Abstract
Fluorescens baserede primerforlængelse (FPE) er en molekylær metode til at bestemme transkriptionelle udgangspunkter eller forarbejdning lokaliteter af RNA-molekyler. Dette opnås ved revers transkription af RNA af interesse under anvendelse af specifikke fluorescensmærkede primere og efterfølgende analyse af de resulterende cDNA-fragmenter ved denaturerende polyacrylamidgelelektroforese. Samtidig er en traditionel Sanger sekventering reaktion kørt på gelen for at kortlægge enderne af cDNA-fragmenterne til deres nøjagtige tilsvarende baser. I modsætning til 5'-RACE (Rapid Amplifikation af cDNA Ends), hvor produktet skal klones og flere kandidater sekventeret, kan hovedparten af cDNA-fragmenter genereret ved primerforlængelse samtidigt detekteres i en gel løb. Derudover kan hele proceduren (fra revers transkription til endelig analyse af resultaterne) udfyldes på én arbejdsdag. Ved hjælp af fluorescens-mærkede primere, brug af farlige radioaktive isotop mærkede reagenserkan undgås, og sagsbehandlingstider er nedbragt så produkterne kan blive fundet under elektroforese procedure.
I den følgende protokol beskriver vi en in vivo fluorescerende primerforlængelse metode til pålideligt og hurtigt påvise 5 'enderne af RNA'er til at udlede transkriptionel udgangspunkter og RNA-forarbejdning sites (fx ved toksin-antitoksin systemkomponenter) i S. aureus, E. coli og andre bakterier.
Introduction
Primerforlængelse 1 er en molekylær metode til bestemmelse af 5 'enderne af specifikke RNA-molekyler op til én base opløsning. Fordelen ved at andre metoder såsom 5'-RACE (rapid amplifikation af cDNA-ender) er den hurtige behandlingstid og evnen til let at analysere en blanding af forskellige længder af RNA-molekyler.
Denne metode fungerer ved at underkaste RNA-molekyler til at vende transkriptionsreaktioner anvendelse af specifikke fluorescerende primere generere cDNA-fragmenter af visse længder. Disse cDNA-molekyler er sideløbende traditionelle Sanger sekventeringsreaktioner 2 på denaturerende polyacrylamidgeler og kan påvises ved deres fluorescens som følge af anvendelsen af fluorescens-mærkede primere. Længderne af de cDNA-fragmenter vurderes derefter ved sammenligning med den sekventeringsstige, tillader kortlægning af 5'-RNA-ender.
Traditionelt er primerforlængelsesreaktioner anvendes i forbindelsemed radioaktive isotoper til påvisning af cDNA-molekyler på X-ray film. Grundet sundhedsfarer, bortskaffelse af affald spørgsmål og lette håndtering, nyere protokoller udnytte fluorescens til påvisning af primerforlængelsen med automatiserede sequencere, omend deres følsomhed er lidt lavere. Brug af fluorescens-mærkede primere, kan den tilbagevendende procedure radio-mærkning undlades, som fluorescerende primere er stabile i lang tid (mere end et år i vores hænder).
Fremgangsmåden beskrevet her anvender en automatiseret gel sequencer, men med små modifikationer kan kapillære sequencers også anvendes til cDNA-separation og detektion 3. Den parallelle karakter gel analyse gør det muligt at detektere selv en lille mængde RNA spaltning eller forarbejdning. En anden fordel er den høje opløsning af denne fremgangsmåde, som terminal spaltning eller forarbejdning af endnu en base kan detekteres.
Med hensyn til påvisning af RNA-spaltningen eller forarbejdning, typically to forskellige typer af primerforlængelser skelnes. I et tilfælde er den enzymatiske behandling udføres in vitro ved anvendelse af oprenset RNA og oprenset enzym, mens i det andet tilfælde er behandlingen udføres in vivo, og den resulterende RNA renses. I begge tilfælde RNA underkastes et primerforlængelsesprodukt udføres in vitro, dog afhængigt af kilden til RNA, er fremgangsmåden enten kaldes en in vitro eller in vivo primerforlængelse. I protokollen præsenterer vi her fokuserer vi udelukkende på in vivo primerforlængelse grund af brugervenlighed (ingen oprensede proteiner nødvendigt) og muligheden for at bestemme transkriptionelle udgangspunkter og forarbejdning på samme tid. Men i vitro primerforlængelser i princippet oprettet på samme måde og denne protokol kan tjene som udgangspunkt.
Fremgangsmåden er illustreret her, kan anvendes til mange bakteriearter, så længe de er medgørlige til højforberedelse renhed og højt udbytte af nukleinsyrer.
Forskningen i vores laboratorium fokuserer på den regulerende rækkevidde af toksin-antitoksin (TA) systemer 4,5, et område, hvor primerekstensionsproduktet metode benyttes flittigt. TA-systemer er små genetiske elementer til stede i prokaryote genomer, der består af en stabil og endogent aktivt toksisk protein og en hovedsagelig ustabilt protein eller RNA antitoksin, der modvirker toksicitet 6,7. Toksin-aktivitet er undertiden udøves ved hæmning af replikation, cellevægsyntese eller andre mekanismer, men oftest af RNase-aktivitet 8,9. Typisk er RNase specificitet bestemmes ved at udføre forskellige test, hvoraf den ene er primerekstensionsproduktet metode. Primerforlængelsesreaktioner er velegnede til denne anvendelse, som en blanding af spaltede og fuld længde fragmenter samtidig kan analyseres for at bestemme deres 5'-ender. Ved hjælp af en blanding af in vitro og in vivo primerforlængelser, denspecifikke toksin RNase-spaltning, f.eks sekvens specificitet kan bestemmes 10-13.
Figur 1. Oversigt over primerforlængelse procedure. Bakteriekulturer inkuberes og behandles i henhold til de eksperimentelle behov. Totalt RNA ekstraheres fra cellerne, der er behandlet med DNase I for at fjerne DNA-spor og underkastet en revers transkription under anvendelse af målspecifikke fluorescerende DNA-primere, der giver cDNA. Genomisk DNA eller plasmider ekstraheres og derefter anvendes til fluorescerende Sanger sekventeringsreaktioner for størrelse sammenligning med cDNA-fragmenter. Primerforlængelsesprodukter køres sideløbende Sanger sekventering produkter på en denaturerende polyacrylamidgel urinstof og analyseret med et automatiseret laser og mikroskop. Den sekventering base, der flugter med cDNA bandet er last base af 5'-cDNA-ende (blå pil). Mere information i Fekete, et al. 3 Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Et overblik over hele primerforlængelse procedure kan findes i figur 1. Kort fortalt bakterieceller dyrkes, høstes, cellepelleten lyseret, og RNA ekstraheret. Oprenset RNA behandles dernæst med DNase I for at fjerne spor af DNA-molekyler, som kunne fungere som skabeloner for revers transkriptase. Specifikke fluorescerende primere tilsættes til RNA hybridiseret til regionen af interesse og efterfølgende revers transkriberet, resulterer i enkeltstrenget komplementært DNA (cDNA). En sekventeringsstige er skabt af traditionelle Sanger-sekventering anvender fluorescerende primere og separeret på en denaturerende polyacrylamidgel ved siden af primerekstensionsproduktet cDNA-fragmenter. Den resulterendegel analyseres ved at sammenligne de fluorescerende bånd, som muliggør identifikation af 5 'enderne af interesse. Transkriptionelle udgangspunkter og forarbejdning sites derefter vurderes individuelt i sekvens sammenligninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. High Yield RNA Forberedelse
- RNA Isolation
BEMÆRK: Høje koncentrationer af total RNA er nødvendige for primerforlængelsesreaktionen. Spin kolonne kits normalt ikke opnåelse af mængden af RNA behov (~ 5-16 ug i 5 pi volumen). Derfor oprensning ved hjælp af syreguanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform ekstraktion metode anbefales, skitseret nedenfor.
BEMÆRK: Phenol er kræftfremkaldende, giftigt og ætsende. Læs venligst de sikkerhedsdatablade og bruge under en emhætte med passende beskyttelse!- Vokse eller behandling af bakterielle celler (S. aureus eller E. coli i dette eksempel) som ønsket og høst af 10 min centrifugering ved 4.600 x g og 4 ° C. Bemærk: Typisk vi høste alt OD600 på 20 - 70. Cellepellets kan opbevares i flere uger ved -20 ° C.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml syreguanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform-opløsning og overføres til en2 ml skrue kop indeholdende 0,5 ml 0,1 mm glas zirconium / silicaperler.
- Lyse cellerne tre gange i hurtig prep / bead beater på 6,5 m / sek i 30 sek for tre runder afkøling af prøverne på is i 5 minutter efter hver kørsel. Bemærk: homogeniseret prøve kan opbevares ved -80 ° C i flere uger.
- Inkuber lysat i 5 minutter ved stuetemperatur og derefter tilsættes 200 pi chloroform.
- Ryst eller vortex prøven i 30 sekunder til at udtrække RNA.
- Inkuber ved stuetemperatur i 3 minutter og derefter centrifugeres i 15 minutter ved 13.000 - 15.000 x g og 4 ° C. Bemærk: Opløsningsmidler er opdelt i en nedre organisk fase (pink, indeholder proteiner), en interfase (hvid, indeholder DNA) og en øvre vandig fase (klar, indeholder RNA).
BEMÆRK: Fra dette skridt på brug RNase gratis reagenser og plast ware! - Forbered frisk RNase-fri 1,5 ml reagensglas, etiket hensigtsmæssigt og tilføje omkring 500 ul 100% RNase fri isopropanol hver (brug omtrent samme volume som den vandige fase i det foregående rør).
- Hold røret i en vinkel og overføre den vandige fase (ca. 500 pi) til de fremstillet rør ved hjælp af RNase gratis tips. Forstyr ikke interfasen.
- Udfældning af RNA ved at vende flere gange og inkubering i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Centrifugeres prøverne i 15 minutter ved 13.000 - 15.000 x g og 4 ° C og fjern supernatanten ved pipettering eller aspiration (vandstrålepumpe og sutteflaske). Forstyr ikke den hvide gennemsigtig RNA pellet i bunden.
- Tilsæt 1 ml 70-80% RNase fri ethanol (ikke vortex) at vaske. Bemærk: RNA i ethanol kan opbevares i flere uger ved -20 ° C.
- Centrifuger i 5 minutter ved 7.500 x g og 4 ° C og kasseres supernatanten ved pipettering eller fortrinsvis aspiration.
- Air tør RNA pellet for 15-30 minutter under emhætte. Ikke overdry, ellers pellets være vanskeligt at genopløse.
- Pellet resuspenderes i 50 pi RNase-frit Hedeselskabet 2 O eller RNA opbevaringspuffer.
- Mål RNA-koncentrationen med en microvolume UV-Vis spektrofotometer eller en kvartscuvette (og konventionel fotometer) og fortsæt til DNase I fordøjelse.
- DNase I-fordøjelse af RNA for at fjerne spor af DNA
BEMÆRK: Da DNA kan virke som en falsk skabelon i den omvendte transkription (primerforlængelse) reaktion, skal det fjernes fra prøven. Forskellige metoder til fjernelse af DNA fra RNA-opløsninger er tilgængelige, som normalt benytte DNase fordøjelse. En enkel, men effektiv og omkostningseffektiv metode til DNA-fjernelse er skitseret nedenfor.- Forvarm vandbad til 37 ° C.
- Bland forbindelserne anført i tabel 1 i et 1,5 ml reaktionsrør.
- Inkuber blandingen i 1 time ved 37 ° C i et vandbad, og derefter fortsætte direkte til phenol / chloroform ekstraktion. Bemærk: Varme inaktivering af DNase I kan ikke anbefales, da dette kan forringe RNA.
- Phenol / chloroform ekstraktion af RNA efter DNase I Digestion
BEMÆRK: RNA skal renses for at fjerne frie nukleotider, DNA-fragmenter og pufferkomponenter fra DNase I fordøjelse. Phenol / chloroform-ekstraktion muliggør høj genvinding og koncentrationen af RNA-prøven og er derfor beskrevet nedenfor. Andre fremgangsmåder til RNA oprensning kan også anvendes, hvis de opfylder disse krav.- Split 500 pi DNase I fordøjelse blandes i to 250 pi prøver i 2 ml reaktionsrør.
- Tilsæt 1 volumen (250 ul) af sure P / C / I-opløsning (i vandmættet phenol, chloroform og isopentanol, forholdet 25: 24: 1, pH 4,5-5).
BEMÆRK: P / C / I løsningen er kræftfremkaldende, giftigt og ætsende. Læs venligst de sikkerhedsdatablade og bruge under en emhætte med passende beskyttelse! - Energisk vortex eller sted i en vortexbehandling platform til 1 - 3 min.
- Centrifuger i 30 minutter ved 13.000 - 15.000 x g og 4 ° C.
- Saml den øverste (vandige) fase og overføres til friske rør (250 pi).
- Tilføj 1/9 volumen (28 pi) af 3 M natriumacetat pH 5,2.
- Tilføj 2,5-3 liter ren ethanol (700 pi).
- Vortexes kort og sted ved -80 ° C i 30 minutter eller ved -20 ° C til 2 - 3 timer. Om nødvendigt opbevares RNA O / N ved -20 ° C.
- Centrifuge for 30-60 minutter ved 13.000 - 15.000 x g og 4 ° C.
- Fjern supernatant ved pipettering eller aspiration.
- Vask pellet ved tilsætning af 1 ml 70% ethanol på pelleten. Undlad at slynge prøve.
- Centrifuge prøve i 5 minutter ved 13.000 - 15.000 x g og 4 ° C.
- Fjern supernatant ved pipettering eller aspiration.
- Air tør pille under emhætte. Opbevar pellet ved -20 ° CO / N, hvis nødvendigt.
- Pellet opløses i 30 pi DEPC behandlet H2O ved hvirvelbehandling i 2 min og anvende denne opløsning til at opløse pellet af det tilsvarende andet rør per prøve (30 ul opløsning pr en ekstraktion par).
- Mål RNA-koncentrationen, og sikre, at det overstiger 1 pg / pl til brug i primer forlængelse af averagely udtrykte mRNA'er.
- Om nødvendigt opbevares RNA ved -20 ° C i flere uger og op til nogle måneder.
2. primerforlængelsesreaktion
- Primer design
BEMÆRK: Når du designer primere til en primerforlængelsesforsøg, adlyde generelle retningslinjer for PCR-primer design (se manualen ledsager automatiserede gel sequencer for mere information og diskussion afsnittet i dette dokument).- Specifikt, at de primere (i) ikke indeholder kørsler af baser, (ii) har en G eller C ved 3 'enden, (iii) har en afbalanceret GC: AT ratio, (iv) har en annealing temperatur på ca. 55-60 ° C, og (v) binder mindst 50 bp, bedre 100 bp nedstrøms for regionen af interesse til at modtage klare billeder.
- Primerforlængelsesreaktion
BEMÆRK: primerforlængelsesreaktion (cDNA syntese) kræver høje mængder af skabelon-RNA. Hvis der vælges til lav mængderne af RNA, der anvendes, kan signalet være for lavt til at detektere! Vi anbefaler derfor oprensning af RNA som beskrevet ovenfor.
BEMÆRK: FORSIGTIG: Brug RNase gratis reagenser og plast ware !!!- Forvarm thermocycler til en temperatur på 95 ° C og udføre alle yderligere inkubation trin i en thermocycler til brugervenlighed og reproducerbarhed.
- Blande forbindelserne fra tabel 2 i et PCR-rør for hver RNA-prøve.
- Denaturere prøver til 1 min ved 95 ° C.
- Placer rørene på is og chill i 5 min for at hybridisere RNA'er og primere.
- Indstil PCR-maskine til 47 ° C.
- I mellemtiden forberede revers transkription mastermix som beskrevet i tabel 3.
- Tilføj 4 pi revers transkription mester mix til hver hybridiseret RNAprøve.
- Inkuber rørene i 1 time ved 47 ° C. Bemærk: Den optimale temperatur for AMV RT er 42 ° C, men højere temperaturer bidrage til at overvinde sekundære strukturer af RNA-molekylerne.
- Reaktionen standses ved at opvarme prøverne til 95 ° C i 2 min.
BEMÆRK: Formamide er ætsende, giftige og kan være skadeligt for det ufødte barn. Læs venligst de sikkerhedsdatablade, håndtag med omhu og bære passende beskyttelse! - Tilsæt 6 pi formamidpåsætningsfarvestof (95% (v / v) deioniseret formamid, 10 mM EDTA, 0,05% (vægt / volumen) bromphenolblåt), og lageret for O / N til to uger ved -20 ° C i mørke.
3. Udarbejdelse af sekventeringsstige
BEMÆRK: sekventeringsstige reaktion kræver enten moderate mængder af plasmider eller store mængder af genomisk DNA. Når det er muligt, er anvendelsen af plasmider i sekvensen reaktionen anbefales på grund af den lette isolation og høj SIGnal intensitet. I andre tilfælde, vi rutinemæssigt bruger en metode, der blev vedtaget fra Marmur 5,14 for at forberede genomisk DNA fra E. coli og S. aureus-celler uden behovet for at anvende phenol. I princippet kan anvendes enhver metode, som giver store mængder og renhed af genomisk DNA.
- Genomisk DNA Isolation
- Vokse 10 ml E. coli eller S. aureus-celler O / N i LB, BM 5 eller TSB medium.
- Høst cellerne ved centrifugering i 10 minutter ved 4.600 x g i et 15 ml Falcon-rør.
- Resuspenderet pellet i 2 ml buffer P1, som findes i nogle mini forberedelsesmateriale (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 pg / ml RNase A).
- Lyserer celler til 45-60 min med 20-40 pi lysostaphin (0,5 mg / ml, opbevaring ved -20 ° C). Bemærk: Til E. coli-celler den enzymatiske forbehandling kan enten udeladt eller lysozym anvendes.
- Tilsættes 100 pi af mættede SDS-opløsning (i 45% ethanol) til suspensionen, og incubate i 5 minutter ved 37 ° C.
- Tilføj 650 pi 5 M NaClO 4 og kortvarigt vortex celler.
BEMÆRK: Chloroform er et potentielt carcinogen. Læs venligst de sikkerhedsdatablade og bruge under en emhætte med passende beskyttelse !!! - Tilsæt 3 ml chloroform / isopentanol (24: 1 ratio) til blandingen og ryst i mindst 60 sek. Bemærk: Væsken skal blive til en homogen hvid emulsion.
- Centrifuge prøve i 10 minutter ved 4.600 x g og RT for at adskille faserne.
- Overføre omhyggeligt klar øvre (vandige) fase til et nyt rør. Hvis opløsningen er uklar, gentages chloroform / isopentanol ekstraktion. Måle mængden af DNA-opløsningen og forberede et frisk rør med 2 volumener ethanol (100%).
- Langsomt dekanteres eller pipette DNA-opløsningen i ethanol indeholdende rør. Bemærk: DNA skal udfældes som transparente, tætte spoler på bunden, eller når helt dehydreret som en flydende hvid klynge.
- Hent DNA hjælp af kroge fremstillet af glas Pasteur-pipetter (figur 2), og hver prøve vaskes to gange ved neddypning i et enkelt rør af 1 ml 70% ethanol.
- Placer krogene lodret i et stativ og lufttørre pellet i 60 min. Om nødvendigt opbevares tørret DNA i flere dage ved stuetemperatur.
- Opløs DNA ved at afbryde DNA overdækket glas kroge og anbringelse i en 2,0 ml reaktion rør indeholdende 100-500 pi Hedeselskabet 2 O. Justere lydstyrken til en endelig DNA koncentration på 1.000 - 1.500 ng / pl. For en sekventeringsreaktion bruge 10-18 ug af genomisk DNA.
Figur 2. Instruktion om, hvordan du opretter en DNA fiskestang. Hold spidsen af et glas Pasteur pipette ind i flammen fra en bunsenbrænder. Dette bevirker, glas til at begynde at smelte efter nogle sekunder, hvilket skaber en lille krog than ender. Fjern hurtigt fra flammen og lad afkøle i 1 min.
- Plasmid Isolation
- Fremstilling af plasmider ved anvendelse af standard mini forberedelsesmateriale og opløses i elueringsbuffer (10 mM Tris-CI, pH 8,5). Afhængigt af plasmid størrelse, anvende 100-500 ng af plasmid til en sekventeringsstige.
- Sanger sekventering reaktion
BEMÆRK: finde en enkel protokol, der anvender en fluorescensmærket primer sekventering kit med 7-deaza-dGTP, der fungerer godt med henblik på primerforlængelser. Der henvises til sekventering kit manual for detaljerede oplysninger. Bemærk venligst, at sekventeringsreaktionen skal bruge samme primer som primerforlængelsesreaktionen at skabe produkter af samme længde.- Bland 12 pi af genomisk DNA (~ 10 - 15 ug) med 1 pi DMSO og 1 pi fluorescensmærket primer (2 pmol / pl).
- Til hver 1 pi de fire sekventering reaktionsblandinger (A, C, G eller T), der tilsættes 3 pi af DNA / DMSO / Primer mix. Placere prøverne i en PCR-maskine, og kør følgende PCR program: 95 ° C i 2 min; 35 cykler af 95 ° C i 20 sek, 54 ° C i 20 sekunder, 70 ° C i 30 sek; holde ved 4 ° C for evigt.
- Efter kørslen, fjerne prøverne fra maskinen, tilsæt 6 pi påføringsfarvestof og butik på is (kort sigt) eller ved -20 ° C i flere dage til uger.
4. Gel Setup og Apparatur Run
BEMÆRK: Detaljeret information om hvordan sekventeringsgel apparatet er samlet, er gelen fremstillet, og hvordan gelen køres kan findes i fabrikantens protokol.
- Forberedelser
- Forbered 10x TBE som angivet i tabel 4.
- På dagen for gelen løb forberede 1 L 1x TBE buffer med ultrarent Hedeselskabet 2 O.
- Forbered 10% (w / v) APS. Bemærk: Kan opbevares i 200 pi prøver ved -20 ° C i flere måneder, men aktiviteten kan falde med tiden <./ Li>
- Montering af gelstøbning kammer
- Undgå støv og fnug mellem glaspladerne. Derfor grundigt rent arbejdstøj overflader ved hjælp af vådservietter.
- Rengør et par 25 cm glasplader ved hjælp af engangs papirservietter og destilleret vand på begge sider og derefter isopropanol til den indvendige side af glaspladerne.
- Placer 0,25 mm afstandsstykker på den bageste glasplade og sænke indhak glasplade på top (figur 3).
- Fastgør gel skinner på begge sider af glasplader med udskårne ende og posten jernbane piloter opad, og stram skruerne let.
Figur 3. eksploderet afbildning af gel elektroforese glasplader. Glasplader bør anvendes retningsbestemt. Passe til ansigt indersiden af glaspladerne indad og den ydreside udad.
Figur 4. Visning af en samlet apparat gel. Efter injektion af gelen løsning er lommen spacer anbringes i opløsningen mellem glaspladerne. Støbningen pladen glides derefter mellem den forreste glasplade, og gelen skinnerne og fastgøres ved at fastgøre jernbane drejeknapper.
- Støbning af gelen
BEMÆRK: non polymeriseret acrylamid er neurotoksisk! Læs venligst de sikkerhedsdatablade og brug med passende beskyttelse !!!- Tilføj forbindelserne anført i tabel 5 i et bægerglas og blandes ved hjælp af en omrører og en magnetisk omrører.
- Umiddelbart efter tilsætning af APS og TEMED, tage op gelen opløsning i en 50 ml sprøjte og placere et 0,45 nm filter på spidsen.
- Enten holder den øverste kant af glaspladen med den ene hånd eller placere sandwich i en gel støbning stå for at skabe en skråning vinklet 10 - 20 °.
- Langsomt dispensere gelen løsning mellem glaspladerne mens kontinuerligt bevægende sprøjtens spids fra den ene side til den anden og stoppe, når gelopløsningen opfylder den nederste ende.
- Flyt til siden eller fjerne fuldstændigt eventuelle dannede bobler ved hjælp af en boble krog.
- Skub gel lomme spacer (0,25 mm) mellem glasplader i udskårne ende, dykke ind i gelen løsning og løse ved at fastgøre støbning plade.
- Fastgør øvre jernbane skruer let (se figur 4 for færdigsamlet apparater).
- Lad gel sæt til 1 - 2 timer.
- Fjern støbepladen og lomme spacer og rengør lommen fra salt og gelrester.
- Skyl med Hedeselskabet 2 O og tør overskydende opløsning med væv papirer.
- Løb og visualisere gelen
BEMÆRK: sekventeringsgeler direkte underkastet elektroforese i gelen imager, mensfluorescensen samtidigt detekteres af en laser mikroskop. I modsætning til konventionel gelelektroforese, hvor gelen køres først og derefter farves og visualiseret er detekteringsenheden fast og scanner båndene i realtid, når de passerer laseren. Herunder en procedure for ImagIR Dataindsamling software på OS / 2 er skitseret, som kan vedtages til nyere versioner. For mere information se brugervejledningen.- Skub holderen buffertanken i gelen skinner på de forreste glasplader og stram knapperne.
- Anbring gel i den nederste gelebeholder af det automatiserede gel imager mod varmepladen og fastgør ved at skubbe skinnen indgang pilot i apparatet parentes.
- Fyld 1x TBE buffer ind i de nedre og øvre gelpuffer kamre, luk det nederste pufferkammeret og tilslut øvre bufferkammer til magten ved brug af netledningen.
- Hvis det findes, rense gel lomme fra salt-rester ved gentagen pipettering buffer ind i lommen.
- Luk det øverste buffertank kammer ved hjælp af top buffer låg.
- Luk lugen og tænd billeddanneren og computeren, og start Base ImagIR Dataindsamling software.
- Opret et nyt projekt fil (Fil-> Ny ...), indtast et projekt filnavn, vælge de relevante laser intervaller (700 eller 800 nm), og bekræft med OK.
- Vælg Indstillinger-> Auto gain ... fra billedet menuen øverst, skal du klikke på Auto for at starte automatisk gain måling og acceptere indstillingerne ved at klikke på OK.
- Fokus laseren ved at vælge Indstillinger-> Fokus ... fra menuen scanneren kontrol, klikke på Auto-knappen og acceptere indstillingerne ved at klikke på OK.
- Gentag den automatiske gain procedure at tilpasse sig den nyligt fokuseret region.
- Opsætning scanneren kontrol i henhold til disse indstillinger: 2.000 V, 35 mA, 45 W, 45 ° C, Scan filter: 3, Scan hastighed: 3.
- Prerun den tomme gel til 20 min (vælg spænding ON og tryk på <Enter>
). - I mellemtiden opvarmes sekventeringsstige og primerforlængelsesprodukterne i en PCR-maskine for 2 min til 90 ° C, derefter afkøles på is.
- Stop elektroforese åbne automatiserede gel sequencer og fjerne den øverste buffertank låg.
- Sæt haj tand-kam mellem glaspladerne og lidt gennembore gelen med haj tænder (se figur 5).
Figur 5. Nærbillede af gel med haj tand kam. Sample (lilla) anvendes i mellem hajtænder.
- Pipette enten 1 - 2 pi af primerforlængelsesprodukterne eller sekventeringsstige reaktioner i hver gel lomme (dannet af haj tænder).
- Hvis der er behov ikke alle lommer, fylde tomme lommer med påføringsfarvestof at forhindre ikonsekvent løbsforhold.
- Luk buffertanken og dør af gelen sequencer.
- Start elektroforese og tænd laser (Select Spænding ON og Laser ON og tryk
<ENTER>). - Stop elektroforese engang region af interesse har passeret laser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som vist i figur 6, kan en primerforlængelsesreaktion anvendes til at bestemme de transkriptionelle udgangspunkter transkripter af interesse og kan bidrage til at udlede promotorregioner (typisk identificeres ved -10 og -35 elementer). Den øverste (længste) cDNA fragment repræsenterer 5'-enden af mRNA'et og således let kan kortlægges i forhold til sekventeringsstige.
Figur 6. Repræsentative resultat af en primerforlængelsesreaktion. På venstre side en fuldstændig in vivo primerforlængelse gel fra E. coli med forskellige plasmider er vist. Enkelte områder af interesse er forstørret. I den øverste del (A), er bestemmelsen af ompA transkriptionelle startpunkt afbildet. Revers transkription stopper ved 5'-enden af mRNA'et og således skaber et bånd af fuld længde RNA (INDicated med en pil). Ved at justere cDNA-båndet med sekventeringsstige, kan 5'-enden af mRNA bestemmes som vist i den ledsagende sekvens. I den nederste del (B), er spaltningen af ompA udskrift af YoeB-SEQ2 RNase vist. Banerne 1 - 3 repræsenterer prøver, hvor toksinet YoeB-SEQ2 mangler eller inaktive, mens banerne 4-5 repræsenterer prøver med en aktiv RNase, hvilket faldt sammen med fravær og nærvær af cDNA produkter. To vigtigste spaltningsprodukter oprettes som angivet med pilene. Den ddNTP anvendt i hver bane og tilsvarende RNA bunden af sekventeringsstige er mærket. Transcript dele er angivet med blå skrift, promotorelementer og august startkodon af magenta font. For mere information; se den oprindelige forskningsartikel fra Nolle et al., Microbiology 159, 1575-1585 (2013). Klik her for atse en større version af denne figur.
I den i figur 6 viste eksempel blev TSP af ompA mRNA bestemt til at være en G base (markeret med en pil i sekvensen under gel). Dette er i overensstemmelse med ompA TSP offentliggjort før den 15.. -35 Og -10 elementer i promotoren kan udledes at være TTGTAA og TAGACT 16 som motiverne kun adskiller to baser hver fra deres respektive konsensussekvenser (TTGACA og TATAAT henholdsvis).
I modsætning til andre metoder såsom 5'-RACE kan primerforlængelsesreaktioner anvendes til nøjagtigt at bestemme og kvantificere spaltning af RNA-molekyler. Spaltning af RNA-molekyler skaber frie 5 'ender, som samtidig kan detekteres som cDNA bånd i gelen. Identificere flere spaltningsprodukter af en mRNA er mere vanskeligt i 5 'RACE eksperimenter, idet flere PCR-produkter skal sekventeret for at opnå spaltningsprodukterat kun en lille del af den samlede (uforarbejdet) RNA bulk.
I den nederste del af figur 6, er RNA kortlægning af spaltning med en RNase afbildet. Som tidligere beskrevet 5, RNase YoeB-SEQ2 del af et TA-system fra S. equorum 17 spalter mRNA'er tæt på startkodon. Denne spaltning kan inhiberes af det beslægtede anti-toksin YefM-SEQ2. Når RNase YoeB ikke er til stede eller inaktiv (bane 1 - 3), er der ingen primerforlængelsesprodukter dannet tæt startkodonen. Når RNase-aktivitet er til stede (bane 4 & 5), to stærke bånd kort nedstrøms for startkodonen vises. Med denne fremgangsmåde kan spaltningsmønstre kan let identificeres.
Figur 7 viser et ikke primerforlængelsesforsøg. På grund af overskydende RNA i revers transkription reaktion, den genererede mængde af cDNA skaber en sådan stærkt signal, at de enkelte cDNA bands kan ikke skelnes. Dette gør det umuligt 5 'RNA ende beslutsomhed.
Ved anvendelse af højt udtrykte RNA'er i primerforlængelsesreaktionen, såsom ribosomalt RNA (som afbildet i figur 7), er risikoen for over-eksponerede områder kan øges. Derfor skal mængden af total RNA template justeres til overflod af RNA af interesse. I modsætning hertil, når transkripter af interesse kun udgør en lille del af det totale RNA, beløbet i revers transkription reaktion skal øges, ellers signalerne være for svag (ikke vist). Dette gælder også for Sanger sekventering reaktion, som multikopi skabeloner per celle (såsom rRNA eller gener kodet på plasmider) resulterer i meget stærkere signaler.
Figur 7. repræsentativt resultat af et mislykket primerforlængelse fra ng> S. aureus. 16S RNA er meget rigelige i bakterieceller. Dette fører til stærke revers transskription signaler, når der anvendes moderate mængder af total RNA. I det her viste tilfælde, de stærke cDNA bands maskere nøjagtige 5'-enden og forhindrer derfor 5'-kortlægning. Desuden ribosomale RNA'er er meget struktureret og kan derfor afslutte revers transkription tidligt korteog cDNA produkter, der ikke repræsenterer fuld længde fragmenter. I dette tilfælde stigende revers transkription temperatur, sammen med en varmebestandig revers transkriptase kan gøre det lettere at syntetisere sidste sekundære strukturer. På grund af flere kopier af sekvensen i det genomiske DNA, Sanger sekventeringsstige er stærkere end for en enkelt kopi gener. At forbedre gelbillede, RNA og DNA beløb for revers transkription og Sanger reaktion bør reduceres, og / eller mindre produkt påføres gelen._upload / 52134 / 52134fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Tabel 1: DNase-fordøjelse af RNA.
| Stof | Beløb |
| RNA fra trin ovenfor | 70-100 ug |
| 10x DNase I buffer (100 mM Tris, pH 7,5, 25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2) | 50 pi |
| DNase I, RNase-frit (2 U / pl) | 10,0 pi (op til 10 ug RNA per 1 pi DNase I) |
| Bring volumen op til 500 pi med Hedeselskabet 2 O (DEPC behandlet) | |
Reaktionsvolumen og mængden af DNase I kan skaleres op eller ned afhængigt af mængden of RNA anvendes.
Tabel 2: RNA-primer-hybridisering.
| Forbindelse | Beløb til en reaktion |
| RNA | 5-15 ug |
| Fluorescensmærket primer | 2 pmol |
| Bring volumen til 6 pi med Hedeselskabet 2 O (DEPC-behandlet) | |
Opsæt en reaktion pr RNA-prøven og primer.
Tabel 3: Primerforlængelse mastermix.
| Forbindelse | Beløb til en reaktion |
| Hedeselskabet 2 O (DEPC-behandlet) | 1.3 pi |
| AMV RT Buffer (10x) | 1.0pi |
| dNTP'er (10 mM, RNase-frit) | 1,0 pi |
| RNase Inhibitor | 0,2 pi |
| AMV revers transkriptase (RT) (20 til 25 U / pl) | 0,5 pi |
Opskalering til antallet af reaktioner, der er nødvendige.
Tabel 4: 10x TBE opskrift.
| Stof | Beløb |
| Tris Base | 107,8 g |
| Borsyre | 55,0 g |
| EDTA | 7,4 g |
| Bring volumen op til 1.000 ml med ultrarent Hedeselskabet 2 O og filter til at fjerne støv og fnug | |
Filter for at fjerne støv og fnug og opbevares ved 4 °C.
Tabel 5: Sequencing gel opskrift.
| Forbindelse | Beløb |
| Urea | 10,5 g |
| Hedeselskabet 2 O (MilliQ) | 13,0 ml |
| 10x TBE | 2,5 ml |
| XL Rapid gelopløsning | 5,0 ml |
| TEMED (N, N, N ', N'-Tetramethylethane-1,2-diamin) | 25 pi |
| APS (Ammonium persulfat, 10%) | 175 pi |
Proces gelopløsning hurtigt efter tilsætning af TEMED og APS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fluorescent primerforlængelse er en enkel og hurtig metode til bestemmelse af 5 'enderne af RNA, enten til TSP- eller sekundær RNA-bearbejdning identifikation. På grund af anvendelsen af fluorescerende primere, kan reaktionerne blive oprettet og drives uden yderligere sikkerhedsforanstaltninger (i modsætning til i tilfælde af radioaktivt mærkede primere). Da prøverne påvises ved fluorescens, kan de afbildes mens elektroforese er i gang, som tillader hurtig analyse sammenlignet med radioaktive metoder, hvor X-ray film er almindeligt anvendt.
I almindelighed er kvaliteten af primerforlængelsesreaktionen er stærkt afhængig af den kvalitet og bindende kapacitet af primer. Hvis bindingsstedet er valgt for tæt på det område af interesse, kan primer smears maskere signalet, mens et bindingssted for langt væk (> 300 bp) fra 5 'ende kan resultere i en dårlig signal.
Det fluorescerende farvestof skal kovalent bundet til5'-enden af den brugerdefinerede DNA-oligonukleotid under syntesen og oligonukleotidet bør oprenset ved HPLC for at undgå interferens med revers transkription reaktion af resterende salte. De oligonukleotider med passende farvestof modifikation (se reagenser liste tabel for yderligere oplysninger om kompatible farvestoffer) kan bestilles fra de fleste oligonucleotidsyntesemetoder virksomheder og skal opbevares i mørke. Desværre har vi ikke kendskab til enzymatiske teknikker til at fastgøre farvestoffet til tidligere eksisterende oligonukleotider, som er mulig med radioaktivt mærkede nukleotider.
I sekventering her beskrevne system kan to forskellige fluorescerende farvestoffer anvendes til samtidigt at detektere to prøver, som deres excitation (ca. 700 og 800 nm) og emissionsspektre er forskellige. Bortset fra den oprindelige producent farvestoffer, kan andre farvestoffer, såsom angives på listen reagenser bruges til at producere fremragende resultater.
En anden vigtig faktor for prImer forlængelsesreaktioner er RNA kvalitet og mængde. Der bør udvises omhu for at fjerne DNA-kontaminanter, som revers transkriptase, såsom AMV RT kan anvende DNA som en skabelon 18.
Som vist i figur 7 detekterede signal styrken af bånd i gelen løb er afhængig RNA-mængde, der anvendes i revers transkription-reaktionen. Det er derfor vigtigt at justere mængden af total RNA, afhængigt af den forholdsmæssige mængde af RNA af interesse er til stede i prøven. Lav følsomhed ved denne metode er også en af ulemperne, som lave udtrykt RNA'er kan være vanskelig at opdage. Hvis der ikke kan påvises nogen signaler overhovedet, kan mængden af total RNA forøges eller RNA af interesse kan kunstigt overudtrykkes fra et plasmid.
Gel detektionsfølsomhed til fluorescens baseret primerforlængelse er omkring faktor ti lavere end 32P eller 33P radioisotop baseret primerekstension 19. Imidlertid kan denne ulempe kompenseres ved at justere mængden af cDNA lastet på gelen eller ved at øge mængden af RNA-template anvendes i revers transkription-reaktionen. I de fleste tilfælde, følsomheden er høj nok til tilfredsstillende resultater 4,5. Følsomheder lignende radioaktive primerforlængelser er rapporteret ved anvendelse af fluorescerende primere i kombination med en kapillær sequencer 3, med den fordel, korte eksponeringstider.
Omkostninger sammenligninger mellem fluorescens og radioaktivitet baseret primerforlængelser er vanskelige, da de afhænger af flere faktorer, såsom tilgængelige maskiner, grundere, stigen reaktioner, ledighed og vedligeholdelse af et laboratorium til arbejde med radioaktive stoffer, bortskaffelse af radioaktivt affald, uddannelse og individuelle sundhedsrisici . Fluorescerende primere er omkring fem til ti gange dyrere end ikke-mærkede standard primere (20 bp). Men disse primere kan anvendes i mindstet år (mere sandsynligt flere år) sammenlignet med 32 P-mærkede primere, som har en meget kortere halveringstid. Re-mærkning af primere er tidskrævende og dyrt på grund af behovet for ny radioaktivt materiale i hyppige intervaller. Hvis det samme sæt af primere anvendes i et længere tidsrum, fluorescerende primere er billigere end almindelige, radioaktivt mærkede primere. De væsentligste omkostninger punkt vil dog være den fluorescerende sequencer eller imager og købe dette apparat udelukkende med det formål at primerforlængelser måske ikke være omkostningseffektiv. Den her beskrevne metode er temmelig interessant for grupper, der er i besiddelse af eller har adgang til en sådan maskine.
Hvis en automatiseret sequencer gel ikke er tilgængelig, kan andre metoder til påvisning af fluorescens anvendes som godt. I dette tilfælde kan gelen køres i en standard elektroforeseapparat, om nødvendigt tørres og derefter overført til et fluorescerende imager (modeller er tilgængelige, der svarer til en flatbed scannere). Selvom den fordel at visualisere gelen under kørslen er tabt, kan brugen af radioaktive isotoper undgås på denne måde, en vigtig fordel for eksperimentatoren. Hertil kommer, at hvis de er tilgængelige, en kapillær sequencer kan bruges til separation og real-time detektion, hvilket kan bidrage til at øge følsomheden.
Forskellige metoder er blevet offentliggjort på hvordan man bruger fluorescerende primerekstension med automatiseret gel sekventering maskiner eller kapillære sequencere, men disse metoder kræver ofte et cDNA fældningstrin at koncentrere prøven (og fjerne urenheder) 19. I fremgangsmåden beskrevet her DNA udfældning er ikke nødvendigt og dermed reducere forberedelsestid. Endnu vigtigere er imidlertid, at udelade dette trin gør det muligt at semi-kvantitativt at bestemme mængden af RNA-molekyler i prøven, som uoverensstemmelserne udfældning procedure kan elimineres.
Det skal bemærkes, at selv5 'enderne af RNA-molekyler kan henføres primerforlængelsesreaktioner, forarbejdede og primære ender (transkriptionelle udgangspunkter) kan ikke være let at skelne. For at omgå disse begrænsninger, er af afgørende betydning omhyggelig planlægning af forsøgene med passende kontroller. Indlysende promotorsekvenser kan indikere tilstedeværelsen af en transkriptionel udgangspunkt og muterer eller sletning promotorelementer skal derefter afskaffe cDNA bands. På den anden side, hvis sådanne sekvenser mangler eller specifikke konsensussekvenser er til stede, båndene kan være forårsaget af behandling af RNA. Hvis enzymet behandling er kendt og kan oprenses, kan in vitro primerforlængelser bringe afklaring, transskription og forarbejdning kan adskilles. Desuden kan andre fremgangsmåder, såsom 5'-RACE (herunder enzymatisk berigelse af uforarbejdede RNA-molekyler) komplementerer primerforlængelser at skelne transkriptionelle startsteder fra RNA-bearbejdning.
The primerekstensionsprodukt metode er ofte sammenlignet med andre metoder såsom 5-RACE og S1 nucleasebeskyttelsesbestemmelser og dermed dens anvendelighed er undertiden spørgsmålstegn. RNAseq teknikker i kombination med næste generation sequencing for eksempel kan hjælpe med at bestemme TSP'er og forarbejdning lokaliteter af mange af RNA'er parallelt, men den finansielle byrde og bioinformatiske arbejde, der kræves gør det ret urentabel for enlige RNA'er af interesse. 5'-RACE på den anden side er billigere og resultaterne er lettere at analysere, men hvis RNA'er behandles på flere måder eller flere transkriptionelle udgangspunkter er til stede, skal produktet klones og en stor mængde af kandidater skal planlægges til opnå en repræsentativ visning af RNA'er af interesse.
Derfor, på trods af nye metoder, der er opstået i årenes løb, selv i dag primer extensions har deres berettigelse på grund af brugervenligheden, lave omkostninger og kort gennemløbstid, hvilket især er tilfældettil fluorescens metode præsenteres her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/µl) | NEB / Roche | NEB: M0277-T / Roche: 10109118001 | |
| DNase I (RNase free) | Ambion (life technologies) | AM2222 | |
| FastPrep-24 Instrument | MPBio | 116004500 | |
| Fluorescently labeled primers | Biomers | n/a | 5’ DY-681 modification of “ordinary” DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna. |
| Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software | Li-Cor | Product discontinued | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Nuclease free water | Ambion (life technologies) | AM9915G | |
| Plasmid mini preparation kit | QIAGEN | 12125 | |
| RapidGel-XL-40% Concentrate | USB | US75863 | |
| RNA STORAGE BUFFER | Ambion (life technologies) | AM7000 | |
| Roti-Aqua-P/C/I | Carl Roth | X985.3 | Alternative: “Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)” from Ambion (AM9720) |
| SUPERase•In RNase Inhibitor | Ambion (life technologies) | AM2696 | |
| Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP | GE Healthcare | RPN2538 | |
| TRIzol reagent | life technologies | 15596-026 | |
| Zirconia/Silica Beads 0.1 mm | BioSpec | 11079101z |
References
- Simpson, C. G., Brown, J. W.
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).
- Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension. Biotechniques. 35, 90-94 (2003).
- Schuster, C. F., et al. Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum. J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).
- Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems. Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).
- Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M.
- Schuster, C. F., Bertram, R. Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate. FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).
- Goeders, N., Van Melderen, L. Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems. Toxins. 6, 304-324 (2014).
- Yamaguchi, Y., Inouye, M. mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems. Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).
- Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase. FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).
- Zhu, L., et al. et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP. J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).
- Zhu, L., et al. The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA. Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).
- Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).
- Marmur, J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).
- Emory, S. A., Belasco, J. G. The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency. J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).
- Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).
- Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals. Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 Forthcoming.
- Yu, H., Goodman, M. F. Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates. J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).
- Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA. RNA. 13, 2042-2050 (2007).
