Protocol
Nota: Tutte le forniture sono elencati nella tabella 1.
1. Memorizzare il pollo embrioni
- Incubare uova di gallina del ceppo Gallus gallus orizzontalmente a 37 ° C con circa il 40% di umidità e girare le uova una o due volte al giorno. Passando uova è importante per evitare l'embrione di aderire al guscio d'uovo.
- Non per non trasformare l'uovo in 24 ore prima di impostare la cultura, altrimenti l'embrione sarà situato ventrale alla massa tuorlo e verrà danneggiato aprendo l'uovo al punto 3. Inoltre, tenere le uova a 4 o C ° per non più di una settimana prima di incubazione di sviluppo "halt", ma questo non è l'ideale.
2. Staging pollo Embrioni
- Fase gli embrioni di pollo con l'Hamburger e Hamilton 12 tabella di gestione temporanea. Il palcoscenico ideale per l'impostazione della coltura ex ovo è HH fase 19-20 (circa 3 giorni di incubazione) becausa questo è poco dopo la testa gira a 53 HPF.
Nota: HH fase 19-20 è caratterizzata dalle seguenti caratteristiche morfologiche: somiti sono estese nella maggior parte della coda, ma alla fine della coda rimane non segmentato, la gemma coda è arricciata, allantoide è piccolo e ha limitato vascolare, le gambe gemme sono più grandi delle ali gemme e gli occhi sono pigmentato o hanno una tonalità grigiastra.
3. Rimuovere l'embrione da Shell
- Prima di rimuovere l'embrione dal guscio, spruzzare il guscio con il 70% di etanolo e lasciare asciugare. Non girare l'uovo rapidamente per non danneggiare l'embrione.
- Facendo attenzione a non alterare l'orientamento dell'uovo, crepa accuratamente l'uovo sul lato inferiore (cioè, il lato che era ventrale durante l'incubazione) e rilasciare l'embrione in un sterile pesano barca (88 x 88 x 23 mm). Pulire pesare barche con il 70% di etanolo. Controllare l'embrione di garantire che il sacco vitellino non sia danneggiato. Se il tuorlo hcome rotto, scartare l'embrione, in quanto non sopravviverà.
- Osservare l'embrione per assicurarsi che sia praticabile; il cuore batte, vasi appare normale, e evidenti anomalie sono presenti. Assicurarsi che i bordi della barca pesare siano asciutte.
- Utilizzando una pipetta, goccia 40 ml di penicillina / streptomicina (5.000 unità penicillina, 5 mg di streptomicina per ml) sulla parte superiore del dell'albumina per aiutare a prevenire l'infezione.
4. Preparare la Camera Umidità
- Inserire una piccola pila di Kim-salviette e / o un tampone assorbente in cotone sul fondo di un contenitore di plastica sterile (12 x 12 x 6 cm) strofinando con etanolo al 70%.
- Aggiungi sterili, acqua distillata per inumidire i Kim-salviette e / o cotone (circa 150 ml di acqua).
5. Assemblaggio della Ex Ovo Cultura
- Posizionare la barca pesare contenente l'embrione sopra dell'imbottitura umida. Quindi, posto a metà di una sterile petri-piatto quadrato (9.5 x 9.5 cm) sulla parte superiore del tsi pesano barca per formare un coperchio allentato.
- Coprire il contenitore di plastica con il suo coperchio. Premere giù due angoli del coperchio, assicurando una tenuta parziale che consente ancora una buona circolazione dell'aria all'interno della camera.
- Posizionare con cura l'installazione in 37 o C incubatore fino stadio desiderato.
- Posizionare i contenitori di acqua in incubatrice per aiutare a controllare l'umidità, se un incubatore umidità controllata non è disponibile. Sterilizzare tutta l'acqua nelle camere di umidità e nell'incubatrice e riempire come necessario durante il periodo di incubazione. 40% umidità è ideale.
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Representative Results
Questo ex ovo metodo consente l'osservazione di embrioni dalle prime fasi di sviluppo (HH 19/20) in fase avanzata di sviluppo (HH 40-41) (Figura 1A e 1B). Impostazione della cultura a HH 19-20 aumenta sopravvivenza degli embrioni nella cultura. Prima della testa di svolta (prima 53 HPF) di sopravvivenza è molto bassa nella cultura e dopo la tappa 21, l'embrione tende ad attaccare di più per la shell alla rimozione così si ottengono un numero inferiore di embrioni intatti. In generale, sopravvivenza dell'embrione in ex ovo cultura è in alto a HH 35-36 (90-100%), ma lo fa calo nelle fasi più avanzate di sviluppo (circa il 40% sopravvive a HH 40-41). Inoltre, anche se è stato dimostrato che lo sviluppo appare normale anche questi ultimi stadi e patterning dello scheletro è influenzato 4,15, abbiamo osservato che gli arti sono piegate questi ultimi stadi suggerendo che il grado o tempi di ossificazione possono essere colpiti. Questo ènon sorprendente considerando la necessità per il calcio dal guscio per ossificazione. Un confronto dettagliato dello sviluppo dell'embrione rispetto ai controlli è in corso e non rientra nell'ambito della presente metodi carta.
Ottenere accesso all'embrione durante tutto lo sviluppo è importante per due motivi principali. Primo, i ricercatori possono visualizzare sviluppo su base giornaliera senza dover dissigillare e richiudere la finestra. Ad esempio, gli individui sono in grado di osservare arto e lo sviluppo degli occhi in più fasi (Figura 1C e 1D). In secondo luogo, ex ovo coltura consente maggiore (senza restrizioni) l'accesso per l'embrione, permettendo così facili manipolazioni o interventi chirurgici.
Manipolazioni embrionali spesso, devono essere eseguiti usando uno stereomicroscopio. Utilizzando il metodo di coltura ex ovo descritto qui in contrasto con il metodo / involucro di plastica polistirolo 6,7,8 dell'embrione set-up è facilmente collocato under il microscopio, è meno profonda e non rovesciarsi. Ciò consente al ricercatore di posizionare la camera umida proprio come necessario e ruotarla per ottimizzare l'accesso all'embrione, poiché non ci sono barriere (guscio d'uovo) oscurare l'embrione e poiché la camera è molto stabile. Nel complesso, il sostegno l'embrione riceve dalla barca pesatura consente una leggera pressione da applicare all'embrione durante la manipolazione senza il set-up ribaltamento.
Diversi metodi di biologia dello sviluppo possono essere condotte sugli embrioni in questo sistema di coltura. Questi includono osservazioni dettagliate di organi (ad esempio, l'occhio, il cervello, ecc) o lo sviluppo dei tessuti (ad esempio, la crescita dei vasi sanguigni), o l'applicazione di agenti teratogeni. Manipolazioni includono innesto dei tessuti sulle membrane corio-allantoidea per studiare l'effetto della combinazione di diversi strati di tessuto o studiare la crescita del tumore e metastasi 14. Un'altra manipolazione popolare eseguita durante lo sviluppo è bead o barriera impianto. L'impianto Bead consente di inquadrare ammollo un inibitore o fattore sul tallone e poi impiantare il tallone a livello locale per inibire o indurre geni localmente nella zona di interesse. Questo è spesso fatto usando Affigel o eparina perline (Figura 2A). Ad esempio, le proteine morfogenetiche ossee (BMP) possono essere inibiti localmente durante l'induzione della cresta neurale derivata ossea 4, 15, o in via di sviluppo l'arto germogliano 13. Dopo un cordone viene impiantato, l'embrione può essere restituito al incubatore e continuerà a sviluppare. Questo permette ai ricercatori di vedere gli effetti a valle della inibizione di un particolare gene (in questo caso BMP), come l'inibizione della formazione ossicle sclerale nell'anello sclerotica (Figura 2B e 2C) 15. Analogamente, barriere possono facilmente essere inseriti tra gli strati di tessuto al fine di studiare segnalazione-tessuto tessuto e la microiniezione di coloranti può facilmente essere condotta. 
Figura 1. Visualizzazione dell'embrione ex ovo. (A) fase HH 20 pulcino embrione dopo la rimozione dal guscio, freccia indica l'embrione con membrane embrionali vascolarizzate. (B) A HH fase 40 embrione in una camera di umidità aperta. (C) HH fase embrionale 35 mostrando gemme degli arti precoci (freccia). (D) Fase HH 41 embrioni che mostra lo sviluppo fase successiva di strutture come l'occhio (freccia). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Esempio di Noggin imbevuto tallone impianto speriment 4. (A) Embrione HH fase 35 esposto attraverso un piccolo foro lacerato nelle membrane sovrastanti per accedere ad occhio sottostante per tallone impianto. Alto ingrandimento del tallone Affigel adiacente ad una papilla congiuntivale è mostrato in inserto. Bar Scala in C è di 75 micron. (B) fosfatasi alcalina macchiato occhio destro dopo Noggin tallone impianto (freccia) che mostra gap nell'anello di ossicini, HH 38 (C) AP occhio sinistro macchiato mostrare alcuna interruzione all'anello di ossicini (controllo ), HH 38. Dettagli di questo esperimento sono forniti in Duench e Franz-Odendaal 4. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ex ovo coltura e di finestre entrambi hanno vantaggi e le sfide. Qui mettiamo a confronto i vantaggi e le sfide del bicchiere di polistirolo ex ovo metodo e il metodo a finestre al nostro ex ottimizzato ovo metodo illustrato qui. Il nostro metodo permette la manipolazione e semplice osservazione del embrione di pollo in fase avanzata di sviluppo e dei nostri filtri alla ex ovo tradizionale metodo 1, 2, 3 rendono inoltre molto facile da usare in classi di laurea laboratorio didattico.
Anche se molti ricercatori preferiscono il metodo a finestre per studiare lo sviluppo di pollo perché è semplice da eseguire e ha un'eccellente capacità di sopravvivenza in fase avanzata di sviluppo (HH 41-42), presenta delle limitazioni. La più grande delle quali è la limitata possibilità di visualizzare l'intero embrione dopo HH fase 30. Dopo stadio HH 30, la finestra nel guscio d'uovo deve essere molto grande per visualizzare il crescente, movimento embrione. Questa grande finestra è difficile per sigillare completamente (che porta a problemi di sterilità e di sopravvivenza), e di ottenere una buona illuminazione all'interno dell'uovo può essere impegnativo. Inoltre, gli embrioni avanzati della fase sono grandi e di difficile accesso (o manipolare) attraverso la finestra.
L'ex ovo metodo qui descritto fornisce pieno accesso disinibito all'embrione. Una volta che la barca pesare viene posto nella camera di umidità, l'intero set-up è molto stabile. L'intera camera umida può essere posto sotto un microscopio da dissezione e alto ingrandimento può essere usato per osservare l'intero embrione. In confronto, il metodo di bicchiere di polistirolo ha una camera umida che è alta (altezza tazza) e questo rende molto difficile mettere sotto gli obiettivi del microscopio. Il disegno della tazza è anche molto meno stabile del piano pesare barca e queste tazze può essere facilmente rovesciato. I nostri miglioramenti alla ex ovo metodo di rendere questo metodo semplice da usare in classe o in laboratorio e consente la student di avere pieno accesso a embrioni da stadio HH 19 fino alla HH 40; mette in scena quando maggiore organogenesi è in corso. Il più grande svantaggio del nostro ex ovo metodo è la sterilità. Per prevenire l'infezione, il nostro metodo comprende l'aggiunta di antibiotici. Un'altra dose di antibiotico può essere somministrato per l'embrione in fasi successive. Gli antibiotici somministrati durante la coltura set-up, inoltre, non sembra influenzare lo sviluppo dell'embrione. Sterilizzazione contenitori con il 70% di etanolo prima dell'uso può aumentare notevolmente la capacità di sopravvivenza.
Nel complesso, l'ex ovo metodo è ideale per la visualizzazione e la manipolazione di embrioni, senza limitazioni di accesso o stadio di sviluppo. Precedenti ricerche hanno dimostrato che la coltura degli embrioni ex ovo non influisce negativamente patterning 4,15. Per esempio, non vediamo le variazioni di patterning oa induzione dello scheletro nonostante l'assenza del guscio. Il nostro metodo migliore risolve multipla cFIDE che esistono con l'ex tradizionale corrente ovo metodo 1,2, 3.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti per quanto riguarda le informazioni presentate in questo manoscritto.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Paul Poirier, il produttore di media, a Mount Saint Vincent Università per il suo lavoro in ripresa e modifica la parte video di questo manoscritto. Riconosciamo Scienze Naturali e di Ingegneria Research Council del Canada per il finanziamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4458 | Make small aliquots to avoid freeze/thaw events |
| Square Petri Dish | 9.5 cm x 9.5 cm | ||
| Weigh Boat | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Ziplock container | Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
References
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