billedbehandling kan man finde en del af et område med interesse for at være i fokus, og et naboområde til at være ude af fokus. Herunder en lille dråbe af destilleret vand mellem puppe øje og dækglas kan eliminere nogle akutte væv folder men ikke mildt ujævn topologi karakteristisk for de tidlige stadier af puppe øje morfogenese. I disse tilfælde oversample vævet ved at udvide z-stakken indtil i fokus skiver erhverves for hele feltet. c) Optagelse serielle snit hver 7 min skal gøre det muligt levende billeddannelse i 3 til 4 timer uden en væsentlig ReduIndsatsen i intensiteten af GFP-fluorescens, der kan kompromittere billedkvaliteten. Kortere time-intervaller kan reducere den samlede tid for billeddannelse. - Fortsæt billeddannelse i 3 til 4 timer. Brug ikke en automatisk fokus og tid funktion, der er tilgængelig på mange fluorescerende mikroskoper siden puppe vækst og pumpning af hæmolymfe flytter placeringen af nethinden og årvågne re-fokusering er nødvendig hver 14-21 min. BEMÆRK at billeddannelse udover de 4 timer kan bremse eller stall morfogenese af øjet.
- Skal deconvolution software til at reducere baggrunden og øge kontrasten af de serielle afsnit billeder. For hver z-stak-fil, skal du udføre følgende i LAS AF software (se tabel Materialer): Naviger til panelet Værktøjer, vælge 3D Deconvolution og klik på Anvend.
- Generer en maksimal projektion (MP) billede for hvert deconvoluted stak fil: Naviger til panelet Værktøjer, vælge 3D projektion og klik på Anvend.
Bemærk: Den maksimale Projection algoritme kan ikke generere en ensartetly i fokus billede for væv, der er blevet oversamplede. En teknik til slibning ud-af-fokus regioner er skitseret i trin 5.2.
4. Post-imaging puppe Rescue og Fænotype Verifikation
- For at løse, om artefakter blev indført, eller puppe skadet under billedbehandling, forsigtigt fjerne puppe fra imaging rig: ved hjælp af pincet fjerne dækglasset og overfør puppe til en ren hætteglas med mad. Opbevares ved stuetemperatur eller 25 ° C, indtil voksen flue opstår.
- Nøje undersøge fænotypen af den voksne øjet og sammenlign øjne voksne fluer nye fra den oprindelige flyve kors.
5. Billedbehandling
- Automatisk Billede Justering:
BEMÆRK: De levende Drosophila væv vil flytte og vokse gennem hele billeddannende proces. Derfor centrene af billeder indsamlet på hinanden følgende tidspunkter svarer muligvis ikke til det samme punkt i Drosophila væv. DesudenHele retinal roterer omkring 30 ° mellem ~ 21 og 23 timer APF. For at understrege den enkelte celle adfærd og reducere distraktioner forårsaget af organismal vækst, justere hver MP image.While dette kan udføres manuelt, billedredigeringssoftwaren her bruges (se tabel Materialer) har indbyggede algoritmer, der kan fremskynde processen.- Fra fanen i hovedmenuen, åbne scripts og vælg Load Files i Stack fil.
- Importer MP billedfiler i panelet Load Lag, og vælg OK. Sørg for, at automatisk forsøge at Juster Source Images indstilling ikke er valgt.
BEMÆRK: Hvis denne indstilling er valgt, kan softwaren bruge en justering algoritme, der fordrejer billeddata. - Når alle MP-filer har indlæst i ruden Lag, skal du sørge for, at alle billeder er i kronologisk rækkefølge, således at den tidligste tidspunkt er i toppen af lagstakken. Hvis lagene er ikke i den rigtige rækkefølge, træk og slip dem, indtil de er bestiltkorrekt.
- Vælg Auto Juster lag fra fanen i hovedmenuen Rediger. Vælg Flyt og klik OK.
- Hvis Auto-tilretning algoritmen ikke orientere rammer til et relevant brændpunkt, foretage mindre justeringer ved hjælp flytteværktøjet.
- Composite Skærpning:
BEMÆRK: Out-of-fokus områder i en indledende MP billede kan skærpes ved »beskæring« det tilsvarende deconvoluted stak i LAS AF software. Beskæring en stak fil gør det muligt at manuelt begrænse interval af en z-stak, der udsættes for den maksimale projektion algoritme.- Find Crop funktionen i panelet Værktøjer (under fanen Process). Manuelt begrænse de indledende og afsluttende skiver, således at de spænder kun vedhæftningen bælte i første omgang ude af fokus region. Klik på Anvend for at generere en ny stak fil, der er optimeret til denne region.
- Generer en ny Maksimal projektion for lokalt optimeret stak og eksport som en TIFF-fil.
- I the billedredigering software (se tabel Materialer), åbne Scripts (placeret i fanen i hovedmenuen Filer) og vælg Load Files i Stack.
- Importer den oprindelige MP billedfil og lokalt optimeret MP fil til et bestemt tidspunkt i panelet Load Lag, og vælg OK. Sørg for, at automatisk forsøge at Juster Source Images indstilling ikke er valgt.
- Vælg begge lag i Lag ruden og derefter vælge Bland lag automatisk (placeret under fanen hovedmenuen Rediger) for automatisk at maskere de relevante områder af de to billeder, hvilket giver en ensartet i-fokus retinal felt. Gem denne sammensatte billede som en TIFF-fil.
- Gentag trin 5.2.1 gennem 5.2.5 for alle suboptimale MP billeder.
- Yderligere indstillinger: rotere, beskære og justere niveauer af Movie Lag:
- Med alle lagene valgt, skal du bruge Transform værktøj (Rediger> Fri transformering) for at rotere billeder, så den dorsale-ventrale akse af nethinden er justeretmed y-aksen af filmen rammen.
- Hvis det er nødvendigt, skal du bruge værktøjet Beskær til at reducere synsfeltet til en ønsket størrelse og form.
- Brug justering (individuelle rammer) plan for at bidrage til at øge kontrasten mellem cellemembranen og cellen kroppen.
- For stilistiske formål og til at understrege bestemte celle adfærd, introducere falske farver for at fremhæve interessepunkter i hver ramme.
- Animation: Konverter billederne i en film:
- Åbn Animation ruden fra fanen i hovedmenuen Windows. Vælg Lav Rammer fra Lag fra menuen placeret i øverste højre hjørne af Animation rude.
- Bemærk, at lagene tilføjes animationen ruden i rækkefølge begyndende fra bunden af stakken. For at vende rækkefølgen af rammerne, skal du først vælge alle de rammer, og vælg Reverse Rammer fra Animation ruden menuen derefter.
- Vælg en ramme forsinkelsestid for hver ramme ved hjælp af rullemenuen under rammen tommelfingersøm.
BEMÆRK: Rammen forsinkelse for film 1 til 4 i dette papir er 0,8 sek. - Fra fanen i hovedmenuen, åben Export File, og vælg Gengiv video. Vælg QuickTime-eksport under Filmuligheder og vælge den ønskede video format. Under Render sæt Options Frame Rate til Custom, indtaste en frame rate på 15, og klik på Render.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Levende-billeddannelse af puppe øjet er en vellykket strategi for at observere celle adfærd, der bidrager til mønstring af neuroepithelium. Rollen af specifikke proteiner kan let vurderes ved at udtrykke transgener der modificerer proteinniveauer under øjet udvikling. For at gøre dette GMR-GAL4 anvendes til at drive transgenekspression bag morfogenetiske fure. Dette har den fordel, ikke medfører forstyrrelser tidligere begivenheder, der etablerer feltet øjet i de første to larver instars. Derudover mange RNAi transgener kræver betydelig tid til effektivt at reducere protein niveauer (data nu vist). Derfor kører RNAi transgener med GMR-GAL4 driver linje ofte muliggør tredje larveudvikling instar øje og udkrængning af øjet diske under metamorfose at fortsætte uskadt og reducerer proteinniveauer først senere, i løbet af puppe øje morfogenese. Hvis larveudvikling dog er forstyrres af en yderst effektiv RNAi transgen, flyve kors kanholdes på 18 ° C for at reducere transgenekspression og pupper overført til 25 ° C ved 0 timer APF. For at løse effekten af RNAi transgen ekspression, transcript eller protein niveauer bør vurderes i fase-matchede pupper anvendelse af standard teknikker (f.eks kvantitativ-PCR, immunfluorescens, immunoblotting).
Under larveudvikling, er fotoreceptor kerner af hver ommatidium ansat som en bølge, der bevæger sig fra den bageste til forreste side af øjet skiven 11. Denne udviklingsmæssige gradient blev bibeholdt i puppe øje. Faktisk, når afbildet på 22,5 timer APF, mønster af GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, Ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b retinae var markant mere modne i den bageste region (figur 2). Fænotypen af disse retinae var sammenlignelig med vildtype-flyve-stammer (data ikke vist). Traditionelt puppe øje morfogenese beskrives efter udviklingsmæssige tid (f.eksHR APF). Men på grund af den markante udviklingsmæssige gradient vi foreslår beskriver øje mønster i henhold til følgende begivenheder:
1 ° indpakning (figur 2 og Movie 1): I første omgang så mange som otte celler direkte kontaktede fotoreceptor bundter. To celler - som regel forreste og bageste celler - blev ansat som primærvalg (1 ° s). Disse 1s hurtigt omringet fotoreceptor bundter, der forbinder til hinanden for at danne stabile knudepunkter. Udifferentierede interommatidial celler (ICS) lå i en uorganiseret måde mellem hver ommatidial gruppering. Samtidig med 1 ° celle rekruttering, apoptose beskæres ca. 5% af IC pulje som tidligere beskrevet (ikke kommenteret i Movie 1) 12.
IC intercalation (figur 2 og Movie 2): Som de 1 ° s indpakket og forseglet om hver fotoreceptor bundt, lokal cell bevægelser omorganiseret ICS grupperet på dorsale og ventrale sider af hver ommatidium. ICS indskudt fra flere (normalt to) rækker ind i en enkelt række. Målet stilling bevægelige IC'er kan trygt forudsiges i vildtype væv ved at observere den retningsbestemte projektion af store »cellulære udvidelser«. Vækst af de 1 ° celler ledsaget og sandsynligvis bidraget til IC interkalation 13. Mange IC'er vil gå på at differentiere som sekundære celler (2 ° s) (ikke vist).
3 ° konkurrence (figur 2 og Movie 3): Efter interkalation, tre IC'er konkurrerede at besætte den tertiære (3 °) niche. I denne dynamiske kamp, celler ofte besat 3 ° niche for så lidt som 5 til 10 min, inden den forskydes. Til sidst en enkelt celle etableret en stabil 3 ° niche.
Final beskæring (figur 2 og Movie 4): En bølge af apoptose 3,15-18 reduceret antallet af IC'er til den krævede for effektivt at generere en pæn sekskantet IC gitter over forbindelsen øjet 5,14 minimum: tre 3 ° s og seks 2 ° s omkring hver ommatidium. Som tidligere bemærket, sædvanligvis de overskydende ICs liggende tættest på børsterne blev elimineret ved apoptose 7. Vi observerede celledød samtidig med IC intercalation og 3 ° niche etablering og foreslå, at beskæring af overskydende celler bidraget til effektiviteten af disse begivenheder. Desuden blev subtile omplacering af børstehårsgrupper organules ofte observeret som ICs blev beskæres.
Figur 1:. Puppe dissektion og imaging (A) Laag fjernes fra en Drosophila puppe (vist her på 23 timer APF) for at blotlægge lederen af enNimal. Stiplede linie betegner et stykke dobbeltklæbende tape. (B) Illustration af den simple levende imaging rig. (C og D) med hoved udsat for, er puppe placeret ved ca. 35 ° hviler på vaseline perlen. (D) Højere forstørrelse billede af en puppe placeret på toppen af vaseline perle. Placeringen af dækglasset og målet er illustreret (ikke tegnet i skala). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2: En gradient af udviklingen på tværs af puppe øje. (A) Et enkelt billede af en puppe øje afbildet på 22,5 timer APF. Adherensovergange mærkes af DE-Cad: GFP og αCat: GFP. Boxed region er kommenteret i (C). (B) illustrationer af midten af scenen og fuldt mønstrede ommatidia, ved 24 og 41 timer APF henholdsvis. To 1 ° s (blå) omkranser en central gruppering af fire kegle celler (hvid). Med 41 timer APF mønsterdannelsen af interommatidial celler (lysegrå) er komplet: tre 3 ° s besætte alternative toppunkter og en enkelt 2 ° danner hver side af sekskant. Tre stritter organules (mørkegrå) omgiver hver ommatidium. (C) Annotation af en lille region af øjet (fra A). To 1 ° celler (eksempler pseudo-farvet lys blå) udvide til omslutte hver fotoreceptor bundt. ICS (grøn, gul, rød og mørkeblå) interkalerer i enkelte rækker. Ved hver alternativ toppunkt tre celler konkurrerer (skitseret i lyserød) at besætte 3 ° niche (farvet orange). Se film 1-4 til at overholde disse begivenheder udspiller sig. Klik her for at se en større version af denne figure.
Figur 3:. Resumé af den eksperimentelle procedure Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Film 1 :. Primær indpakning 1 ° celler selekteres fra puljen af celler, der omgiver hver spirende ommatidium. Som to 1 ° s omringe hver ommatidium og tilslut, adherensovergange hurtigt danne (lyserøde linjer). De lige 1 °: 1 ° celle vejkryds udvide og 1 ° s begynder at vokse, isolerende fotoreceptor bundter fra de omkringliggende ICS. Oprindeligt fotoreceptorer glød lyst, tæt GFP mærkning kunstfærdige adherensovergange. Morfologiske ændringer graduelt trække disse fotoreceptorer vejkryds under planet for billedbehandling og X-formede kryds mellem hvert sæt af fire apikale kegle celler oven hver ommatidium blive klarere. Originale billeder på venstre; pseudo-farvning og anmærkninger indført i paneler på højre. Eye afbildet fra 21 HR APF.
Movie 2 :. Interommatidial celle intercalaction De interommatidial celler (ICS) fremhæves i rød, blå, gul og grøn i første omgang danne en kvadrant adskille en dorsal (øverst) og ventrale (nederst) ommatidium ved en afstand på to celler. De røde og gule IC'er strække ventralt og dorsalt henholdsvis (fra t = 42 min), komme i kontakt med target 1 ° s med 56 min. De blå og grønne IC'er på samme måde udvides til at målrette overfor ommatidium. 'Ny' 1 °: IC vejkryds hurtigt at udvide til siden. Ved 112 min oprindelige kvadrant af IC'er har fuldt indskudt GEnerate en enkelt række af celler. Originale billeder på venstre; pseudo-farvning og anmærkninger indført i paneler på højre. Eye afbildet fra 23 HR APF.
Movie 3 :. Tertiær konkurrence på alternative toppunkter to eller tre celler (skitseret i lyserød) konkurrerer om at besætte 3 ° niche. Viser sig at "push" deres naboer til side, celler genererer store udvidelser, der når hen mod modsatte ommatidia. Besættelsesmagtens 3 ° niche (farvet orange) er ofte flygtig og celler enten trække eller skubbes ud af position, som deres naboer. Ved udgangen af denne 217 min film, mange 3 ° nicher vises etableret. Originale billeder på venstre; pseudo-farvning og anmærkninger indført i paneler på højre. Eye afbildet fra 23 HR APF.
Movie 4:. Final Beskæring Celler i nærheden af børstehårsgrupper organules fjernes ved apoptose. Eksempler er fremhævet med lilla, rød, gul og blå. I løbet af billedbehandling, fjernelse af celler forlod bare en 2 ° langs hver vandret arm af IC sekskant. Beskæring af overskydende celler på de diagonale sider af IC sekskant blev ikke fanget i denne film. I denne genotype mindre fejl i placeringen af børstehårsgrupper blev ofte observeret (sammenlign med figur 2B). To af de tre stritter grupper manøvreres ind i hjørne nicher under billedbehandling: re-positionering syntes at være lettet ved fjernelse og flytning af tilstødende ICS. Originale billeder på venstre; pseudo-farvning og anmærkninger indført i paneler på højre. Eye afbildet fra 26 HR APF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrivelsen af udviklingen vildtype (ovenfor) danner grundlag for sammenligninger af mønsterdannende begivenheder i RNAi eller overekspression genotyper. Sammenligninger af levende væv udvikling er uvurderlige, når det bestemmes præcist hvilken celle adfærd reguleres af et protein af interesse. Endvidere og ikke beskrevet her, live cell imaging gør det muligt at foretage kvalitative og / eller kvantitative beskrivelser af den rolle, som et gen af interesse i de begivenheder, mønster øjet. Ved 30-32 timer APF fleste pigment celler har erhvervet stabile positioner og apoptose er beskæres overskydende celler fra retinal område. Herefter er det kun subtile ændringer observeret som pigment celler vedtage deres karakteristiske figurer: 3 ° r bliver sekskantet, og som 1 ° s subtilt udvide bredden af de tilstødende rektangulære 2 ° celler falder. Efterfølgende generation af pigment og linser sandsynligvis hæmmer vellykket billeddannelse af adherensovergange.
Selvom en valuable strategi, skal flere faldgruber erindres, når billeddannelse live puppe øje. Først fjerner den forreste puppe sag gør dyret særligt sårbare over for dehydrering, overophedning og skade under montering og billedbehandling. Fornærmelser som disse kan forvirre data ved at fremkalde atypisk væv udvikling, der ikke er relevant for genotypen under eksamen. For det andet, protokollen beskrevet her kræver, at et dækglas tage direkte kontakt med den puppe hoved epitel. Vi har observeret, at retinal udvikling boder hvis overdreven tryk påføres, når skubbe dækglasset mod øjet. Faktisk eksogen mekaniske kræfter er blevet vist i andre systemer for at påvirke udviklingsprocesser herunder væv arkitektur 19,20. Af disse grunde er det vigtigt at meget forsigtigt placere dækglasset mod øjet. Derudover bør afbildet pupper skal reddes fra imaging rig og fik lov til at fremstå som voksne: artefakter indført under billedbehandling kanofte påvises ved at sammenligne den billeddannede øjne af disse voksne med øjne aldersmatchede fluer fra den oprindelige kors. Endvidere skal data fra flere imaging sessioner sammenlignes for at verificere celle adfærd. Endelig bør standard immunofluoresence anvendes til at bestemme, om arrangement, størrelse og antal af celler i fase-matchede væv er de samme.
Ektopisk DCR-2 anvendes ofte til at forbedre effektiviteten af RNAi. Men i nærværelse af ektopisk DCR-2, IC interkalering, stabilisering af 3 ° niche og apoptose blev lejlighedsvis forstyrret (data ikke vist). Således DCR-2-ekspression bør anvendes med forsigtighed.
Den her beskrevne protokol udnytter GFP til etiket adherensovergange og vurdere morfogenese af pigment celler i puppe øje. Denne strategi kunne nemt modificeres til andre formål (f.eks at vurdere fotoreceptor morfogenese). For en dobbelt-mærkning tilgang, ekstra UAS transgener, som mærker andre cellulære komponenter af interesse (f.eks sekretær vesikler, endoplasmatiske reticulum, nucleus) med ikke-GFP-tags kunne indarbejdes. Men intensiteten og levetiden af disse transgener vil kræve vurdering: RFP, DsRed og mCherry, for eksempel har vist sig at være dårlige etiketter til billeddannelse af puppe øje for de længere perioder, der kræves for at fange pigment celle mønster (data ikke vist). Hvis undersøge hurtige celle adfærd (f.eks sekretion) protokollen beskrevet her kan nemt modificeres til konfokal mikroskopi af egnede fluorescerende proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems |
References
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein. Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Cagan, R. Cell fate specification in the developing Drosophila. retina. Dev Suppl. , 19 (1993).
- Bate, M., Arias, A. M. Pattern formation in the Drosophila. retina. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1277-1325 (1993).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina. Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).
- Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).
- Lee, Y. S., et al. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell. 117, 69-81 (2004).
- Zitserman, D., Roegiers, F. Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae. J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. Waves of differentiation in the fly visual system. Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).
- Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye. PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina. Genes Dev. 1099, 1112 (1989).
- Miller, D. T., Cagan, R. L. Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina. Development. 125, 2327-2335 (1998).
- Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development. Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).
- Yu, S. Y., et al. A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye. Development. 129, 3269-3278 (2002).
- Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).
- Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation. Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).
