Protocol
Anmärkning: All utrustning är listade i tabell 1.
1. Förvara kycklingembryon
- Inkubera hönsägg av stammen Gallus gallus horisontellt vid 37 ° C med ca 40% luftfuktighet och slå ägg en gång eller två gånger dagligen. Turning ägg är viktigt att förhindra embryot från att vidhäfta till äggskalet.
- Inte för att vända ägget i 24 h före inrättandet av kulturen som annars embryot kommer att ligga ventrala till äggulan massa och kommer att skadas om du öppnar ägget i steg 3. Dessutom håller äggen vid 4 ° C grader för högst en vecka innan inkubation till "stopp" utveckling men det är inte idealiskt.
2. Staging kycklingembryon
- Stage kycklingembryon använder Hamburger och Hamilton 12 staging bordet. Den idealiska scenen för att inrätta fritt ovo odling är HH stadium 19-20 (cirka 3 dagars inkubation) becAAnvända detta är strax efter huvudet vänder vid 53 HPF.
Obs: HH stadium 19-20 kännetecknas av följande morfologiska egenskaper: somiter utsträcks till majoriteten av svansen, men alldeles i slutet av svansen förblir unsegmented, svansen knoppen är böjt, är allantois små och har begränsade kärl, benet-knopparna är större än ving knoppar och ögonen är opigmenterad eller har en gråaktig nyans.
3. Ta bort Embryo från Shell
- Innan du tar bort embryot från skalet, spraya skal med 70% etanol och låt det torka. Vrid inte ägget snabbt som detta kommer att skada embryot.
- Att vara noga med att inte ändra orienteringen av ägget, försiktigt knäcka ägget på den nedre sidan (dvs den sida som var ventrala under inkubation) och släpp embryot till en steril väger båt (88 x 88 x 23 mm). Torka väger båtar med 70% etanol. Inspektera embryot för att säkerställa att äggulan säcken inte är skadad. Om äggulan hsom bryts, kasta embryot, eftersom det inte kommer att överleva.
- Observera embryot för att säkerställa att den är livskraftig; hjärtat slår, verkar kärl normalt, och inga uppenbara avvikelser förekommer. Se till att kanterna på väga båt är torra.
- Med hjälp av en pipett, släpp 40 pl penicillin / streptomycin (5000 enheter penicillin, 5 mg streptomycin per ml) på toppen av albumin för att förhindra infektioner.
4. Förbereda Luftfuktighet avdelningen
- Placera en liten stapel av Kim-våtservetter och / eller en absorberande dyna tillverkad av bomull i botten av en steril plastbehållare (12 x 12 x 6 cm) torkas med 70% etanol.
- Tillsätt steril, destillerat vatten för att fukta KIM-våtservetter och / eller bomull (cirka 150 ml vatten).
5. Montera Ex Ovo Kultur
- Placera väger båten innehåller embryot ovanpå den fuktiga stoppning. Sedan placera hälften av en kvadrat steril Petri-skål (9,5 x 9,5 cm) ovanpå tHan väger båten för att bilda ett löst lock.
- Täck plastbehållaren med locket. Tryck ned två hörn av locket, vilket garanterar en partiell försegling som fortfarande tillåter god luftflöde inne i kammaren.
- Placera försiktigt setup till 37 ° C inkubator tills önskad scen.
- Placera behållare av vatten i inkubatorn för att hjälpa till att kontrollera luftfuktigheten, om en kontrollerad luftfuktighet inkubator är otillgänglig. Sterilisera allt vatten i fuktkammare och i inkubatorn och fylla behov under inkubationstiden. 40% luftfuktighet är perfekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta ex ovo metod möjliggör observation av embryon från tidiga utvecklingsskeden (HH 19/20) till sen utvecklingsfas (HH 40-41) (Figur 1A och 1B). Ställa in kulturen på HH 19-20 ökar överlevnadsförmåga embryona i kulturen. Före huvudet svarvning (före 53 HPF) överlevnads är mycket låg i kultur och efter etapp 21, tenderar embryot att hålla mer till skalet på avlägsna så färre intakta embryon erhålls. I allmänhet är överlevnads av embryot i ex ovo kultur högt upp till HH 35-36 (90-100%), men det gör droppe i de mer avancerade utvecklingsstadier (ca 40% överlever till HH 40-41). Dessutom, även om det har visat sig att utvecklingen verkar normalt vid dessa sena stadier och mönstring av skelettet är opåverkad 4,15, har vi observerat att benen är böjda vid dessa sena stadier tyder på att graden eller tidpunkten för benbildning kan påverkas. Detta ärinte förvånande med tanke på behovet av kalcium från skalet för benbildning. En detaljerad jämförelse av utvecklingen av embryot jämfört med kontroller pågår och är utanför ramen för detta metoder papper.
Att få tillgång till embryot under utveckling är viktig av två skäl. Först forskarna kan se utvecklingen på daglig basis utan att behöva bryta förseglingen och återförsluta ett fönster. Exempelvis är individer kan iaktta lem och ögonens utveckling vid multipla stadier (figur 1C och 1D). För det andra, ex ovo odling möjliggör större (obegränsad) tillgång till embryot, vilket möjliggör enklare manipulationer eller operationer.
Embryonala manipulationer oftast, måste utföras med användning av ett stereomikroskop. Använda ex ovo odling metod som beskrivs här i motsats till frigolit / plastfolie metod 6,7,8 embryot set-up är lätt placeras undER de mikroskop, är mindre djup och kommer inte välta. Detta gör det möjligt för forskaren att placera fuktkammaren exakt som behövs och för att rotera den för att optimera tillgång till embryot, eftersom det inte finns några hinder (äggskal) skymmer embryot och eftersom kammaren är mycket stabil. Sammantaget bäraren embryot mottar från väga båten tillåter lätt tryck som skall appliceras på embryot under manipulering utan uppsättningen välter.
Flera utvecklingsbiologiska metoder kan utföras på embryona i denna kultur systemet. Dessa inkluderar detaljerade observationer av orgel (t.ex. ögon, hjärna osv) eller vävnadsutveckling (t.ex. blodkärlstillväxt) eller tillämpningen av teratogena ämnen. Manipulationer inkluderar ympning av vävnader på korioallantoismembran att studera effekten av att kombinera olika vävnadsskikt eller studera tumörtillväxt och metastasering 14. En annan populär manipulation utförs under utveckling är bead eller barriär implantation. Bead implantation kan forskaren få suga en hämmare eller faktor på pärlan och sedan implantera pärlan lokalt för att hämma eller inducera gener lokalt i området av intresse. Detta sker ofta med hjälp AffiGel eller heparin pärlor (Figur 2A). Till exempel kan ben morfogenetiska proteiner (BMP) vara lokalt inhiberas under induktionen av neurallisten härledd ben 4, 15, eller i utvecklings extremitetsanlag 13. Efter en pärla implanteras, kan embryot återföras till inkubatorn och det kommer att fortsätta att utvecklas. Detta tillåter forskare att visa nedströms effekterna av hämning av en särskild gen (i detta fall BMP), såsom hämningen av sklerala LITET BEN bildning i sklerotisk ringen (figur 2B och 2C) 15. På liknande sätt kan hinder lätt införas mellan vävnadsskikt i syfte att studera vävnads-till-vävnad signalering och mikroinjektion av färgämnen kan också lätt genomföras. 
Figur 1. Kollar embryot ex ovo. (A) HH stadium 20 kycklingembryo efter avlägsnande från skalet, pilen pekar på embryo med vaskulariserade embryonala membran. (B) En HH stadium 40 embryo i en öppen fuktkammare. (C) HH stadium 35 embryo visar tidiga lem knoppar (pil). (D) Stage HH 41 embryo visar senare utveckling av strukturer som ögat (pilen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Exempel på Noggin indränkt pärla Implantation Experiment 4. (A) Embryo HH stadium 35 exponerad genom ett litet hål slits i de överliggande membran i syfte att få tillgång till den underliggande öga för bead implantering. Hög förstoring av affigel pärla intill en konjunktival papilla visas i infällda. Skala bar i C är 75 pm. (B) Alkaliskt fosfatas färgas höger öga efter Noggin pärla implantation (pil) som visar lucka i ringen av hörselbenen, HH 38 (C) AP färgas vänster öga visar inga störningar till ringen av hörselbenen (kontroll ), HH 38. Detaljer av detta experiment finns i Duench och Franz-Odendaal 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex ovo odling och fönster båda har fördelar och utmaningar. Här jämför vi fördelar och utmaningar som den Styrofoam kopp ex ovo metoden och fönstermetoden till vår optimerade ex ovo metod som visas här. Vår metod möjliggör manipulation och enkel observation av kycklingembryo i sen utvecklingsfas och våra förbättringar av traditionella ex ovo metod 1, 2, 3 gör det dessutom mycket lätt att använda i grundundervisningen laboratorieklasser.
Även om många forskare föredrar fönster metod för att studera kyckling utveckling eftersom det är enkelt att utföra och har utmärkt överlevnads till sen utvecklingsfas (HH 41-42), har den begränsningar. Den största är den begränsade möjligheten att visa hela embryot efter HH stadium 30. Efter scenen HH 30, fönstret i äggskalet måste vara mycket stort för att visa den växande, flytta embryo. Denna stora fönster är difficult att täta helt (vilket leder till problem med sterilitet och överlevnadsförmåga), och få bra belysning inne i ägget kan vara utmanande. Dessutom avancerade scen embryon är stora och svåra att komma åt (eller manipulera) genom fönstret.
Ex ovo metod som beskrivs här ger full ohämmad tillgång till embryot. När väga båt placeras i fuktighetskammaren, är hela uppsättningen mycket stabil. Hela fuktkammare kan placeras under ett dissekera mikroskop och hög förstoring kan användas för att observera hela embryot. I jämförelse har Styrofoam kopp metoden en fuktkammare som är lång (cup höjd) och detta gör det mycket svårt att placera under mikroskop mål. Koppen design är också långt mindre stabila än den platta väger båten och dessa koppar kan lätt vältas. Våra förbättringar av ex ovo metoden gör denna metod enkel att använda i ett klassrum eller labb inställning och gör det möjligt för student att få full tillgång till embryon från scenen HH 19 fram till HH 40; stadier när stora organogenesen sker. Den största nackdelen med vår ex ovo metod är sterilitet. För att förhindra infektion, innehåller vår metod tillsats av antibiotika. En annan dos av antibiotikum kan ges till embryot i senare skeden. De antibiotika administreras under kultur set-up också tycks inte påverka utvecklingen av embryot. Sterilisering behållare med 70% etanol före användning kan dramatiskt öka överlevnadsförmåga.
Totalt sett är det ex ovo metod idealisk för att visa och manipulera embryon utan begränsningar av eller utvecklingsstadium. Tidigare forskning har visat att odling av embryon ex ovo inte negativt påverkar mönstring 4,15. Till exempel ser vi inte några förändringar i mönstring eller induktion av skelettet, trots frånvaron av äggskal. Vår förbättrade metoden löser flera cTMANINGAR som finns med den nuvarande traditionella ex ovo metod 1,2, 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen i fråga om att den information som presenteras i detta manuskript.
Acknowledgments
Vi vill tacka Paul Poirier, medier Producent, på Mount Saint Vincent University för sitt arbete i filmandet och redigera videodelen av detta manuskript. Vi erkänner Natural Science and Engineering Research Council of Canada för finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4458 | Make small aliquots to avoid freeze/thaw events |
| Square Petri Dish | 9.5 cm x 9.5 cm | ||
| Weigh Boat | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Ziplock container | Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
References
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Gennaro, L. D., Packard, D. S., Stach, R. W., Wagner, B. J. Growth and differentiation of chicken embryos in simplified shell-less cultures under ordinary conditions of incubation. Growth. 44, 343-354 (1980).
- Tufan, C. A., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanat. 3, 8-11 (2004).
- Duench, K., Franz-Odendaal, T. A. BMP and Hedgehog signaling during the development of scleral ossicles. Dev. Biol. 365 (1), 251-258 (2012).
- Datar, S., Bhonde, R. R. Shell-less Chick Embryo Culture as an Alternative in vitro Model to Investigate Glucose-Induced Malformation in Mammalian Embryos. Rev Diabet Stud. 2 (4), 221-227 (2005).
- Chick embryos in shell-less culture. Tested studies for laboratory teaching. Fisher, C. J. 5th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE), , (1983).
- Dunn, B. E. Technique for shell-less culture of the 72-hour avian embryo). Poultry Science. 53, 409-412 (1974).
- Yalcin, H., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Silver, P. H. S. Special problems of experimenting in ovo on the early chick embryo, and a solution. J Embryol Exp Morph. 8 (4), 369-375 (1960).
- Spurlin, J., Lwigale, P. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Dev. Dyn. 242 (2), 148-154 (2012).
- Dorrell, M. I., et al. Ex ovo model for directly visualizing chicken embryo development. American Biology Teacher. 74 (9), (2012).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morph. 88, 49-92 (1951).
- Drossopoulou, G., et al. A model for anteroposterior patterning of the vertebrate limb based on sequential long-and short-range Shh signaling and Bmp signaling. Development. , 127-1337 (2000).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Franz-Odendaal, T. Towards understanding the development of scleral ossicles in chicken, Gallus gallus. Dev. Dyn. 237, 3240-3251 (2008).
