Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fluorescens-slukking av en Liposomalinnkapslet Nær-infrarød fluoroforen som et verktøy for Published: January 5, 2015 doi: 10.3791/52136
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3, 2, 1
1Experimental Radiology, Institute of Diagnostic and Interventional Radiology I, Jena University Hospital, 2Department of Pharmaceutical Technology, Friedrich-Schiller-University Jena, 3Center for Electron Microscopy, Jena University Hospital
* These authors contributed equally

Introduction

Liposomer har blitt intensivt undersøkt og tjener som en av de biokompatible biomedisinske medikamentleveringssystemer for kliniske anvendelser 1,2. De er hovedsakelig sammensatt av fosfolipider og kolesterol, som begge er biokompatible forbindelser som etterligner deler av naturlige cellemembraner. Mens hydrofile stoffer kan bli innesluttet i det vandige indre, kan lipofile midler innarbeides i liposomalt fosfolipid dobbeltlag 3. Innkapsling av stoffer i det vandige indre av liposomer gir beskyttelse mot degradering in vivo, og hindrer også at vertssystemet fra toksiske effekter av cytotoksiske medikamenter anvendt for behandling av sykdommer, for eksempel kjemoterapeutika som tar sikte på å ødelegge tumorceller. Modifikasjonen av den liposomale overflaten med polymerer som polyetylenglykol (PEGylering) videre strekker den liposomale blodsirkulasjonstiden in vivo på grunn av sterisk stabilisering 4. Moreoveh, liposomer kan sekvestrere høye konsentrasjoner av flere stoffer slik som proteiner 5,6, hydrofile substanser og enzymer 7,8 9. De tjener derfor som pålitelige kliniske terapeutiske og diagnostiske verktøy som fortjener sin godkjenning for levering av cytotoksiske legemidler som doxorubicin for kreftbehandling 4. På grunn av sin fleksibilitet, kan liposomer også være lastet med fluorokromer for diagnostiske og bildestyrt kirurgi formål.

Fluorescens bildebehandling gir en kostnadseffektiv og ikke-invasiv in vivo diagnostisk verktøy som imidlertid krever noen grunnleggende krav. Det kunne påvises at fluorokromer som passer best for in vivo avbildning har karakteristisk absorpsjon og emisjon maksima i området hvor lysspredning og spredning, så vel som vev autofluorescens som stammer fra vann og hemoglobin er lav. Dermed slike sonder har sin abs / em maxima mellom 650 og 900 nm 10. I tillegg til dette, er stabiliteten av fluorokromer både in vitro og in vivo kritisk, som opsonisering og rask klaring kan i stor grad begrenser deres anvendelse for in vivo avbildning 11. Andre effekter som dårlig stabilitet og lav følsomhet eller cytotoksiske effekter på målorganer som sett med indocyanine grønn (ICG) 12-16, er uønsket og må tas hensyn til ved utformingen av sonder for in vivo imaging. Disse observasjonene har ført til aktiv utvikling av flere prekliniske NIR fluorokromer, nanopartikler samt nye teknikker for in vivo avbildning av inflammatoriske prosesser, kreft og for bildestyrt kirurgi 17-20. Til tross for stabiliteten av de prekliniske NIRF (nær infrarød fluorescens) fargestoffer som in vitro, er deres hurtige perfusjon og klaring gjennom leveren og nyrene hindrer deres anvendelse i in vivo optisk avbildning av sykdommer og inflammatoriske prosesser.

ntent "> Vi vil derfor presentere en protokoll for innkapsling av fluorokromer slik som godt karakterisert nær-infrarøde fluorescerende fargestoff DY-676-COOH som er kjent for sin tendens til å selv-avkjølings ved relativt høye konsentrasjoner 21 i liposomer. Ved høye konsentrasjoner H- dimer-dannelse og / eller pi-stabling interaksjoner mellom fluoroformolekyler som befinner seg innenfor hverandres Förster radius resultat Forster resonans energioverføring (FRET) mellom fluorokromkonjugerte molekyler. Ved lav konsentrasjon rommet mellom fluoroformolekyler øker, for derved å hindre pi-stabling interaksjon og H-dimer-dannelse og som resulterer i høy fluorescensemisjonen. Bryteren mellom høy og lav konsentrasjon, og det medfølgende fluorescensslukking og aktivisering er en lovende strategi som kan utnyttes for optisk avbildning 22. I dette henseende, innkapsling av høye konsentrasjoner av NIRF fargestoff DY-676-COOH i den vandige indre av liposomer er flere favorable for in vivo avbildning enn den gratis fargestoff. Utfordringen av metoden ligger først og fremst i riktig innkapsling og for det andre, i valideringen av fordelene som følger av innkapsle høye konsentrasjoner av fargestoffet. Sammenligning av de bildedannende egenskaper av bråtilsatt liposomer med det av den frie fargestoff og også med en ikke-undertrykket liposomformulering med lave konsentrasjoner av fargestoffet er uunnværlig. Vi viser av en enkel, men svært effektive film hydrering og ekstrudering protokoll kombinert med alternative fryse og tinesykluser som innkapsling av slukke konsentrasjoner av DY-676-COOH i liposomer er gjennomførbart. Andre metoder som brukes for å fremstille liposomer for eksempel revers fase fordamping metode 23 samt etanolinjeksjonsmetoden 24 aktiverer liposompreparat med høye innkapslingseffektiviteter for mange hydrofile stoffer. Imidlertid arten av den substans som skal innkapsles kan påvirke innkapslingseffektivitet. I praksisfilmen hydrering og ekstrudering protokollen presenteres her avslørte den høyeste effektivitet for innkapsling av DY-676-COOH. For å illustrere fordelene ved liposomal innekapsling av DY-676-COOH, en zymosan-induserte ødemmodell, som tillater undersøkelse av inflammatoriske prosesser innen noen få timer, ble anvendt. Her er det vist at liposomer med høye konsentrasjoner av den innkapslede DY-676-COOH er mer egnet for hele kroppen in vivo optisk avbildning av inflammatoriske prosesser enn det frie fargestoff eller den ikke-undertrykket liposomal formulering med lav fargestoffkonsentrasjoner. Således underliggende protokoll gir en enkel og rask metode for å produsere slukket fluorescerende liposomer og validering av deres aktivering og avbildning potensial både in vitro og in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Alle prosedyrer er godkjent av regional dyr komiteen og i samsvar med internasjonale retningslinjer for etisk bruk av dyr.

1. Utarbeidelse av materialer og instrumenter

  1. Utarbeidelse av spontant dannet vesikkel spredning (SFV)
    1. Oppløs og forberede stamoppløsninger med følgende fosforlipider: 214 mg / mL Egg-fosfatidylkolin (EPC), 134 mg / ml kolesterol, 122 mg / ml 1,2-distearoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [metoksy (polyethylen glykol) -2000] (ammoniumsalt) (mPEG 2000 -DSPE) og 2 mg / ml 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4 -yl) (ammonium salt) (NBD-DOPE) i kloroform og butikk i glassflasker.
    2. Innrede ca. 3 ml kloroform i en rundbunnet kolbe og overføre passende volum av fosfolipid stamoppløsning inn i rundkolbe for å fremstille liposomer bestående av EPC: Chol: mPEG 2000 -DSPE ved et molforhold av 6,5: 3: 0,5. For dobbelt fluorescens merking av liposomer legge 0,3 mol-% NBD-DOPE til lipidoppløsningen.
    3. Fordamp kloroformen fra den organiske fosfolipid oppløsningen under redusert trykk (300 mbar) ved 55 ° C ved anvendelse av en rotasjonsfordamper.
    4. Etter en homogen fosfolipid film er dannet, redusere trykket til 10 mbar i 1-2 timer for å fjerne gjenværende kloroform innskudd.
    5. Mens kloroform, fordamper, oppløser DY-676-COOH (6,181 uM) i 10 mM Tris-buffer pH 7,4 og fylle en Dewar-beholder med flytende nitrogen. Slå på et ultrasonisk bad og satt ved 50 ° C.
    6. Overfør en passende mengde (0,5-1 ml) av DY-676-COOH (6,181 uM) løsning av rundkolbe å hydratisere fosfolipidet tørre film og vortex kraftig inntil en spontant dannet vesikkel (SFV) sprednings former. Sørg for at alle de fosfolipider er spredt for å unngå lipid tap.
    7. Nøye transfer rundbunnet kolbe inneholdende SFV dispersjon i flytende nitrogen og fryse dispersjonen etter 3-5 min. Plasser rundbunnet kolbe i et ultralydbad ved 50 ° C for å tine dispersjonen deretter vortex dispersjonen kraftig i 1-2 min. Gjenta denne prosedyren seks ganger, slik at totalt syv fryse og tinesykluser.
  2. Ekstrudering av SFV å danne homogene liposomvesikler
    1. Overfør SFV dispersjon i en 1 ml sprøyte (sprøyte-a) og ekstrudere dispersjonen gjennom en 100 nm polykarbonatmembran ved anvendelse av en LiposoFast-Basic ekstruder inn i sprøyte-b.
    2. Ekstrudere spredning fra sprøyte-b, tilbake i sprøyte-en, deretter gjentar syklusen ti ganger. På grunn av ekstrudering, løsningen i sprøyten endres fra et tåkete utseende til en klar dispersjon med tiden. Etter ti sykluser (tjue enkeltpress trinn) fjerne sprøyte-b fra enheten og ekstrudere spredning for siste gang fra sprøyte-en direkte inn i en steril1,5 ml reaksjon tube.
  3. Rensing av liposomalinnkapslede DY-676-COOH fra gratis fargestoff
    1. Fremstille en gel-kromatografi-kolonne ved hjelp av G25-perler fuktet i 10 mM Tris-buffer pH 7,4 (kolonne lengde 28 cm, diameter 0,8 cm).
    2. Overfør 0,5 ml av ekstrudert vesikkel-dispersjon på gellaget og la prøven renne inn i gelmatriksen.
    3. Eluer liposomer med 10 mM Tris-buffer pH 7,4 (figur 1A) og vaske kolonnen inntil de frie fargestoff avløp helt ut av kolonnen. Hvis behovet være, samle inn og resirkulere den gratis fargestoff ved avsalting og dehydrering i henhold til produsentens instruksjoner.
    4. Konsentrere de eluerte liposomene ved ultrasentrifugering (200.000 x g, 2 timer ved 8 ° C) og deretter dispergere dem i tilstrekkelig volum av steril 10 mM Tris-buffer pH 7,4.
  4. Kvantifisering av innkapslet DY-676-COOH konsentrasjon
    1. Forberede en kalibreringskurve ved å løse DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 nM) i 10 mM Tris-buffer, pH 7,4 inneholdende 0,1% Triton X100.
    2. Oppløs 2 pl (100 nmol endelige lipid av en 50 mmol / L lager) av liposomene i 5 min ved værelsestemperatur i 100 ul Tris-buffer inneholdende 1% Triton X100 å ødelegge vesiklene og frigjøre det innkapslede fargestoff. Deretter fortynne prøvene med 10 mM Tris-buffer, pH 7,4 til en endelig Triton-X100-konsentrasjon på 0,1% (v / v) noe som gjør et totalvolum på 1 ml. Forbered alle prøvene i duplikat.
    3. Måle absorpsjon og avgivelse av alle prøvene (fri DY-676-COOH og Triton-X100 behandlede liposomer) ved en eksitasjon λ = 645 nm og en emisjons λ = 700 nm. Etablere og bruke en kalibreringskurve for den frie fargestoff for å bestemme konsentrasjonen av innkapslet fargestoff.
  5. Liposome karakterisering
    1. Bestemme størrelser og zeta potensialet i liposomer av dynamisk lysspredning. Fortynne liposomholdige prøver med filter sterilisert (0,2 mikrometer) 10 mM Tris buffer pH 7,4 til aconcentration på 100-300 mikrometer (lipid). Overfør de fortynnede prøvene til et lavt volum disponibel kyvette og måle prøven i henhold til produsentens instruksjoner.
    2. Karakterisere liposomer ved elektronmikroskopi for å sannsynliggjøre størrelsen, integritet og homogenitet liposomholdige vesikler i henhold til standard protokoller.

2. Validering av fluorescens-leskende og Aktivering av Preparerte Liposomes

  1. Fysisk-kjemiske analyser av fluorescensslukking og aktivisering
    1. Forbered to 1,5 ml rør for Lip-Q og to rør for den frie DY-676-COOH. Overfør 100 nmol totale lipider (2,38 mL av en 42 mmol / L Lip-Q stamoppløsning, som inneholder 138 ug / ml av det innkapslede DY-676-COOH) til de tilsvarende rør. Overføre gratis DY-676-COOH tilsvarende fargestoffet innhold av Lip-Q (0,38 mikrogram som resulterer for eksempel fra 138 mikrogram / 1000 mL x 2,38 mL Lip-Q brukes). Inkuber ett badekare av hver sonde ved 4 ° C og fryse det andre rør ved -80 ° C over natten (16 timer).
    2. Varme opp en varmeblokk til 30 ° C. Fyll en kjølekasse med knust is, og i likevekt en alikvot av 10 mM Tris-buffer pH 7,4 til romtemperatur.
    3. Fjern prober fra 4 ° C, og i likevekt ved romtemperatur (innpakket i aluminiumfolie for å beskytte mot lys) og raskt tine prober fra -80 ° C til 30 ° C i 5 min. Chill de tinte sonder på is for 1 min før du overfører dem til romtemperatur (også innpakket i aluminiumsfolie for å beskytte mot lys).
    4. Tilsett 10 mM Tris-buffer (pH 7,4) til hver av sondene til 100 ul sluttvolum, og i likevekt alle probene ved RT i 10 min.
    5. Pipetter 80 ul av hver sonde til et lavt volum glass kyvetten og måler absorpsjonen av hver sonde 400 til 900 nm på et spektrometer. Sett proben til de tilsvarende rør.
    6. Overfør 80 ul av hver sonde inn i en egnet glass-kyvetteog måle fluorescensemisjonen på et spektrofluorometer med begge probene ved 674 nm og måling av fluorescensen 694-800 nm.
  2. Cellulært opptak og fluorescens aktivering
    1. Få og kulturen følgende cellelinjer i deres tilsvarende kulturmedier i henhold til standardbetingelser (37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktig atmosfære). Her anvendes det murine makrofag cellelinje J774A.1 (Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplert med 10% (v / v) føtalt kalveserum), human glioblastoma cellelinje U-118 mg (MEM inneholdende essensielle vitaminer og 10% (v / v) føtalt kalveserum) og human fibrosarcom-cellelinje HT-1080 (RPMI med 5% FCS).
    2. Coat 8-brønners kammerobjektglass med poly-L-lysin (tilsett 100 ul 0,001% poly-L-lysin til hver brønn og inkuberes ved 37 ° C i 10 min. Sug løsningen og la kammerobjektglass for å tørke i minst fire timer ved romtemperatur på en steril arbeidsbenk. Skyll kammer lysbilder 3ganger med 200 mL Hanks bufret saltløsning og deretter forsegle dem med parafin og aluminiumsfolie og oppbevares ved 4 ° C inntil behov.
    3. Mens kammer lysbilder tørker opp, filter-sterilisere liposomer og fargeløsning og oppbevares ved 4 ° C till nødvendig.
    4. For sonde opptak analyse med hele kroppen in vivo NIR fluorescens bildebehandling system, forberede fem små kulturflasker for hver av de tre testcellelinjer (15 kolber i alt). Seed 2 x 10 6 J774A.1, U-118 mg og HT-1080 celler per kultur kolbe med 5 ml av det respektive kulturmedium (i femdobbel) og vokse i 16-24 timer. Parallelt med kulturflasker, frø 30.000 celler av hver cellelinje (J774A.1 og HT-1080) eller 20.000 celler (U-118 mg) til 2 brønner i kammeret henholdsvis glide og vokse i 500 ul kulturmedium for 16-24 timers .
    5. På neste dag, tilsett 100 nmol (endelig lipid beløp) av Lip-Q til to kolber per cellelinje og til ett godt av hver cellelinje på kammeret lysbildet.Umiddelbart overføre en kolbe per cellelinje til 4 ° C og den andre kolben tilbake til inkubatoren.
      MERK: Volumet av probene tilsatt til kolbene og kammerobjektglass er de samme, slik at konsentrasjonen på kammerobjektglass 10 ganger høyere (5 ml er å 500 ul kulturmedium). Dette er nødvendig fordi mikroskopisk påvisning er mindre følsom enn den NIR fluorescens bildedannende system, hvor cellepelletene fra kolbene blir avbildet.
    6. Legg den frie DY-676-COOH ved en konsentrasjon ekvivalent med fargestoffet innholdet av Lip-Q til cellene i 2 kolber per cellelinje og til en brønn av hver cellelinje på kammeret lysbilde, og deretter umiddelbart å overføre en kolbe pr cellelinjen til 4 ° C (energitap), og den andre kolbe sammen med kammeret glide tilbake til inkubatoren. Inkuber alle cellene i 24 timer ved de tilsvarende forhold. Cellene i kolben uten sonden tjener som ubehandlet kontroll.
  3. NIRF bildebehandling og semi-kvantitativ analyse
    1. Etter 24 timers inkubering varighet, høste cellene i kolber ved vasking av cellene to ganger med Hanks bufret saltoppløsning (HBSS) og deretter skrape celler i 500 ul HBSS og pellet ved sentrifugering (5 min ved 200 x g) i 500 pl rør.
    2. Plasser rørene med cellen pellets (og HBSS) i en NIRF imager og bilde hjelp av filtre for eksitasjon (615-665 nm) og utslipp (kutt i> 700 nm).
    3. Trekke autofluorescence og vurdere intensiteten i mål versus autofluorescence i henhold til produsentens instruksjoner. Dette vil gi den semi-kvantitative nivåer av fluorescens-intensitet som gjennomsnittlig signal (skalerte tellinger / sek), som representerer tellenivåer etter skalering for eksponeringstid, kamera forsterkning, binning og bitdybde, slik at målingene er sammenlignbare mellom hverandre.
  4. Confocal mikroskopisk analyse
    1. Etter 24 timers inkubasjon, høste celler på kammer lysbilder ved å vaske to ganger med 500 mL HBSS.
    2. Fest cells med 200 ul HBSS inneholdende 3,7% (volum / volum) formaldehyd i 30 minutter ved RT.
    3. Mens fiksering som skjer, fortynne DNA flekken, Hoechst-33258 01:50 med monteringsløsning.
    4. Etter fiksering, vaske cellene to ganger med HBSS deretter skille kamrene fra glassplater. Tilsett 50 ul monteringsløsning inneholdende DNA-flekk på hver flekk svarende til brønnene av kammeret lysbilder. Dekk cellene med dekkglass, forsegle kantene med gjennomsiktig neglelakk og lufttørke i 10 min ved RT (mørk).
    5. Bilde celler på et egnet fluorescensmikroskop eller konfokalt mikroskop. Bruk følgende innstillinger eksitasjon og utslipps for visualisering av de tilsvarende komponenter: kjerner (Hoechst-33258: eksitasjon 405 nm, emisjon 420-480 nm). NBD-DOPE (liposomal lipid: eksitasjon 488 nm, emisjon 530 nm). DY-676-COOH (NIR fluorescerende fargestoff: eksitasjon 633-645 nm, emisjon 650-700 nm).
      MERK: Pass på at fluorescens mikroskop enTilg er utstyrt med egnede filtre som tillater eksitasjon og emisjonsbølgelengder høyere enn 630 nm.

3. Liposome-basert I Vivo fluorescens Imaging av Betennelse

  1. Fremstilling av dyr og material
    1. Hus 8-12 uker gamle NMRI mus som veier ca 36 g under standardbetingelser med mat og vann ad libitum.
    2. Syv dager før starten av forsøkene, at alle musene en lav feoforbid diett for å redusere vev autofluorescens.
    3. Tjuefire timer før starten av hvert forsøk, barbere mus i ønsket område (f.eks hele ryggen området hvis avbildning av bakbenet ødem er ønskelig).
    4. Veie dyrene og beregne mengden av sonde som skal injiseres per mus (Lip-Q og Lip-dQ ved 10 mikromol (lipid konsentrasjon) per kg vekt og gratis DY-676-COOH (tilsvarende fargestoff innhold av Lip-Q brukt) .
    5. Bilde dyrene ien hel kropp NIR Fluorescens imager med de samme innstillingene som brukes for celle pellets. Denne målingen gir autofluorescence av dyrene.
    6. Oppløs 10 mg zymosan-A i 1 ml isoton saltoppløsning, og lagre over natt ved 4 ° C.
  2. Induksjon av betennelse og in vivo NIRF bildebehandling
    1. Forbered tre sprøyter pr mus inneholder følgende løsninger. Fylle en sprøyte med 50 ul zymosan-A-oppløsning (10 mg / ml), og den andre sprøyte med 50 ul isoton saltoppløsning. Fyll tredje sprøyte med sondene, der Lip-Q og Lip-dQ (10 mikromol / kg vekt (lipid)) er utpekt for forsøksdyr og gratis DY-676-COOH (konsentrasjon som i Lip-Q) for kontrolldyrene. Sørg for at sondene fortynnes med sterilt HBSS til 150 mL endelig volum.
    2. Påfør øyekrem på øynene til dyrene for å unngå tørrhet og bedøve dyr med 2% isofluran til de er dypt sover og ikke reagerer ved berøring på potene (dette tar ca 2 min).
    3. Plasser musen på en varm matte (fortsatt under narkose) og injisere zymosan-A løsning subkutant på høyre bakben og saltvann på venstre bakben. Umiddelbart injisere sonden intravenøst ​​og bilde dyret etterpå da rekordtid injeksjons / måling (som t = 0 t). Lagre de resulterende bildene som bilde kuber og gjenta trinnene over for alle andre dyr og respektive sonder.
    4. Image dyrene hver 2 time i 10 timer etter injeksjon, og deretter ved 24 timer etter injeksjon, og pass på at den fasen av målekammeret er varm (for eksempel ved å plassere en varm matte under), for å unngå nedkjøling. Etter hver måling, plasserer dyrene i et bur med mat og vann ad libitum og plassere buret i et temperert dyr kammer. Avlive dyrene ved første bedøvelse med 2% isofluran til dyrene ikke lenger reagerer på berøring, så avlive med karbondioksid i 5-10 min, noe som gjørsikker på at dyrene slutter å puste helt og rigor mortis inntreffer.
    5. Dissekere mus i henhold til standard protokoller som kan vurderes på nettet (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) og bilde organer.
    6. Vurdere måleresultatene i henhold til produsentens instruksjoner ved først å trekke den samlede fluorescens av dyrene (unmixing) deretter tildele områder av interesse for autofluorescence (venstre bakben med saltvann) og målet fluorescens av betent område (høyre bakben med zymosan-A).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Innkapslingen av høye konsentrasjoner av fluorescerende fargestoffer som NIRF fargestoff DY676-COOH anvendes her i den vandige indre av liposomene fører til en høy grad av fluorescensslukking. Fluorescensslukking, et fenomen sett med mange fluoroforene ved høy konsentrasjon, kan utnyttes i flere in vivo bildebehandlingsprogrammer der en høy følsomhet og pålitelig deteksjon av målområdet er etterspurt. Bruken av liposomer gir også beskyttelse av fargestoffet som er uunnværlig for in vivo applikasjoner. En inngående karakterisering av liposomene er nødvendig og inkluderer flere faktorer slik som grad av fargestoff innkapslet, stabilitet og størrelsen av liposomene, fluorescensslukking og aktivitet av innkapslet fargestoff in vitro og også anvendelse for in vivo avbildningsformål. En sammenligning av det frie fargestoff, DY-676-COOH og bråkjølt liposomer (Lip-Q), så vel som en ikke-undertrykket liposom (Lip-dQ) med meget lav concentrasjon av den innkapslede fargestoff er derfor viktig spesielt for in vivo karakterisering.

Liposomer fremstilt ved hjelp av film hydrering og ekstrudering teknikken med suksessive fryse og tine sykluser før ekstrudering inneholde gjenværende frie fargestoffmolekyler som kan med hell separert fra liposomene på grunn av deres lengre oppbevaring i gelfiltrering matriks, sammenlignet med liposomer som eluere raskere ( Figur 1B). Avhengig av graden av fortynning etter gelfiltrering, muliggjør en valgfri ultrasentrifugetrinn konsentrasjonen av liposomene som vist (figur 1C). Basert på absorpsjons- og emisjonsegenskaper av den innkapslede fargestoff, er ​​konsentrasjonen av innkapslet fargestoff bestemt ved hjelp av en kalibreringskurve av det frie fargestoff (figur 1D). Dessuten er konsentrasjonen av innkapslet fargestoff, er det viktig å bestemme størrelsen og homogeniteten av liposomene aktreer forberedelse. Som vist i figur 1E, elektronmikroskopibilder av liposomer fremstilt ved den underliggende fremgangsmåte viser en hovedsakelig unilamellær morfologien til de liposomale vesiklene inneholdende intravesikulær DY-676-COOH enten innenfor slukkekonsentrasjonsområdet (Lip-Q; 606-846 pM DY-676 ) eller ved ikke-slukket fargestoff konsentrasjon (Lip-dQ, 25 mikrometer DY-676). Videre viser de en homogen størrelsesfordeling på ca. 120 nm og polydispersitet indekser langt under 1 (tabell 1). På grunn av fluorescensslukking viser Lip-Q to absorpsjonsmaksima i vandig buffer, hvor en topp er preget av en dreining mot de blå bølgelengder. I tråd med dette er det fluorescensemisjon svært lavt i forhold til den frie fargestoff (figur 2A og B, høyre). Fryse skade av liposomer i at frigjøring av fargestoffet, som blir fortynnet i den omkringliggende løsningen. Den blå-skiftet absorpsjonstopp derfor disappears, noe som resulterer i en enkelt absorpsjonstopp av Lip-Q. Svarende til dette, er en økning i fluorescensintensiteten til fryse skadet Lip-Q sett, noe som indikerer at fluorescens aktivering av frigjorte fargestoffer fant sted. Den frie fargestoff viser bare en enkelt absorpsjonsmaksimum og høy fluorescensintensitet som forblir på samme nivå, uavhengig av frysing (figur 2A og B, venstre). Dette funn tyder på at innkapslingen av fargestoffet i liposomer, som i Lip-Q ville beskytte fargestoffet fra miljøet, beholde høy konsentrasjon og den tilhørende fluorescensslukking og hvis aktiveres av puls triggere vil muliggjøre deteksjon på grunn av økning i fluorescens.

Liposomale prober med det underliggende lipidsammensetning viser en dominerende fagocytisk opptak som inhiberes av energimangel. Dette kan sees via opptak av Lip-Q med svært fagocytisk murin makrofag cellelinje J774A.1, ogmildt fagocytisk human glioblastoma cellelinje U-118 mg ved 37 ° C og inhibering ved 4 ° C (figur 3A og B). Den frie fargestoff DY-676-COOH viser opptaket i de fagocyttiske cellelinjer både ved 37 ° C og ved 4 ° C, noe som indikerer at den liposomale probe Lip-Q inneholder ingen restfritt fargestoff i løsning, og kan bare gjennomgå aktivt opptak. Konfokale laserskanning mikroskopiske bilder bygge denne opptak og aktivering av Lip-Q i fagocyttceller (Figur 3C). Videre er mangelen på fluorescens i ikke-fagocyttiske human fibrosarkom cellelinje, angir HT-1080 at opptaket av Lip-Q er overveiende ved fagocytose og således ville være egnet for avbildning av inflammasjon, hvor fagocytiske monocytter / makrofager som er involvert.

I samsvar med den fagocytisk opptak av liposomer sees i dyrkede cellelinjer, og på grunn av fluorescensslukking ved intravenøs injeksjon av Lip-Q fører til en tidsavhengig økning i fluorescensintensiteten av ødem i muse-modeller (figur 4A, Lip-Q), med meget lav bakgrunnsfluorescens. Maksimal fluorescens intensitet av ødem er oppdaget 8-10 timer etter injeksjon av Lip-Q. Derimot har relativt sterk NIR-fluorescens av hele mus er sett etter bruk av det frie DY-676-COOH (Figur 4A, DY-676-COOH) eller alltid-på liposomer, Leppe-dQ (Figur 4A, Leppe-dQ ). Sammenlignet med Lip-Q, rask perfusjon og rydding av gratis DY-676-COOH sett 0-4 timer etter injeksjon, forstyrrer bildebehandling, slik at pålitelig deteksjon av ødem er ikke mulig (Figur 4A, DY-676-COOH ). Videre er den ikke-undertrykket liposom, avslører Lip-dQ en maksimal fluorescens av ødem i løpet av 2-4 timer etter injeksjon, som forblir nesten konstant inntil 8 timer, og deretter gradvis avtar lik den bråkjølt Lip-Q-baserte ødem fluorescens. Utføre semi-kvantitativ analseres, der regioner av interesse (Rois) er satt for ødem versus bakgrunn, kan man gjøre konklusjoner om ulike nivåer av deteksjon med forskjellige sonder. Ifølge semi-kvantitativ analyse av fem dyr per gruppe (probe), kan ødem være mer signifikant (P = 0,001) detektert med Lip-Q enn ved den frie DY-676-COOH, eller den ikke-undertrykket, Lip-dQ (figur 4B).

Avbildnings organer av musene avlivet 24 timer etter injeksjon av prober avsløre mild ex vivo fluorescens av lever / galleblæren og nyrene, og en meget lav eller ingen fluorescens av milten, lungene og hjertet (Figur 5), som tjener som bevis for eliminering av sondene gjennom hepatobiliært.

Figur 1
Figur 1: Utarbeidelse av DY-676-COOH-lastet liposomers. (AC) Skjematisk oversikt over syntese trinnene involvert. (A) Oppsett av filmen hydrering og ekstrudering med nær-infrarøde dye DY-676-COOH. (B) Bilde av selvlagde gelfiltrerings oppsett som viser inter mellom ikke-innkapslet (gratis) fargestoff og liposomer. Liposomer elueres først og vises blå-grønn på grunn av den innkapslede DY-676-COOH (blått), og den inkorporerte grønne fosfolipid, NBD-DOPE. (C) Representative bilde av liposom-sediment (Lip-Q) etter konsentrering ved ultrasentrifugering. ( D) Representant kalibreringskurve DY-676-COOH i 10 mM Tris pH 7,4 (inneholder 1% Triton X100) som brukes for kvantifisering av liposomal fargestoff. (E) Cryo-transmisjon elektronmikroskop av Lip-Q. Klikk her for å se en større versjon av figuren.


Fig. 2: Fysiokjemiske bestemmelse av fluorescensslukking og aktivering in vitro (A) absorpsjonsspektra av Lip-Q (høyre) og fri DY-676-COOH (til venstre) målt i 10 mM Tris-buffer, pH 7,4, før eller etter frysing ved - 80 ° C. Legg merke til den karakteristiske doble toppen av Lip-Q i forhold til gratis DY-676-COOH og forsvinningen av den blå-skiftet topp etter fryse-skade av Lip-Q. (B) Tilsvar fluorescensemisjonsmaksimum spektra av Lip-Q (til høyre) og fri DY-676-COOH (til venstre) målt i 10 mM Tris-buffer pH 7,4 før eller etter frysing ved -80 ° C.

Figur 3
Figur 3: Cellulært opptak og fluorescens aktivering av leppen osomes. Bildene i (A) ble fremstilt ved NIR fluorescens avbildning av cellepelletene etter eksponering til de tilsvarende følere i 24 timer ved de angitte temperaturer. HT-1080 celler levde ikke 24-timers inkubasjonsperioder ved 4 ° C. Søylediagrammene i (B) representerer de semi-kvantitative nivåer av fluorescens-signaler fikk ved å tildele ROIs til cellepelletene i A. Hver stolpe betegner den gjennomsnittlige intensitet av n = 3 forsøk ± SD. Bilder i (C) ble kjøpt opp av konfokal laser scanning mikroskopi av celler eksponert for sonder på kultur kammer lysbilder i 24 timer ved 37 ° C. Legg merke til det høye nivået av fluorescens i høy fagocytisk murin makrofag cellelinje J774A.1 og den moderate fluorescens i mild fagocytisk human glioblastoma cellelinje U-118 mg. Den ikke-fagocyttiske human fibrosarcom-cellelinje HT-1080 viser ingen fluorescens av probene. NBD-DOPE: grønn fluorescerende fosfolipid.belastning / 52136 / 52136fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av figuren.

Figur 4
Figur 4. In vivo optisk avbildning av zymosan-indusert ødem hos mus. (A) Musen Bildet til venstre viser posisjonene av subkutant tilført zymosan-A (500 ug i 50 ul saltoppløsning) og kontrollsaltløsning (50 ul) på venstresiden. Intravenøs injeksjon av de angitte prober og hele kroppen NIR fluorescens bildebehandling på de angitte tidspunkter avslører gradvis, men høy økning i fluorescenssignaler av ødem og lav bakgrunnssignaler av Lip-Q (øvre panel) med en maksimal fluorescens på åtte timer etter injeksjon. Den gratis fargestoff avslører perfusjon og rask klarering innen 4 timer etter injeksjon (midterste rutenl), mens Lip-dQ avslører påvisning av ødem med lave signalintensitet og en samlet høyere bakgrunnsfluorescensen. Den grafiske presentasjon i (B) gjenta de observerte fluorescens-signaler av ødem påvist med hver probe sammenlignet med kontrollområdet (saltvann) i n = 5 dyr per gruppe. Hvert plott representerer de midlere fluorescens-signalene til (n = 5) ± SEM. Med grafene, er den maksimale fluorescenssignal av ødem oppdaget med hver sonde lett skilles (Lip-Q, 8 timers; Lip-dQ 2-4 hr og gratis DY-676-COOH, to timer etter injeksjon). Det er en signifikant (p = 0,001) høyere fluorescens intensitet av ødem med Lip-Q versus Lip-dQ ved t = 0-24 timer, og med Lip-Q versus fri DY-676-COOH ved t = 4-24 timer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av figuren.

Figur 5 Figur 5: Bio-optiske ex vivo bilder av organer fra mus 24 timer etter påføring, og probe tilsvar semi-kvantitativ analyse av fluorescens-intensitetene av de organer. Hver søyle representerer gjennomsnittet av fluorescensintensiteter (n = 4) ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av figuren.

Liposomformulering Størrelse [nm] Polydispersiteten Index (PI) Zeta Potensielle [mV]
Lip-dQ (dequenched) 123,4 ± 0,6 0,055 ± 0,02 -10,6 ± 0,4
Lip-Q (slukket) 118,5 ± 0,7 0,04 ± 0,02 -9 ± 2
Lip-NBD (w / o DY-676-COOH) 123,0 ± 1.4 0,04 ± 0,03 -11 ± 1

Tabell 1: Karakterisering av liposomer ved dynamisk lysspredning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Siden liposomer kan også tjene som leveringssystemer for fluorescerende fargestoffer, aktiverer de avbildning av målet sykdommer. Innkapslingen av høye konsentrasjoner av fluorescerende fargestoffer som NIRF fargestoff, DY676-COOH anvendes her, fører til en høy grad av fluorescensslukking av innesluttet fargestoff. Fluorescensslukking, et fenomen sett med mange fluoroforene ved høy konsentrasjon kan utnyttes i flere in vivo bildebehandlingsprogrammer, hvor en høy følsomhet og pålitelig deteksjon av målområdet er etterspurt. Bruken av liposomer gir også beskyttelse av fargestoffet som er uunnværlig for in vivo applikasjoner.

Filmen hydrering og ekstrudering teknikken er en mye brukt metode som gjør det mulig vellykket utarbeidelse av liposomer med ulike størrelse varierer avhengig av behov, og tillater modifikasjoner som innkapsling av et mangfold av ulike stoffer 25. Dermed er det egnet for utarbeidelse av leppeosomes innkapslet med NIR fluorescerende fargestoff, DY-676-COOH for bildebehandling formål. Metoden gir liposomer med 600-840 um intravesikulær fargestoffkonsentrasjon, som er innenfor den bråkjølt konsentrasjonen av fargestoffet. Den LiposoFast-Basic hånd ekstruder anvendes for homogenisering av spontant dannet vesikkel-dispersjon er egnet for liposom-preparatet i liten laboratorie skala, på grunn av forenligheten av anordningen, med sprøyter opp til 1 ml volum. For storskala preparater bruk av større høytrykks homogenisatorer som er i stand til å homogenisere vesikkel-dispersjoner med en kapasitet på 1000 l per time anbefales. Gelfiltreringen (størrelse eksklusjon) kromatografi er et viktig skritt som sikrer atskillelse av den innkapslede liposomal fargestoff fra ikke-innkapslet (gratis) fargestoffer 26. Lengden av gelfiltreringskolonne er avgjørende for en effektiv separering av liposomer fra frie fargestoff. Således er det nødvendig å fremstille en kolonne på minst 28 cm lengde to hell skille liposomer fra gratis DY-676-COOH brukt her. Interessant, er denne lengden to ganger så lenge som brukes til å rense karboksyfluorescein (CF) lastet liposomer fra gratis karboksyfluorescein. Den store ulempe ved gelfiltrering er en fem til seks ganger fortynning av de rensede prøvene. Dette kan kompenseres ved ultrasentrifugering, om høykonsentrerte liposomer er nødvendig. Under ultracentrifugation liposomene sedimenter og supernatanten kan fjernes lett 27. Andre metoder for å konsentrere liposomer slik som ved dialyse 28 er mer tidkrevende enn ultrasentrifugering.

I tillegg til den film hydrering og ekstrudering metoden, reversert fase-fordampningsmetoden 23 samt etanolinjeksjonsmetoden 24 aktiverer liposom-preparat med høy innkapslingseffektivitet for mange hydrofile stoffer. Men våre undersøkelser avslørte filmhydratisering kombinert med fryse og tine sykluss å være det mest hensiktsmessige metode for et tilstrekkelig intraliposomal innkapsling av DY-676-COOH. Ved å øke start DY-676-COOH konsentrasjon som brukes for film hydrering øker effekten og konsentrasjonen av intraliposomal fargestoff, når et fast lipid-konsentrasjon på 30 mM brukes. Til tross for dette er innkapsling effekt med fryse og tine-metoden er under 10% av utgangskonsentrasjonen fargestoff brukes, men imidlertid er tilstrekkelig for innkapsling av slukke konsentrasjonen som er nødvendig for avbildning. Videre kan den frie fargestoff separert fra liposomene ved gelfiltrering resirkuleres ved avsalting og dehydratisering i henhold til produsentens instruksjoner, slik at gjen innkapsling mulig, og en samlet minimalt tap av fargestoff. Innkapslingen av fargestoffet av den underliggende protokoll har ingen innflytelse på størrelsen og morfologien til liposomene som sett av polydispersiteten indekser og elektronmikroskopibilde av Lip-Q.

Flere enkle metoder kan brukes til å evaluate aktiviteten forberedt fluorescerende liposomes.DY-676-COOH har en høy tendens til selv slukke ved høye konsentrasjoner 21,29 trolig som følge av H-dimer dannelse og pi-stabling interaksjoner mellom fargestoffer. Disse interaksjonene, som oppstår på grunn av nærhet av Förster radier av fargestoffer ved høye konsentrasjoner, kan bli tilintetgjort ved fortynning 30. Derfor ikke innkapsling av høye konsentrasjoner av DY-676-COOH ikke bare beskytte fargestoffet fra opsonisering in vivo, men også fra det omgivende buffer, for derved å opprettholde sin høye konsentrasjon og beholde fluorescensslukking, som kan bli detektert som en blå-forskjøvet absorpsjon topp og lav fluorescensemisjonen som vist i figur 2. Frysing liposomer gradvis ved -80 ° C fører til dannelse av iskrystaller i det vandige indre 31 som forårsaker skade på liposomale membranen når forhastet tint ved 30 ° C. Utgivelsen, fortynning og fluorescens aktivasjon av intra-liposomal DY-676-COOH i buffer etter frysing er avslørt i en enkelt absorpsjonstopp og nesten 2,5 ganger økning i fluorescens intensitet (figur 2), noe som indikerer at Lip-Q sequesters dermed en høy, leskende konsentrasjon av DY-676-COOH og kan aktiveres. Andre fremgangsmåter for å ødelegge liposomale lipid bilag, for eksempel ved bruk av detergent eller organiske løsningsmidler ikke viser klare forskjeller mellom det frie fargestoff og liposomalt innkapslet fargestoff, siden de begge påvirker de spektrale egenskapene til mange fluorescerende fargestoffer 32. Den langsomme frysing og harde tining metode rapportert her derfor fungerer som en mer pålitelig og lovende metode for å validere høy innkapsling av fluoroforene i liposomer og en påfølgende fluorescensslukking. Fra absorpsjonen og emisjonsspektra av intakt Lip-Q (figur 2), kan en viss grad av gjenværende fluorescens påvises. Dette kan skyldes ikke-undertrykket fargestoff monomerer innenfor liposomes og også mot elektro samhandling og påvirkning av innkapslet fargestoff av fosfolipid polare hodegruppene 33.

Som kan sees i figur 3, en tydelig akkumulering av Lip-Q i den svært fagocytisk murin makrofag og mild fagocytisk human glioblastoma cellelinje U-118 mg 34, men ikke i den ikke-fagocyttiske human fibrosarcom-cellelinje HT-1080, angir at Lip-Q-basert avbildning av betennelse ville være gunstig, siden fagocytter er de viktigste aktørene i inflammatoriske prosesser. Det faktum at energi uttømming opphever opptak av Lip-Q, men ikke opptak av den frie DY-676-COOH bygger spesifisiteten av fagocytisk opptak av Lip-Q og avslører at Lip-Q forblir intakt under eksperimentet, ellers frigjøring av fargestoffet og energiuavhengig opptak ville finne sted fører til fluorescensdeteksjon. Embedding den grønne fluorescerende fosfolipid, NBD-DOPE i liposombilaget gjør mikroskopisk bildebehandling og discrimination mellom ikke-degradert fra cellulære degradert liposomer spesielt hvis tidsavhengige opptakseksperimenter er ferdig som rapportert tidligere 32. De mikroskopiske bilder viser NIR-fluorescens av DY-676-COOH som korrelerer med de nivåer av fluorescens-intensitetene av cellepelletene, som bestemt ved semi-kvantitativ analyse etter inkubering ved 37 ° C. I samsvar med dette er de murine makrofaglignende cellelinjer viser den høyeste fluorescens, mens human glioblastoma avsløre lavere fluorescens av både DY-676-COOH og NBD-DOPE enn den førstnevnte. Som forventet den menneskelige fibrosarcoma cellelinje, HT-1080 indikerer ingen fluorescens av enten liposomholdige fargestoffer eller gratis DY-676-COOH, noe som styrker det faktum at Lip-Q opptak, er hovedsakelig av fagocytose.

Å undersøke potensialet av Lip-Q-baserte fagocytose drevet in vivo avbildning av betennelse, ble flere kontroller vurderes. Tatt i betraktning at den frie DY-676-COOH kan tas opp av phagocytosis, opsonisering av Lip-Q kan føre til frigjøring av fargestoffet, som kan tas opp av fagocytter. For å unngå dette, ble Lip-Q forberedt med 5 mol% PEGylering. Videre er det nødvendig å skille mellom opptak på grunn av betennelse basert EPR effekt og aktivt opptak og fluorescens-aktivering. For å løse dette, evaluering og sammenligning av tre forskjellige prober, nemlig den alltid-på, Leppe-dQ, den slukket Lip-Q og gratis DY-676-COOH i mus med zymosan-indusert ødem var nødvendig. Zymosan-A som er forberedt fra celleveggene i Saccharomyces cerevisiae og Candida albicans er en naturlig stimulerende cytokinsekresjon via dectin-1 og toll-like receptor 2/6 (TLR 2/6). Skilles cytokiner i sin tur indusere aktivering av nedstrøms kaskader som resulterer i vaskulære lekkasjer, og dermed lettelser intravasation / bloduttredelse av monocytter / makrofager fra en milt reservoar 35 samt nøytrofile, og deres migrasjon til betennelse sider(Ødem) 36-39. Den zymosan baserte monocytter / makrofag bloduttredelse og migrasjonsprosessen må bare 4,5-6 timer som gjør zymosan et strategisk verktøy for å studere inflammatoriske prosesser 36-39. På grunn av de vaskulære lekkasjer som resulterer i løpet av betennelse, intravenøst ​​injiserte prober kan enten tas opp av monocytter / makrofager (fagocytter) under sin migrasjon til betennelse nettstedet eller ekstravasere og tas opp på ødem stedet (EPR effekt) 40. Bruken av den ikke-undertrykket Lip-dQ viser en generell bakgrunn for ødem sterkere signaler enn Lip-Q, og en fluorescens økning av ødem som reflekterer migrering av monocytter og makrofager. I kraft, er den maksimale fluorescens av ødem allerede sett 2-4 timer etter påføring av Lip-dQ og forblir nesten konstant til 8 timers. Motsetning til Lip-dQ og Lip-Q, gjennomgår den frie DY-676-COOH rask perfusjon etter injeksjon, og er ryddet innen fire timer, slik at distinkt avbildning av ødem er ikke mulig. Iterestingly, bruk av Lip-Q resulterer i vedvarende økning i fluorescensintensiteten av ødem og meget lave bakgrunnssignaler. Denne vedvarende økning i fluorescens-intensitet med Lip-Q tilskrives fluorescens aktivering av liposomal frigitt fargestoff. Til sammen kan det konkluderes med at bidraget av EPJ-effekt i Lip-Q basert bildebehandling er minimal siden Lip-dQ avsløre en maksimal fluorescens (EPR effekt og monocyte migrasjon) ved 4 timer etter injeksjon. Således gir liposomal innekapsling beskyttelse og distinkt levering av DY-676-COOH, som i sin tur muliggjør en mer pålitelig in vivo avbildning av ødem, utelukkende etter internalisering og nedbrytning (fluorescens-aktivering) av fagocytiske celler. Så langt er ny bruk av zymosan-indusert bakben ødem å validere bildeegenskapene til fluorescerende liposomer. Protokollen er rapportert heri kan utvides både ved innkapsling av forskjellige fluorescerende fargestoffer og med CCD effekten av forskjellige hemmende drugs på induksjon av betennelse, og representerer derfor et nyttig verktøy for fremstillingen og karakteriseringen av prober som er egnet for biomedisinsk avbildning.

En annen avgjørende skritt mot å definere egnede bilde sonder er verifikasjon av de farmakologiske egenskapene og eliminasjonsveier. Fordelingen av sonder i organer som spiller viktige roller i utskillelse, som lever og nyrer samt deres kort oppbevaring og egnet eliminasjon fra disse organene er vanligvis en indikasjon på at sondene vil mye sannsynlig viser ingen negative effekter på pasienten. I samsvar med dette, organer hos mus fremstilt 24 timer etter injeksjon av Lip-Q eller den frie DY-676-COOH avdekke bare mild fluorescens av leveren / galleblæren og nyrene, noe som viser en foretrukket eliminering av den liposomale fluoroforen via hepatobiliært. Den korte innkvartering av sondene i disse organene og deres effektiv fjerning underbygges av en 7-fold høyere fluorescenssignaler av organer utarbeidet seks timer etter injeksjon av Lip-Q eller gratis DY-676-COOH 32. Disse observasjoner er i overensstemmelse med eliminering av liposomer 41 og sikkerhetskopierer betydningen av å inkludere biofordelingsstudier ved karakterisering av prober. Selv om uønskede bivirkninger, for eksempel hudirritasjoner og komplementaktivering 42,43 er rapportert for liposomholdige formuleringer som brukes i kliniske applikasjoner, ble slike effekter ikke oppdages med de underliggende liposomer. Videre observasjon av immunmangelfulle mus to uker etter injeksjon sonde ført for å fullføre klaringen av sondene fra muse organer (ikke vist).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft tilskudd HI-698 / 10-1 og RU-1652 / 1-1. Vi takker Doreen mai for utmerket teknisk assistanse og selskapet DYOMICS GmbH, Jena for støtten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials and equipments for preparation of liposomes
egg phospahtidylcholine Avanti Polar Lipids 840051P Dissolve in chloroform and store in glass vials (214 mg/ml)
cholesterol Sigma C8667 Dissolve in chloroform and store in glass vials (134 mg/ml)
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) Avanti Polar Lipids 880120P Dissolve in chloroform and store in glass vials (122 mg/ml)
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) Avanti Polar Lipids 810145P Dissolve in chloroform and store in glass vials (2 mg/ml)
Sartorius MC1 (d = 0.01 mg) Sartorius AG Research RC 210 P used for weighing the phospholipids
Rotavapor Büchi Labortechnik AG R-114 used for hydration of phospholipid film
Waterbath Büchi Labortechnik AG R-481 used for hydration of phospholipid film
Vacuum Controller Büchi Labortechnik AG B-720 used for hydration of phospholipid film
Vacobox Büchi Labortechnik AG B-177 used for hydration of phospholipid film
Circulation Chiller LAUDA DR. R. WOBSER
GMBH & CO. KG		 WKL 230 used for hydration of phospholipid film
DY-676-COOH Dyomics GmbH 676-00 Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C
Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan Applichem A1086 buffer 10 mM, pH 7.4
Trichlormethan Carl Roth GmbH + Co. KG Y015.2 used for liposome preparation
Sonicator Merck Eurolab GmbH USR 170 H used for liposome preparation
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00) Scientific Industries Inc. SI-0256 used for liposome preparation
Sephadex G25 medium  GE Healthcare Europe GmbH 17-0033-01 used for liposome purification
Triton X100 Ferak Berlin GmbH 505002 used to destruct liposomes  for dye quantification
LiposoFast-Basic Avestin Inc. used for the extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) VWR used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic
Fluostar Optima BMG Labtech used for dye quantification
Zetasizer Nano ZS Malvern used for the determination of liposome size and zetapotential
Ultracentrifuge  Beckmann Coulter GmbH XL 80 used for concentration of the samples
Rotor Beckmann Coulter GmbH SW 55 TI used for concentration of the samples
Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging
Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae Sigma Z4250-250MG used for induction of inflammation
Isotonic Saline (0.9%) Fresenius GmbH PZN-2159621 used for the dilution of Zymosan-A
Isoflurane vaporizer Ohmeda Isotec 4 used for anesthesizing animals
Isoflurane Actavis GmbH  PZN-7253744 anesthesia
Thermo Mat Pro 20 W Lucky Reptile 61202-HTP-20 used to keep animals warm during anesthesia
Omnican-F (1 ml injection)  Braun PZN-3115465 used for subcutaneous and intravenous application of probes
Panthenol eye cream Jenapharm PZN-3524531 used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia
Hanks buffered saline solution PAA Laboratories /Biochrom AG L2045 w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells
8-Well chamber slides BD Biosciences 354108 used for cell culture followed by microscopy 
Cell culture flasks Greiner BioOne
Cell culture media Gibco (life technologies GmbH)
Fetal calf serum  Invitrogen
Poly-L-Lysine solution (0.01%, 50 ml) Sigma P4832 used to coat cell culture chamber slides
Mountant Permafluor ThermoScientific  S21022-3 Mounting solution for microscopy
Hoechst-33258 AppliChem DNA stain for microscopy
Hera-Safe Heraeus Instruments sterile work bench used for cell culture
HERA cell Heraeus Instruments Incubator used for cell culture
LSM510-Meta Zeiss used for confocal microscopy
Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system CRi, Woburn used for whole body fluorescence imaging of small animals
Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV) GE Healthcare used for measurement of absorption
Spectrofluorometer (Jasco FP-6200) Jasco used for measurement of fluorescence emission
Animals
NMRI mice (8-12 weeks old, male) Elevage Janvier, France used for inflammation trials

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
  2. Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers). Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
  3. Cabanes, A., et al. Enhancement of antitumor activity of polyethylene glycol-coated liposomal doxorubicin with soluble and liposomal interleukin 2. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 5, 687-693 (1999).
  4. Gabizon, A., Shmeeda, H., Grenader, T. Pharmacological basis of pegylated liposomal doxorubicin: impact on cancer therapy. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 45, 388-398 (2012).
  5. Balasubramanian, S. V., Bruenn, J., Straubinger, R. M. Liposomes as formulation excipients for protein pharmaceuticals: a model protein study. Pharmaceutical research. 17, 344-350 (2000).
  6. Meyer, J., Whitcomb, L., Collins, D. Efficient encapsulation of proteins within liposomes for slow release in vivo. Biochemical and biophysical research communications. 199, 433-438 (1994).
  7. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et biophysica acta. 858, 161-168 (1986).
  8. Mayer, L. D., Bally, M. B., Hope, M. J., Cullis, P. R. Techniques for encapsulating bioactive agents into liposomes. Chemistry and physics of lipids. 40, 333-345 (1986).
  9. Walde, P., Ichikawa, S. Enzymes inside lipid vesicles: preparation, reactivity and applications. Biomolecular engineering. 18, 143-177 (2001).
  10. Weissleder, R., Ntziachristos, V. Shedding light onto live molecular targets. Nature medicine. 9, 123-128 (2003).
  11. Licha, K., Riefke, B., Ebert, B., Grotzinger, C. Cyanine dyes as contrast agents in biomedical optical imaging. Academic radiology. 9 Suppl 2, S320-S322 (2002).
  12. Pauli, J., et al. Novel fluorophores as building blocks for optical probes for in vivo near infrared fluorescence (NIRF) imaging. Journal of fluorescence. 20, 681-693 (2010).
  13. Holzer, W., et al. Photostability and thermal stability of indocyanine green. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 47, 155-164 (1998).
  14. Gandorfer, A., Haritoglou, C., Kampik, A. Retinal damage from indocyanine green in experimental macular surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 316-323 (2003).
  15. Saxena, V., Sadoqi, M., Shao, J. Degradation kinetics of indocyanine green in aqueous solution. Journal of pharmaceutical. 92, 2090-2097 (2003).
  16. Kodjikian, L., et al. Toxic effects of indocyanine green, infracyanine green, and trypan blue on the human retinal pigmented epithelium. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 243, 917-925 (2005).
  17. Sevick-Muraca, E. M., Houston, J. P., Gurfinkel, M. Fluorescence-enhanced, near infrared diagnostic imaging with contrast agents. Current opinion in chemical biology. 6, 642-650 (2002).
  18. Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
  19. Hilderbrand, S. A., Kelly, K. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Monofunctional near-infrared fluorochromes for imaging applications. Bioconjugate chemistry. 16, 1275-1281 (2005).
  20. Langhals, H., et al. Cyanine dyes as optical contrast agents for ophthalmological surgery. Journal of medicinal chemistry. 54, 3903-3925 (2011).
  21. Pauli, J., et al. An in vitro characterization study of new near infrared dyes for molecular imaging. European journal of medicinal chemistry. 44, 3496-3503 (2009).
  22. Ogawa, M., Kosaka, N., Choyke, P. L., Kobayashi, H. H-type dimer formation of fluorophores: a mechanism for activatable, in vivo optical molecular imaging. ACS chemical biology. 4, 535-546 (2009).
  23. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75, 4194-4198 (1978).
  24. Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et biophysica acta. 298, 1015-1019 (1973).
  25. Fahr, A., van Hoogevest, P., May, S., Bergstrand, N., ML, S. L. Transfer of lipophilic drugs between liposomal membranes and biological interfaces: consequences for drug delivery. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 26, 251-265 (2005).
  26. New, R. R. C. Liposomes a practical approach. , IRL Press at Oxford University Press. (1990).
  27. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16, 2806-2810 (1977).
  28. Schwendener, R. A. The preparation of large volumes of homogeneous, sterile liposomes containing various lipophilic cytostatic drugs by the use of a capillary dialyzer. Cancer drug delivery. 3, 123-129 (1986).
  29. Pauli, J., et al. Suitable labels for molecular imaging--influence of dye structure and hydrophilicity on the spectroscopic properties of IgG conjugates. Bioconjugate chemistry. 22, 1298-1308 (2011).
  30. Wu, P., Brand, L. Resonance energy transfer: methods and applications. Analytical biochemistry. 218, 1-13 (1994).
  31. Stark, B., Pabst, G., Prassl, R. Long-term stability of sterically stabilized liposomes by freezing and freeze-drying: Effects of cryoprotectants on structure. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 41, 546-555 (2010).
  32. Tansi, F. L., et al. Liposomal encapsulation of a near-infrared fluorophore enhances fluorescence quenching and reliable whole body optical imaging upon activation in vivo. Small. 9, 3659-3669 (2013).
  33. Chen, R. F., Knutson, J. R. Mechanism of fluorescence concentration quenching of carboxyfluorescein in liposomes: energy transfer to nonfluorescent dimers. Analytical biochemistry. 172, 61-77 (1988).
  34. Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC cell biology. 6, 14 (2005).
  35. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
  36. Erdo, F., Torok, K., Aranyi, P., Szekely, J. I. A new assay for antiphlogistic activity: zymosan-induced mouse ear inflammation. Agents and actions. 39, 137-142 (1993).
  37. Ajuebor, M. N., et al. Endogenous monocyte chemoattractant protein-1 recruits monocytes in the zymosan peritonitis model. Journal of leukocyte biology. 63, 108-116 (1998).
  38. Ajuebor, M. N., Das, A. M., Virag, L., Szabo, C., Perretti, M. Regulation of macrophage inflammatory protein-1 alpha expression and function by endogenous interleukin-10 in a model of acute inflammation. Biochemical and biophysical research communications. 255, 279-282 (1999).
  39. Ajuebor, M. N., et al. Role of resident peritoneal macrophages and mast cells in chemokine production and neutrophil migration in acute inflammation: evidence for an inhibitory loop involving endogenous IL-10. J Immunol. 162, 1685-1691 (1999).
  40. Binstadt, B. A., et al. Particularities of the vasculature can promote the organ specificity of autoimmune attack. Nature. 7, 284-292 (2006).
  41. Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience reports. 22, 197-224 (2002).
  42. Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Understanding the correlation between in vitro and in vivo immunotoxicity tests for nanomedicines. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 172, 456-466 (2013).
  43. Szebeni, J., et al. Prevention of infusion reactions to PEGylated liposomal doxorubicin via tachyphylaxis induction by placebo vesicles: a porcine model. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 160, 382-387 (2012).

Tags

Bioteknologi Drug-levering liposomer Fluorokromer fluorescens-leskende optisk imaging Betennelse
Fluorescens-slukking av en Liposomalinnkapslet Nær-infrarød fluoroforen som et verktøy for<em&gt; I Vivo</em&gt; Optisk Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tansi, F. L., Rüger, R.,… More

Tansi, F. L., Rüger, R., Rabenhold, M., Steiniger, F., Fahr, A., Hilger, I. Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging. J. Vis. Exp. (95), e52136, doi:10.3791/52136 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter