Abstract
ड्रोसोफिला पोटा संबंधी विकास के निहित प्रक्रियाओं पारी और लाइव सेल इमेजिंग के दौरान ट्रैक करने के लिए अलग-अलग सेल व्यवहार मुश्किल है कि बनाने के तरीके में आंख उपकला विकृत कर सकते हैं। इन प्रक्रियाओं में शामिल हैं: रेटिना रोटेशन, सेल के विकास और जीवधारी आंदोलन। प्यूपा यह चुनौतीपूर्ण एक भी फोकल हवाई जहाज़ में कुछ ommatidia से अधिक की फोकस छवियों को प्राप्त करने के लिए बना है, इमेजिंग के लिए तैयार किया जाता है के रूप में इसके साथ ही, सूक्ष्म समान है और सहित उपकला के टोपोलॉजी में अनियमितताओं अक्सर शुरू की सिलवटों। कार्यप्रवाह ड्रोसोफिला पोटा संबंधी आंख के विकास के दौरान सेलुलर प्रक्रियाओं की आसान विश्लेषण की अनुमति, उपचार यहां इन मुद्दों को रेखांकित किया। उचित मंचन pupae आसानी से सबसे प्रयोगशालाओं में इकट्ठा किया जा सकता है कि एक इमेजिंग रिग में व्यवस्थित कर रहे हैं Ubiquitin-डे-cadherin:। GFP और जीएमआर GAL4 संचालित यूएएस α-catenin: GFP के आंख उपकला एक में सेल सीमाओं कल्पना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं -3। Deconvolution के बाद हैकई फोकल विमानों पर कब्जा कर लिया फ्लोरोसेंट छवियों के लिए आवेदन किया, अधिकतम प्रक्षेपण छवियों हर समय बिंदु के लिए उत्पन्न और छवि संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग बढ़ा रहे हैं। संरेखण एल्गोरिदम ट्रैक करने के लिए अलग-अलग सेल व्यवहार को आसान बना रही है, जल्दी से ज़रूरत से ज़्यादा गति को स्थिर करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
Introduction
यौगिक ड्रोसोफिला आँख गौण वर्णक कोशिकाओं 4,5 के एक छत्ते-जाली द्वारा अलग अपने ~ 750 ommatidia के टकसाली व्यवस्था की विशेषता है। स्थानीय सेल आंदोलनों, सेल के विकास, सेल आकार में परिवर्तन, और apoptosis: ये वर्णक कोशिकाओं की घटनाओं की एक समन्वित संयोजन द्वारा नमूनों हैं। इस उपकला का लाइव दृश्य एक एक physiologically प्रासंगिक और बेफिक्र तीन आयामी संदर्भ में इन घटनाओं underpinning आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है।
पिछले प्रोटोकॉल 6,7 के विपरीत, यहाँ उल्लिखित तकनीक इमेजिंग प्रक्रिया से uncoupled नहीं किया जा सकता कि बाहरी ऊतक आंदोलन स्थिर रखने के लिए एक कारगर तरीका शामिल है। इमेजिंग के दौरान, बढ़ता घूमता है कि एक ऊतक, और पाली - इस विधि को विकसित करने ड्रोसोफिला पोटा संबंधी आंख उपकला में सेल व्यवहार के अध्ययन को बढ़ाता है। इसके अलावा गति स्थिरीकरण तकनीक डे मेंयहाँ मानते बाहरी आंदोलन तब होती है जहां अन्य संदर्भों में कोशिकाओं के अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा।
आंख-विशिष्ट चालक जीएमआर GAL4 1-3 के नियंत्रण के तहत GFP: GFP के रूप में अच्छी तरह से यूएएस α-catenin: ड्रोसोफिला रेटिना क्षेत्र में सेल सीमाओं कल्पना, ट्रांसजेनिक मक्खी लाइनों यूबीआई-डे-cadherin व्यक्त कि उत्पन्न किया गया। दो GFP टैग झिल्ली मार्कर का उपयोग कम तीव्रता प्रकाश में सेल सीमाओं के दृश्य के लिए अनुमति देता है। इस उच्च ऊर्जा तरंग दैर्ध्य के लिए कई बार प्रदर्शन, सक्रिय करने के वृद्धि की फ्रेम दर और फिल्म की अवधि पर ऊतकों को नुकसान और photobleaching को कम करता है। यूएएस DCR-2 भी एक दूसरे उड़ लाइन 8 में शामिल किया गया था आरएनएआई ट्रांसजीन, की प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए।
पिछले प्रोटोकॉल से एक तिहाई अद्यतन में, आसानी से सबसे प्रयोगशालाओं में इकट्ठा होता है कि एक सरल इमेजिंग रिग में वर्णित है। यह उपकरण एक विशेष इमेजिंग R है की आवश्यकता obviatesपुलिस महानिरीक्षक एक विश्वविद्यालय की 'मशीन की दुकान' या इसी तरह की सेवा के द्वारा उत्पन्न। इस इमेजिंग रिग छवि अन्य पोटा संबंधी ऊतकों 9,10 करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि इसी तरह है।
सीधे 17-42 घंटा puparium गठन (एचआर APF) के बाद ~ से आंख patterning के लिए योगदान करते हैं कि morphogenetic घटनाओं का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक साधारण रहते सेल इमेजिंग प्रोटोकॉल यहाँ है प्रस्तुत किया। विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल पोटा संबंधी विकास के दौरान जीन की अभिव्यक्ति को संशोधित करने के परिणामों को निर्धारित करने के लिए एक सक्षम बनाता है।
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Protocol
चित्रा 3 प्रयोगात्मक प्रक्रिया का एक सारांश से पता चलता है।
1. ऊतक तैयारी
- सी दो प्रतियों में निम्नलिखित पार की स्थापना की ब्याज की एक जीन की संशोधित अभिव्यक्ति के परिणामों का निर्धारण और 25 डिग्री पर बनाए रखने के लिए: यूएएस transgene (पुरुषों) एक्स जीएमआर GAL4; यूएएस α-बिल्ली: GFP, यूबीआई-डे-सीएडी: GFP के; + / SM5-TM6b (कुंवारी महिलाओं) नोट: नियंत्रण ऊतक पार यूएएस lacZ प्राप्त करने के लिए जीएमआर GAL4 पुरुषों; यूएएस α-बिल्ली: GFP, यूबीआई-डे-सीएडी: GFP महिलाओं। β-galactosidase रेटिना में सेल व्यवहार में कोई दोष उत्पन्न करता है।
- आरएनएआई transgenes की प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए, पार यूएएस आरएनएआई जीएमआर GAL4, यूएएस DCR-दो पुरुषों; यूएएस α-बिल्ली: GFP, यूबीआई-डे-सीएडी: GFP के; + / SM5-TM6b कुंवारी महिलाओं।
नोट: अस्थानिक DCR-दो मनाया गया है व्यक्त दृष्टिपटल में सेल व्यवहार में समसामयिक दोष (डेटा) नहीं दिखाया। सतर्कता इस दृष्टिकोण का उपयोग अगर सिफारिश की है। - एस1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में चुनाव सफेद उपयुक्त जीनोटाइप के पूर्व pupae और जगह। Pupae DCR-दो को व्यक्त करते हैं, तो पुरुष या महिला pupae का चयन करें: यूएएस DCR-2, एक्स गुणसूत्र पर एक डालने की अभिव्यक्ति पुरुषों में मजबूत है। Pupae पोटा संबंधी मामले की रंजकता से पहले शून्य घंटा APF पर sexed किया जाना चाहिए - पुरुषों के gonads प्यूपा (पीछे से लगभग एक तिहाई) के पार्श्व पक्षों पर बड़े पारदर्शी ग्लोब के रूप में दिखाई दे रहे हैं।
- 25 डिग्री सेल्सियस पर एक साफ प्लास्टिक टिप-बॉक्स में, pupae युक्त microcentrifuge ट्यूब सेते हैं। Pupae जगह की नोक-बॉक्स में आसुत पानी में भिगो ऊतक के एक 10 सेमी दो टुकड़ा, सुखाना रोकने के लिए।
नोट: टिप-बॉक्स में नमी बहुत अधिक हो जाता है अगर पोटा संबंधी मामले बाद के चरणों में काटना गीला और मुश्किल हो सकता है। - उचित समय के लिए सेते हैं। लगभग 17 घंटा APF, 20 घंटा APF या 24 घंटा एपी में इमेजिंग के लिए pupae तैयार करते हैं, आंख patterning के साथ जुड़े सेल व्यवहार पर कब्जा करने के लिएएफ विशेष सेल व्यवहार सबसे अच्छा मनाया जाता है जब पर आगे चर्चा के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें।
- एक काले रंग की Sylgard विच्छेदन पकवान पर ताजा डबल पक्षीय टेप का एक टुकड़ा रखें। डबल पक्षीय टेप (चित्रा 1 ए) का पालन किया प्यूपा के सिर के साथ, ऊपर एक प्यूपा, पृष्ठीय पक्ष की स्थिति .Try डबल पक्षीय टेप करने के प्यूपा के वक्ष और उदर क्षेत्रों पालन करने के लिए नहीं। संदंश के साथ सावधानी से उठा और पोटा संबंधी सिर बेनकाब करने के लिए operculum हटा दें। एक आंख के आसपास के क्षेत्र को बेनकाब करने के लिए पोटा संबंधी मामले के पक्ष के साथ आंसू।
- धीरे चिपकने वाला टेप से प्यूपा को हटा दें। प्यूपा पक्षपाती रहता है, तो आसंजन कमजोर करने के लिए पोटा संबंधी मामले और टेप के बीच जंक्शन आसुत पानी की एक छोटी मात्रा लागू होते हैं।
2. बढ़ते
- सोख्ता कागज से एक छोटे से 15 मिमी दो फ्रेम का निर्माण और middlethat में एक छेद पंच व्यास में 5.5 मिमी (चित्रा 1 बी) है। आसुत जल और जगह में में विसर्जितएक खुर्दबीन स्लाइड के केंद्र। पेट्रोलियम जेली का एक समान अंगूठी बाहर निचोड़, एक 30 सीसी सिरिंज का प्रयोग सोख्ता कागज फ्रेम के चारों ओर। पेट्रोलियम जेली अंगूठी प्यूपा की चौड़ाई से और अंगूठी के व्यास एक कवर पर्ची की चौड़ाई से मामूली कम है कि सीमांत रूप से उच्च है कि सुनिश्चित करें।
- पेट्रोलियम जेली मनका (चित्रा -1) द्वारा समर्थित अपने पक्ष पर, .Carefully प्यूपा व्यवस्था सोख्ता कागज (चित्रा 1C) में छिद्रित छेद, में, सीधे स्लाइड पर पेट्रोलियम जेली का एक छोटा सा मनका जोड़ें।
- पेट्रोलियम जेली की अंगूठी के शीर्ष पर एक coverslip जगह यह संपर्कों आंख neuroepithelium (चित्रा -1) के ऊपर उपकला सकें। धीरे पेट्रोलियम जेली के खिलाफ coverslip मुहर और पोटा संबंधी आंख क्षेत्र और coverslip के बीच एक छोटे से फ्लैट संपर्क सतह उत्पन्न करने के लिए तैयारी सेक।
3. प्रतिदीप्ति इमेजिंग
- छवि एक का उपयोग करते हुए पोटा संबंधी तैयारीफ्लोरोसेंट खुर्दबीन। हर 7 मिनट पर कब्जा adherens जंक्शनों के क्षेत्र में आंख neuroepithelium के शिखर डोमेन, के माध्यम से धारावाहिक वर्गों।
नोट: एक) उपयुक्त धारावाहिक वर्गों आमतौर पर 4-5 0.2 माइक्रोन Z-चरणों के शामिल z ढेर प्रति कर रहे हैं। ख) हल्के समान है और सिलवटों सहित उपकला के टोपोलॉजी में अनियमितताएं, ऊतक के बड़े क्षेत्रों में फोकस छवियों को प्राप्त करने के लिए यह चुनौतीपूर्ण बना सकते हैं। इमेजिंग, जबकि एक में फोकस होने के लिए ब्याज की एक क्षेत्र का हिस्सा मिल सकता है, और एक पड़ोसी क्षेत्र से बाहर का ध्यान केंद्रित किया जाना है। पोटा संबंधी आंख और coverslip के बीच आसुत पानी की एक छोटी छोटी बूंद सहित पोटा संबंधी आंख morphogenesis के प्रारंभिक दौर के हल्का असमान टोपोलॉजी लक्षण कुछ तीव्र ऊतक सिलवटों लेकिन नहीं समाप्त कर सकते हैं। इन उदाहरणों में में फोकस स्लाइस पूरे क्षेत्र के लिए अधिग्रहीत कर रहे हैं जब तक z ढेर बढ़ा कर ऊतक oversample। ग) हर 7 मिनट में एक महत्वपूर्ण redu बिना 3 घंटा से 4 के लिए जी-इमेजिंग सक्षम होना चाहिए धारावाहिक वर्गों को पकड़नाछवि गुणवत्ता में समझौता हो सकता है कि GFP प्रतिदीप्ति की तीव्रता में ction है। छोटे समय-अंतराल इमेजिंग के कुल समय को कम कर सकते हैं। - 3 से 4 घंटे के लिए इमेजिंग जारी रखें। पोटा संबंधी विकास और Hemolymph के पंप रेटिना और की स्थिति चलता है के बाद से कई फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर उपलब्ध है कि एक स्वत: ध्यान और समय समारोह का प्रयोग न करें सतर्क फिर से ध्यान केंद्रित करने के लिए हर 14-21 मिनट के लिए आवश्यक है। धीमी गति से या आंख के morphogenesis स्टाल सकता है 4 घंटे से परे है कि इमेजिंग ध्यान दें।
- पृष्ठभूमि को कम करने और धारावाहिक अनुभाग छवियों के विपरीत बढ़ाने के लिए उपयुक्त deconvolution के सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें। प्रत्येक z ढेर फ़ाइल के लिए, (सामग्री की तालिका देखें) लास वायुसेना सॉफ्टवेयर में निम्न कार्य: उपकरण पैनल नेविगेट करने के लिए, 3 डी Deconvolution का चयन करें और लागू करें क्लिक करें।
- प्रत्येक deconvoluted स्टैक फ़ाइल के लिए कोई अधिकतम प्रक्षेपण (मध्य प्रदेश) छवि उत्पन्न: उपकरण पैनल नेविगेट करने के लिए, 3 डी प्रोजेक्शन का चयन करें और लागू करें क्लिक करें।
नोट: अधिकतम प्रक्षेपण एल्गोरिथ्म एक समान उत्पन्न करने के लिए असफल हो सकता हैoversampled कर दिया गया है कि ऊतक के लिए है ly में फोकस छवि। बाहर का ध्यान केंद्रित क्षेत्रों sharpening के लिए एक तकनीक कदम 5.2 में उल्लिखित है।
4. पोटा संबंधी बचाव और phenotype सत्यापन पोस्ट-इमेजिंग
- संदंश coverslip को दूर करने और भोजन की एक साफ शीशी प्यूपा हस्तांतरण का उपयोग: कलाकृतियों शुरू की या इमेजिंग के दौरान नुकसान पहुंचाया प्यूपा, ध्यान से इमेजिंग रिग से प्यूपा को हटा रहे थे कि क्या पता करने के लिए। कमरे के तापमान पर स्टोर या 25 डिग्री सेल्सियस वयस्क मक्खी उभर जब तक।
- ध्यान से वयस्क आंख के phenotype की जांच करने और मूल मक्खी पार से उभरते वयस्क मक्खियों की आंखों से तुलना करें।
5. छवि प्रसंस्करण
- स्वचालित छवि संरेखण:
नोट: लाइव ड्रोसोफिला ऊतक पारी और इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान विकसित होगा। नतीजतन, छवियों के केन्द्रों ड्रोसोफिला ऊतक में एक ही बिंदु के अनुरूप नहीं हो सकता है लगातार समय बिंदुओं पर एकत्र हुए। इसके साथ - साथपूरे रेटिना डिस्क ~ 21 और 23 घंटा APF के बीच लगभग 30 डिग्री घुमाता है। अलग-अलग सेल व्यवहार पर प्रकाश डाला और जीवधारी वृद्धि की वजह से distractions से कम है, इस मैन्युअल रूप से किया जा सकता है प्रत्येक सांसद image.While, यहां इस्तेमाल छवि संपादन सॉफ्टवेयर संरेखित करने के लिए प्रक्रिया को तेज कर सकते हैं कि निर्मित में एल्गोरिदम गया है (सामग्री की तालिका देखें)।- ढेर में मुख्य मेनू, खुले लिपियों और चयन लोड फ़ाइलों का फ़ाइल टैब से।
- लोड परतें पैनल में सांसद छवि फ़ाइलें आयात और ठीक चुनें। स्वचालित रूप से स्रोत चित्रों विकल्प संरेखित करने का प्रयास चयनित नहीं है कि सुनिश्चित करें।
नोट: यह विकल्प चुना जाता है, सॉफ्टवेयर छवि डेटा distorts कि एक संरेखण कलन विधि का उपयोग कर सकते हैं। - सभी सांसद फ़ाइलें परतें फलक में लोड करने के बाद, सभी छवियों को जल्द से जल्द समय बिंदु परत ढेर के शीर्ष पर है कि इस तरह के कालानुक्रमिक क्रम में कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें। परतों को सही क्रम, खींचें में नहीं हैं और वे आदेश दिए हैं, जब तक उन्हें ड्रॉपसही ढंग से।
- मुख्य मेनू के संपादित करें टैब से ऑटो-align परतों का चयन। Reposition चुनें और ठीक क्लिक करें।
- ऑटो-align एल्गोरिथ्म एक प्रासंगिक केन्द्र बिन्दु को फ्रेम पूरबी करने में विफल रहता है, तो इस कदम उपकरण का उपयोग कर नाबालिग समायोजन करें।
- कम्पोजिट तेज़:
नोट: एक प्रारंभिक सांसद छवि से बाहर का ध्यान केंद्रित क्षेत्रों 'फसल' लास वायुसेना सॉफ्टवेयर में इसी deconvoluted ढेर से बढ़ाई जा सकती है। एक ढेर फ़ाइल फसल एक मैन्युअल रूप से अधिकतम प्रक्षेपण एल्गोरिथ्म के अधीन है कि एक z ढेर के अंतराल को प्रतिबंधित करने की अनुमति देता है।- (प्रक्रिया टैब के अंतर्गत) उपकरण पैनल में फसल समारोह का पता लगाएँ। मैन्युअल वे शुरू में बाहर का ध्यान केंद्रित क्षेत्र के भीतर ही आसंजन बेल्ट अवधि ऐसी है कि प्रारंभिक और अंतिम स्लाइस सीमित। इस क्षेत्र के लिए अनुकूलित है कि एक नया स्टैक फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए लागू करें पर क्लिक करें।
- एक झगड़ा फ़ाइल के रूप में स्थानीय रूप से अनुकूलित हो चुकी है और निर्यात के लिए एक नया अधिकतम प्रक्षेपण उत्पन्न करता है।
- वें मेंई छवि संपादन सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका देखें), ढेर में (मुख्य मेनू की फ़ाइल टैब में स्थित) खुला लिपियों और चयन लोड फ़ाइलें।
- लोड परतें पैनल में एक विशेष समय बिंदु के लिए प्रारंभिक सांसद छवि फ़ाइल और स्थानीय स्तर पर अनुकूलित सांसद फ़ाइल आयात और ठीक चुनें। स्वचालित रूप से स्रोत चित्रों विकल्प संरेखित करने का प्रयास चयनित नहीं है कि सुनिश्चित करें।
- फलक परतें में दोनों परतों का चयन करें और फिर एक समान रूप से रेटिना क्षेत्र में फोकस उपज स्वचालित रूप से दो छवियों के उचित क्षेत्रों मुखौटा करने के लिए (मुख्य मेनू के संपादित करें टैब में स्थित) ऑटो ब्लेंड परतें चुनें। एक झगड़ा फ़ाइल के रूप में यह संयुक्त छवि बचाने के लिए।
- दोहराएँ सभी उपअनुकूलित सांसद छवियों के लिए 5.2.5 के माध्यम से 5.2.1 कदम।
- आगे समायोजन: घुमाएँ, फसल, और समायोजित मूवी परतें का स्तर:
- सभी परतों के चयनित साथ रेटिना के पृष्ठीय उदर अक्ष गठबंधन किया है, इसलिए है कि छवियों को बारी बारी से करने के लिए रूपांतरण उपकरण (संपादित करें> नि: शुल्क रूपांतरण) का उपयोगफिल्म फ्रेम के y अक्ष के लिए।
- यदि आवश्यक हो, एक वांछित आकार और आकृति को देखने के क्षेत्र को कम करने के लिए फसल उपकरण का उपयोग करें।
- कोशिका झिल्ली और सेल शरीर के बीच इसके विपरीत बढ़ाने में मदद करने के लिए (व्यक्तिगत फ्रेम) के स्तर समायोजन का प्रयोग करें।
- शैलीगत प्रयोजनों के लिए और प्रत्येक फ्रेम में ब्याज के अंक को उजागर करने के झूठे रंग लागू करने, विशेष सेल व्यवहार पर जोर देना।
- एनिमेशन: एक फिल्म में छवियों को बदलने:
- मुख्य मेनू के Windows टैब से एनिमेशन फलक खोलें। एनिमेशन फलक के ऊपरी दाहिने हाथ कोने में स्थित मेनू से परतों से फ्रेम बनाने का चयन करें।
- परतों ढेर के नीचे से शुरुआत अनुक्रमिक क्रम में एनीमेशन फलक को जोड़ रहे हैं कि ध्यान दें। पहला फ्रेम के सभी का चयन करें और फिर एनिमेशन फलक मेनू से रिवर्स फ्रेम्स का चयन करें, तख्ते के आदेश रिवर्स करने के लिए।
- फ्रेम अंगूठे के नीचे लटकती मेनू का उपयोग करते हुए प्रत्येक फ्रेम के लिए एक फ्रेम देरी समय का चयन करेंनाखून।
नोट: 1 इस अखबार में प्रस्तुत करने के लिए 4 फिल्म के लिए फ्रेम देरी 0.8 सेकंड है। - और मुख्य मेनू, खुले निर्यात की फ़ाइल टैब से वीडियो प्रस्तुत चयन करें। फाइल विकल्प के तहत QuickTime निर्यात चुनें और एक वांछित वीडियो प्रारूप का चयन करें। विकल्प कस्टम करने के लिए फ्रेम दर निर्धारित प्रस्तुत करना तहत, 15 के एक फ्रेम दर दर्ज करें, और प्रस्तुत करना पर क्लिक करें।
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Representative Results
पोटा संबंधी आँख का लाइव-इमेजिंग neuroepithelium की patterning के लिए योगदान करते हैं कि सेल व्यवहार का पालन करने के लिए एक सफल रणनीति है। विशिष्ट प्रोटीन की भूमिका आसानी से आंख के विकास के दौरान प्रोटीन के स्तर को संशोधित कि ट्रांसजीन व्यक्त द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। इस जीएमआर GAL4 ऐसा करने के लिए morphogenetic कुंड के पीछे transgene अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह पहली बार दो लार्वा instars दौरान आंख क्षेत्र की स्थापना है कि पहले की घटनाओं perturbing नहीं का लाभ प्रदान करता है। इसके अलावा कई आरएनएआई ट्रांसजीन प्रभावी रूप से (डेटा अब दिखाया गया है) प्रोटीन का स्तर कम करने के लिए महत्वपूर्ण समय की आवश्यकता है। जीएमआर GAL4 ड्राइवर लाइन अक्सर पूरा हुआ आगे बढ़ने के लिए कायापलट के दौरान आंख डिस्क के तीसरे लार्वा instar आंख विकास और eversion सक्षम बनाता है और काफी पोटा संबंधी आंख morphogenesis दौरान, केवल बाद में प्रोटीन का स्तर कम कर देता है के साथ इसलिए आरएनएआई ट्रांसजीन चला। लार्वा विकास हालांकि एक अत्यधिक कुशल आरएनएआई transgene से परेशान है, तो पार कर सकते हैं मक्खी0 घंटा APF में 25 डिग्री सेल्सियस को हस्तांतरित transgene अभिव्यक्ति और pupae कम करने के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाना। आरएनएआई transgene अभिव्यक्ति, प्रतिलिपि या प्रोटीन के स्तर की प्रभावकारिता को संबोधित करने के लिए (जैसे मात्रात्मक पीसीआर, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, immunoblotting) मानक तकनीक का उपयोग कर मंच से मिलान किए pupae में मूल्यांकन किया जाना चाहिए।
लार्वा विकास के दौरान, प्रत्येक ommatidium की फोटोरिसेप्टर कोर आंख डिस्क 11 के पूर्वकाल पक्ष को पीछे से यात्रा है कि एक लहर के रूप में भर्ती कर रहे हैं। इस विकास ढाल पोटा संबंधी आंख में बनाए रखा गया था। दरअसल, जब 22.5 घंटा APF, जीएमआर GAL4, यूएएस DCR-2 की patterning पर imaged; यूएएस α-बिल्ली: GFP, यूबीआई-डे-सीएडी: GFP के; + / SM5-TM6b दृष्टिपटल (चित्रा 2) पीछे क्षेत्र में स्पष्ट रूप से और अधिक परिपक्व हो गया था। इन दृष्टिपटल के phenotype जंगली प्रकार की मक्खी उपभेदों के बराबर था (डेटा) नहीं दिखाया। परंपरागत रूप से पोटा संबंधी आंख morphogenesis विकासात्मक समय के अनुसार वर्णित है (उदाहरण के लिएघंटा APF)। हालांकि, स्पष्ट विकासात्मक ढाल की हम निम्न इवेंट के अनुसार आंख patterning के वर्णन करने का प्रस्ताव है क्योंकि:
1 ° लपेटकर (चित्रा 2 और मूवी 1): प्रारंभ में के रूप में कई के रूप में आठ कोशिकाओं सीधे फोटोरिसेप्टर बंडलों से संपर्क किया। दो कोशिकाओं - आम तौर पर पूर्वकाल और कूल्हों कोशिकाओं - प्राइमरी (1 ° एस) के रूप में भर्ती किया गया। ये 1s तेजी से स्थिर जंक्शनों के लिए फार्म का एक दूसरे से जोड़ने, फोटोरिसेप्टर बंडलों घेर लिया। Undifferentiated interommatidial कोशिकाओं (आईसीएस) प्रत्येक ommatidial समूहीकरण के बीच एक बेतरतीब ढंग से रखना। 1 ° सेल भर्ती साथ सहवर्ती, apoptosis के 12 (नहीं 1 मूवी में एनोटेट) पहले से वर्णित के रूप में आईसी पूल के लगभग 5% pruned।
आईसी मध्यनिवेश (चित्रा 2 और मूवी 2): 1 ° एस लपेटा और प्रत्येक फोटोरिसेप्टर बंडल के बारे में सील के रूप में, स्थानीय सीईडालूँगा आंदोलनों प्रत्येक ommatidium के पृष्ठीय और उदर पक्ष में वर्गीकृत किया है आईसीएस पुनर्गठित। एकाधिक से intercalated आईसीएस एक ही पंक्ति में (आमतौर पर दो) पंक्तियों। आगे बढ़ आईसीएस के लक्ष्य की स्थिति आत्मविश्वास से बड़ी 'सेलुलर एक्सटेंशन' की दिशात्मक प्रक्षेपण देख द्वारा जंगली प्रकार के ऊतकों में भविष्यवाणी की जा सकती है। 1 ° कोशिकाओं के विकास के साथ और संभावना आईसी मध्यनिवेश 13 के लिए योगदान दिया। कई आईसीएस माध्यमिक कोशिकाओं (2 ° एस) के रूप में अंतर करने के लिए पर जाना होगा () नहीं दिखाया।
3 ° प्रतियोगिता (चित्रा 2 और मूवी 3): मध्यनिवेश के बाद, तीन आईसीएस तृतीयक (3 °) आला पर कब्जा करने के लिए प्रतिस्पर्धा की। इस गतिशील लड़ाई में, कोशिकाओं अक्सर विस्थापित किया जा रहा से पहले के रूप में छोटे 5-10 के रूप में मिनट के लिए 3 डिग्री आला कब्जा कर लिया। अंततः एक सेल में एक स्थिर 3 ° आला की स्थापना की।
अंतिम छंटाई (चित्रा 2 और मूवी 4): Apoptosis के 3,15-18 का एक रेला कुशलतापूर्वक यौगिक आँख 5,14 भर में एक स्वच्छ हेक्सागोनल आईसी जाली उत्पन्न करने के लिए आवश्यक न्यूनतम करने के लिए आईसीएस की संख्या कम: तीन तीन डिग्री है और प्रत्येक ommatidium लगभग छह 2 ° एस। जैसा कि पहले उल्लेख है, आमतौर पर बाल के सबसे करीब झूठ बोल रही है उन अतिरिक्त आईसीएस apoptosis को 7 से सफाया कर रहे थे। हम आईसी मध्यनिवेश और 3 ° आला स्थापना के साथ कोशिका मृत्यु सहवर्ती मनाया जाता है और इन घटनाओं की दक्षता के लिए योगदान अतिरिक्त कक्षों की कि छंटाई का प्रस्ताव। आईसीएस pruned रहे थे के रूप में इसके अलावा, बाल खड़े organules के सूक्ष्म फिर से स्थिति अक्सर मनाया गया।
चित्रा 1:। पोटा संबंधी विच्छेदन और इमेजिंग (ए) operculum (23 घंटा APF पर यहाँ दिखाया गया है) एक ड्रोसोफिला प्यूपा से निकाल दिया जाता है एक के सिर को बेनकाब करने के लिएनिर्मल। बिंदीदार रेखा डबल पक्षीय टेप का एक टुकड़ा का प्रतिनिधित्व करता है। सरल रहते इमेजिंग रिग का (बी) के चित्रण। सिर उजागर के साथ (सी और डी), प्यूपा के बारे में 35 डिग्री पेट्रोलियम जेली मनका पर आराम पर तैनात है। (डी) पेट्रोलियम जेली मनका के ऊपर तैनात एक प्यूपा के उच्च बढ़ाई छवि। coverslip और उद्देश्य की स्थिति (पैमाने पर करने के लिए तैयार नहीं है) सचित्र हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: पोटा संबंधी आंख भर में विकास की एक ढाल। (ए) 22.5 घंटा APF पर imaged एक पोटा संबंधी आंख की एक छवि। GFP और αCat: Adherens जंक्शनों डे-पाजी द्वारा चिह्नित कर रहे हैं GFP। बॉक्सिंग क्षेत्र में एनोटेट है (सी)। (बी) में क्रमश: 24 और 41 घंटा APF पर मध्य चरण और पूरी तरह से नमूनों ommatidia, का रेखांकन। दो एक ° एस (नीला) के चार शंकु कोशिकाओं (सफेद) के एक केंद्रीय समूहीकरण घेरना। Interommatidial कोशिकाओं (प्रकाश ग्रे) की patterning APF 41 घंटा तक पूरा हो गया है: तीन तीन डिग्री की वैकल्पिक कोने और एक भी 2 डिग्री रूपों षट्भुज के प्रत्येक पक्ष पर कब्जा। तीन organules (डार्क ग्रे) प्रत्येक ommatidium चारों ओर बाल खड़े। (ए) से आँख के एक छोटे से क्षेत्र (सी) एनोटेशन। दो एक डिग्री कोशिकाओं (छद्म रंग हल्का नीला उदाहरण) प्रत्येक फोटोरिसेप्टर बंडल घेरना का विस्तार करें। एकल पंक्तियों में आईसीएस (हरे, पीले, लाल और नीले रंग के अंधेरे) intercalate। (गुलाबी रंग में उल्लिखित) तीन कोशिकाओं प्रतिस्पर्धा प्रत्येक विकल्प के शीर्ष पर तीन डिग्री आला (रंग नारंगी) पर कब्जा करने के लिए। खुलासा इन घटनाओं निरीक्षण करने के लिए सिनेमा 1-4 देखें। इस figur का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंई।
चित्रा 3:। प्रयोगात्मक प्रक्रिया का सारांश यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
मूवी 1 :। प्राथमिक लपेटकर एक डिग्री कोशिकाओं प्रत्येक नवेली ommatidium आसपास की कोशिकाओं के पूल से चयनित हैं। दो एक डिग्री के प्रत्येक ommatidium घेरना और कनेक्ट के रूप में, जंक्शनों तेजी (गुलाबी लाइनों) फार्म adherens। सीधे एक डिग्री: 1 ° सेल जंक्शनों के विस्तार और एक डिग्री के आसपास के आईसीएस से फोटोरिसेप्टर बंडलों इन्सुलेट, विकसित करने के लिए शुरू करते हैं। प्रारंभ में फोटोरिसेप्टरों विस्तृत adherens जंक्शनों अंकन, चमकते घने GFP चमक। रूपात्मक gra में परिवर्तनdually साफ हो ommatidium इमेजिंग और प्रत्येक के ऊपर चार शिखर शंकु कोशिकाओं के प्रत्येक सेट के बीच एक्स के आकार का जंक्शनों के विमान नीचे इन फोटोरिसेप्टर जंक्शनों आकर्षित। बाईं तरफ के मूल छवियों; छद्म रंग और एनोटेशन सही पर पैनल में पेश किया। नेत्र 21 घंटा APF से imaged।
फिल्म 2 :। Interommatidial सेल intercalaction interommatidial कोशिकाओं (आईसीएस) में प्रकाश डाला, लाल, नीले, पीले और दो कोशिकाओं की दूरी से एक पृष्ठीय (ऊपर) और उदर (नीचे) ommatidium को अलग करने के लिए एक वृत्त का चतुर्थ भाग फार्म शुरू में हरे। लाल और पीले रंग आईसीएस 56 मिनट से लक्ष्य के साथ एक डिग्री के संपर्क बनाने, पेट के बल और पीछे की ओर क्रमशः (टी = 42 मिनट से) खिंचाव। नीले और हरे रंग आईसीएस इसी प्रकार विपरीत ommatidium लक्षित करने के लिए करता हूं। 'नया' एक डिग्री: आईसी जंक्शनों तेजी पार्श्व विस्तार। 112 मिनट में आईसीएस की मूल वृत्त का चतुर्थ भाग जीई के लिए पूरी तरह से intercalated हैकोशिकाओं का एक ही पंक्ति nerate। बाईं तरफ के मूल छवियों; छद्म रंग और एनोटेशन सही पर पैनल में पेश किया। नेत्र 23 घंटा APF से imaged।
मूवी 3 :। तृतीयक प्रतियोगिता वैकल्पिक कोने में दो या तीन कोशिकाओं (गुलाबी रंग में उल्लिखित) 3 ° आला पर कब्जा करने के लिए प्रतिस्पर्धा करते हैं। 'पुश' प्रदर्शित होने के अपने पड़ोसियों, एक तरफ कोशिकाओं विपरीत ommatidia की ओर तक पहुँचने कि बड़े एक्सटेंशन उत्पन्न करते हैं। 3 ° आला (रंग नारंगी) पर कब्जा अक्सर क्षणभंगुर है और कोशिकाओं को वापस लेना या उनके पड़ोसियों द्वारा स्थिति से बाहर धकेल रहे हैं या तो। इस 217 मिनट की फिल्म के अंत तक कई 3 ° आलों स्थापित दिखाई देते हैं। बाईं तरफ के मूल छवियों; छद्म रंग और एनोटेशन सही पर पैनल में पेश किया। नेत्र 23 घंटा APF से imaged।
मोहोड़ 4:। अंतिम Pruning बाल खड़े organules के आसपास के क्षेत्र में कोशिकाओं apoptosis से हटा रहे हैं। उदाहरण, बैंगनी, लाल, पीले और नीले रंग में डाला जाता है। इमेजिंग के दौरान, कोशिकाओं को हटाने के आईसी षट्भुज के प्रत्येक क्षैतिज बांह के साथ बस एक दो डिग्री छोड़ दिया है। आईसी षट्भुज के विकर्ण पक्षों पर अतिरिक्त कक्षों की छंटाई इस फिल्म में कब्जा नहीं कर रहा था। इस जीनोटाइप में बाल खड़े समूहों की नियुक्ति में मामूली त्रुटियों अक्सर (चित्रा 2B के साथ तुलना) मनाया गया। तीन में से दो इमेजिंग के दौरान कोने आलों में चतुराई समूहों बाल खड़े: स्थिति फिर से पड़ोसी आईसीएस के हटाने और आंदोलन द्वारा मदद की जा दिखाई दिया। बाईं तरफ के मूल छवियों; छद्म रंग और एनोटेशन सही पर पैनल में पेश किया। नेत्र 26 घंटा APF से imaged।
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Discussion
जंगली प्रकार के विकास (ऊपर) का विवरण आरएनएआई में patterning घटनाओं या overexpression जीनोटाइप की तुलना के लिए आधार बनाता है। सेल व्यवहार ब्याज की एक प्रोटीन द्वारा विनियमित रहे हैं जो ठीक निर्धारण करते समय रहते ऊतक विकास की तुलना अमूल्य रहे हैं। इसके अलावा, और यहाँ वर्णित नहीं, जीना सेल इमेजिंग एक पैटर्न है कि आंख की घटनाओं में ब्याज की एक जीन की भूमिका के गुणात्मक और / या मात्रात्मक वर्णन करने के लिए सक्षम बनाता है। 30-32 घंटा APF तक का सबसे वर्णक कोशिकाओं स्थिर पदों पर प्राप्त कर लिया है और apoptosis रेटिना क्षेत्र से अतिरिक्त कोशिकाओं pruned गया है। एक डिग्री की आसानी के विस्तार के रूप में पड़ोसी आयताकार 2 ° कोशिकाओं की चौड़ाई कम हो जाती है, 3 ° हेक्सागोनल हो गया है और इस के बाद, केवल सूक्ष्म परिवर्तन वर्णक कोशिकाओं उनकी विशेषता आकृतियों को अपनाने के रूप में मनाया जाता है। वर्णक और लेंस सामग्री के बाद की पीढ़ी की संभावना adherens जंक्शनों के सफल इमेजिंग बाधित।
एक वैल हालांकिलाइव पोटा संबंधी आंख जब इमेजिंग uable रणनीति, कई नुकसान को ध्यान में वहन किया जाना चाहिए। सबसे पहले, पूर्वकाल पोटा संबंधी मामले को हटाने के बढ़ते और इमेजिंग के दौरान निर्जलीकरण, overheating, और चोट करने के लिए पशु विशेष रूप से कमजोर बना देता है। इन जैसे अपमान परीक्षा के तहत जीनोटाइप के लिए प्रासंगिक नहीं है कि असामान्य ऊतक विकास उत्प्रेरण द्वारा डेटा उलझाना कर सकते हैं। दूसरा, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक गिलास coverslip पोटा संबंधी सिर उपकला के साथ सीधा संपर्क बनाने की आवश्यकता है। हम आंख के खिलाफ coverslip के धकेलने जब अत्यधिक दबाव लागू किया जाता है अगर रेटिना विकास स्टालों कि मनाया है। दरअसल बहिर्जात यांत्रिक बलों ऊतक वास्तुकला 19,20 सहित विकास की प्रक्रिया को प्रभावित करने के लिए अन्य प्रणालियों में दिखाया गया है। इन कारणों के लिए यह बहुत ही धीरे आंख के खिलाफ coverslip जगह के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, imaged pupae इमेजिंग रिग से बचाया और वयस्कों के रूप में उभरने के लिए अनुमति दी जानी चाहिए: कलाकृतियों इमेजिंग के दौरान पेश कर सकते हैंअक्सर मूल पार से उम्र से मिलान मक्खियों की आंखों के साथ इन वयस्कों के imaged की आँख से तुलना करके पता लगाया जा। इसके अलावा, कई इमेजिंग सत्र से डेटा सेल व्यवहार को सत्यापित करने की तुलना में किया जाना चाहिए। अंत में, मानक immunofluoresence चरण-मिलान के ऊतकों में व्यवस्था, आकार और कोशिकाओं की संख्या में एक ही कर रहे हैं कि क्या यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
अस्थानिक DCR-2 अक्सर आरएनएआई की प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि अस्थानिक DCR-2, आईसी मध्यनिवेश, 3 ° आला और apoptosis के स्थिरीकरण की उपस्थिति में कभी कभी (डेटा) नहीं दिखाया बाधित कर रहे थे। इस प्रकार DCR-2 अभिव्यक्ति सावधानी के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए।
लेबल जंक्शनों adherens और पोटा संबंधी आंख में वर्णक कोशिकाओं के morphogenesis का आकलन करने के लिए यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल GFP का इस्तेमाल करता। इस रणनीति को आसानी से (जैसे फोटोरिसेप्टर morphogenesis का आकलन करने के लिए) अन्य प्रयोजनों के लिए संशोधित किया जा सकता है। एक डबल लेबलिंग दृष्टिकोण के लिए, अतिरिक्त यूएगैर-GFP के टैग के साथ अन्य सेलुलर ब्याज के घटकों (जैसे सचिव पुटिकाओं, endoplasmic जालिका, नाभिक) लेबल कि एस ट्रांसजीन शामिल किया जा सकता है। इन transgenes की तीव्रता और दीर्घायु आकलन की आवश्यकता होगी हालांकि: आरएफपी, DsRed और mCherry, उदाहरण के लिए, वर्णक सेल patterning के कब्जा करने के लिए आवश्यक लंबी अवधि के लिए पोटा संबंधी आंख इमेजिंग के लिए गरीब लेबल साबित किया है (डेटा) नहीं दिखाया। तेजी से सेल व्यवहार (जैसे स्राव) की जांच कर रही है तो यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल आसानी से उपयुक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन की confocal माइक्रोस्कोपी के लिए संशोधित किया जा सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems |
References
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