Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fluorescens-quenching af et liposomalt indkapslet Near-infrarøde fluorofor som et værktøj til Published: January 5, 2015 doi: 10.3791/52136
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3, 2, 1
1Experimental Radiology, Institute of Diagnostic and Interventional Radiology I, Jena University Hospital, 2Department of Pharmaceutical Technology, Friedrich-Schiller-University Jena, 3Center for Electron Microscopy, Jena University Hospital
* These authors contributed equally

Introduction

Liposomer er blevet intensivt undersøgt og tjener som en af de mest biokompatible biomedicinske medikamentleveringssystemer for kliniske anvendelser 1,2. De er hovedsageligt sammensat af phospholipider og cholesterol, som begge er biokompatible forbindelser efterligner dele af naturlige cellemembraner. Betragtninger hydrofile stoffer kan indesluttes i det vandige indre, kan lipofile midler inkorporeres i den liposomale phospholipid dobbeltlag 3. Indkapsling af stoffer i det vandige indre af liposomer giver beskyttelse mod nedbrydning in vivo og forhindrer også værtssystemet fra toksiske virkninger på cytotoksiske lægemidler, der anvendes til behandling af sygdomme, for eksempel kemoterapeutiske midler med henblik på at ødelægge tumorceller. Modifikationen af den liposomale overflade med polymerer, såsom polyethylenglycol (PEGylering) strækker sig længere den liposomale blodcirkulationen in vivo på grund af steriske 4 stabilisering. MoreovER, liposomer kan udskille høje koncentrationer af flere stoffer, såsom proteiner 5,6, hydrofile stoffer 7,8 og enzymer 9. De tjener derfor som pålidelige kliniske terapeutiske og diagnostiske værktøjer, som fortjener deres godkendelse til levering af cytotoksiske lægemidler, såsom doxorubicin til kræftbehandling 4. På grund af deres fleksibilitet, kan liposomer også fyldt med fluorochromer til diagnostiske og billed-guidede kirurgiske formål.

Fluorescensimagografi tilvejebringer en omkostningseffektiv og ikke-invasiv in vivo diagnostisk værktøj, som dog kræver nogle grundlæggende krav. Det kunne påvises, at fluorokromer, der passer bedst til in vivo imaging har karakteristisk absorption og emissionsmaksima i området, hvor lysspredning og spredning samt væv autofluorescens stammer fra vand og hæmoglobin er lav. Således sådanne prober har deres abs / em maxima mellem 650 og 900 nm 10. Udover dette, stabilitet fluorokromer både in vitro og in vivo er kritisk, da opsonisering og hurtig clearance i høj grad kan begrænse anvendelsen til in vivo imaging 11. Andre effekter såsom dårlig stabilitet og lav følsomhed eller cytotoksiske virkninger på målorganer som set med indocyaningrøn (ICG) 12-16, er uønsket og bør tages i betragtning ved udformningen af prober til in vivo billeddannelse. Disse observationer har ført til aktiv udvikling af flere prækliniske NIR fluorochromer, nanopartikler samt nye teknikker til in vivo-afbildning af inflammatoriske processer, kræft og til billedbehandling-guidet kirurgi 17-20. Trods stabilitet mest præklinisk NIRF (nær-infrarød fluorescens) farvestoffer in vitro, deres hurtige perfusion og clearance gennem leveren og nyren hindre deres anvendelse i in vivo optisk billeddannelse af sygdomme og inflammatoriske processer.

ntent "> Vi har derfor præsentere en protokol til indkapsling af fluorokromer såsom godt karakteriseret nærinfrarøde fluorescerende farvestof DY-676-COOH, kendt for sin tendens til selv-dæmpningen ved relativt høje koncentrationer 21 i liposomer. Ved høje koncentrationer H- dimerdannelse og / eller PI-stabling interaktioner mellem fluoroforen molekyler beliggende inden hinandens Förster radius resultat i Forster resonansenergioverførsel (FRET) mellem de fluorochrom molekyler. ved lav koncentration i rummet mellem fluoroforen molekyler stiger, og derved forhindre pi-stabling interaktion og H-dimerdannelse og resulterer i høj fluorescensemission. Kontakten mellem høj og lav koncentration og den ledsagende fluorescensundertrykkelse og aktivering er en lovende strategi, der kan udnyttes til optisk billeddannelse 22. I denne henseende, indkapsling af høje koncentrationer af NIRF farvestof DY-676-COOH i det vandige indre af liposomer er flere favorable til in vivo billeddannelse end det frie farvestof. Udfordringen af ​​metoden ligger først og fremmest i den korrekte indkapsling og for det andet, i valideringen af ​​de fordele, der følger af at indkapsle høje koncentrationer af farvestoffet. Sammenligning af billeddannende egenskaber bratkølede liposomer med den frie farvestof og også med en liposomformulering ikke-standset med lave koncentrationer af farvestoffet er uundværlig. Vi viser ved en simpel, men meget effektiv film hydrering og ekstrudering protokol kombineret med alternative fryse og tø-cykler, som indkapsling af quenching koncentrationer af DY-676-COOH i liposomer er muligt. Andre fremgangsmåder anvendes til at fremstille liposomer, såsom omvendt fase inddampning metode 23 samt ethanol injektion metode 24 aktivere liposompræparat med høje indkapslingseffektiviteter for mange hydrofile stoffer. Imidlertid er arten af ​​det stof, der skal indkapsles, kan påvirke indkapslingseffektiviteten. I realitetenfilmen hydrering og ekstrudering protokol præsenteres her viste den højeste effektivitet til indkapsling af DY-676-COOH. For at illustrere fordelene ved liposomal indkapsling af DY-676-COOH, en zymosan-induceret ødem model, der tillader undersøgelse af inflammatoriske processer inden for et par timer blev anvendt. Her er det vist, at liposomer med høje koncentrationer af det indkapslede DY-676-COOH er mere egnede til hele kroppen in vivo optisk billeddannelse af inflammatoriske processer end det frie farvestof eller den liposomale formulering ikke-quenchet med lave farvestofkoncentrationer. Således den underliggende protokol giver en enkel og hurtig metode til at producere standset fluorescerende liposomer og validering af deres aktivering og billedbehandling potentiale både in vitro og in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Alle procedurer er godkendt af den regionale dyr udvalget og i overensstemmelse med internationale retningslinjer for etisk anvendelse af dyr.

1. Fremstilling af materialer og instrumenter

  1. Fremstilling af spontant dannede vesikeldispersionen (SFV)
    1. Opløses og forberede stamopløsninger af følgende phospholipider: 214 mg / ml ægge-phosphatidylcholin (EPC), 134 mg / ml kolesterol, 122 mg / ml 1,2-distearoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - [methoxy (polyethylen glycol) -2000] (ammoniumsalt) (mPEG 2000 -DSPE) og 2 mg / ml 1,2-dioleoyl--sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazo 4 -y) (ammoniumsalt) (NBD-DOPE) i chloroform og opbevares i hætteglas.
    2. Furnish ca. 3 ml chloroform i en rundbundet kolbe og overføre det passende volumen af ​​phospholipid stamopløsning i den rundbundede kolbe for at forberede liposomer sammensat af EPC: Chol: mPEG 2000 -DSPE ved et molforhold på 6,5: 3: 0,5. For dobbelt fluorescens mærkning af liposomer tilsættes 0,3 mol% NBD-DOPE til lipidopløsningen.
    3. Inddampes chloroform fra den organiske phospholipidopløsningen under reduceret tryk (300 mbar) ved 55 ° C under anvendelse af en rotationsfordamper.
    4. Efter en homogen phospholipid film dannes, reducere trykket til 10 mbar i 1-2 timer for at fjerne resterende chloroform deponering.
    5. Mens chloroform inddampning opløses DY-676-COOH (6,181 uM) i 10 mM Tris-buffer pH 7,4, og fylde en Dewar fartøj med flydende nitrogen. Tænd et ultralydsbad og indstillet på 50 ° C.
    6. Overføre en passende volumen (0,5-1 ml) DY-676-COOH (6,181 uM) opløsning til den rundbundede kolbe til at fugte tør phospholipid film og vortex kraftigt til en spontant dannet vesikel (SFV) dispersion former. Sørg for, at alle de phospholipider er spredt for at undgå lipid tab.
    7. Omhyggeligt transfer den rundbundede kolbe indeholdende SFV dispersion i flydende nitrogen og fryse dispersion til 3-5 min. Den rundbundede kolbe anbringes i et ultralydsbad ved 50 ° C for at optø dispersionen derefter vortexes dispersion kraftigt i 1-2 min. Gentag denne procedure seks gange, hvilket i alt syv fryse og tø-cykler.
  2. Ekstrudering af SFV at danne homogene liposomvesikler
    1. Overfør SFV dispersion i en 1 ml sprøjte (sprøjte-a) og ekstrudere dispersionen gennem en 100 nm polycarbonatmembran under anvendelse af en LiposoFast-Basic ekstruder i sprøjte-b.
    2. Ekstrudere spredning fra sprøjten-b, tilbage i sprøjten-a, gentages cyklus ti gange. Grundet ekstrudering opløsningen i sprøjten skifter fra en tåget udseende til en klar dispersion med tiden. Efter ti cykler (tyve enkelt ekstrudering trin) fjerne sprøjten-b fra enheden og ekstrudere dispersionen for sidste gang fra sprøjte-en direkte ind i en steril1,5 ml reaktion rør.
  3. Oprensning af liposomalt indkapslet DY-676-COOH fra frit farvestof
    1. Forbered en gelkromatografi søjle ved anvendelse af G25-perler gennemvædet i 10 mM Tris-buffer pH 7,4 (søjlelængde 28 cm, diameter 0,8 cm).
    2. Overfør 0,5 ml af ekstruderet vesikeldispersionen på gellejet og lad prøven afløb ind i gelmatrixen.
    3. Elueres liposomerne med 10 mM Tris-buffer pH 7,4 (figur 1A), og søjlen vaskes indtil de frie farvestof afløb helt ud af søjlen. Om nødvendigt indsamle og genanvende det frie farvestof ved afsaltning og dehydrering i overensstemmelse med producentens anvisninger.
    4. Koncentrer de eluerede liposomer ved ultracentrifugering (200.000 x g, 2 timer ved 8 ° C) og derefter sprede dem i passende volumen sterilt 10 mM Tris-buffer pH 7,4.
  4. Kvantificering af indkapslet DY-676-COOH-koncentration
    1. Forbered en kalibreringskurve ved at opløse DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 nM) i 10 mM Tris-buffer, pH 7,4, indeholdende 0,1% Triton X100.
    2. Opløs 2 pi (100 nmol endelig lipid af en 50 mmol / L stock) af liposomerne i 5 minutter ved stuetemperatur i 100 pi Tris-puffer indeholdende 1% Triton X100 at ødelægge vesiklerne og frigive indkapslede farvestof. Derefter fortyndes prøver med 10 mM Tris-buffer, pH 7,4 til en endelig Triton-X100 koncentration på 0,1% (v / v) at et totalt volumen på 1 ml. Forbered alle prøver i to eksemplarer.
    3. Mål absorption og emission af alle prøver (gratis DY-676-COOH og Triton-X100 behandlede liposomer) ved en excitation λ = 645 nm og en emission λ = 700 nm. Etablere og anvende en kalibreringskurve af den frie farvestof for at bestemme koncentrationen af ​​indkapslet farvestof.
  5. Liposom karakterisering
    1. Bestem størrelser og zeta-potentialet af liposomer ved dynamisk lysspredning. Fortynd de liposomale prøverne med filtersteriliseret (0,2 um) 10 mM Tris-buffer pH 7,4 til AConcentration 100-300 um (lipid). Overfør fortyndede prøver i en lav volumen engangskuvette og prøven måle i overensstemmelse med producentens anvisninger.
    2. Karakterisere liposomer ved elektronmikroskopi at underbygge størrelse, integritet og ensartethed i liposomale vesikler ifølge standard protokoller.

2. Validering af fluorescens-quenching og aktivering af tilberedt Liposomer

  1. Fysisk analyse af fluorescens quenching og aktivering
    1. Forbered to 1,5 ml rør til Lip-Q og 2 rør til den gratis DY-676-COOH. Overfør 100 nmol totallipider (2,38 pi af en 42 mmol / L Lip-Q stamopløsning indeholdende 138 ug / ml af det indkapslede DY-676-COOH) til de tilsvarende rør. Overfør gratis DY-676-COOH svarer til indholdet farvestof af Lip-Q (0,38 ug, som resulterer for eksempel fra 138 pg / 1.000 pi x 2,38 pi Lip-Q anvendes). Der inkuberes en karbade af hver probe ved 4 ° C og fryse det andet rør ved -80 ° C natten over (16 timer).
    2. Opvarm en varmeblok til 30 ° C. Fyld en køleboks med knust is og tempereres en alikvot af 10 mM Tris-buffer pH 7,4 til stuetemperatur.
    3. Fjern prober fra 4 ° C og ækvilibrering ved stuetemperatur (pakket ind i aluminiumfolie for at beskytte mod lys) og hurtigt tø prober fra -80 ° C ved 30 ° C i 5 min. Chill de optøede prober på is i 1 min før overføre dem til stuetemperatur (også indpakket i aluminiumfolie for at beskytte mod lys).
    4. Tilsæt 10 mM Tris-buffer (pH 7,4) til hver af proberne til 100 pi slutvolumen og tempereres alle prober ved stuetemperatur i 10 min.
    5. Pipette 80 pi af hver probe i en lav volumen glaskuvette og måle absorptionen af ​​hver probe 400-900 nm på et spektrometer. Retur sonden til deres tilsvarende rør.
    6. Overfør 80 pi af hver probe i en egnet glaskuvetteog måle fluorescensemission på et spektrofluorometer ved spændende proberne på 674 nm og måling af fluorescensen 694-800 nm.
  2. Cellulær optagelse og fluorescensaktivering
    1. Få og kultur følgende cellelinjer i deres tilsvarende dyrkningsmedier ifølge standardbetingelser (37 ° C, 5% CO2 og 95% fugtig atmosfære). Her bruge murine makrofag cellelinie J774A.1 (Dulbeccos modificerede Eagles medium suppleret med 10% (v / v) føtalt kalveserum), den humane glioblastom-cellelinje U-118 mg (MEM indeholdende essentielle vitaminer og 10% (v / v) føtalt kalveserum) og den humane fibrosarcom-cellelinie HT 1080 (RPMI med 5% FCS).
    2. Coat 8-brønds kammerobjektglas med poly-L-lysin (tilsættes 100 pi 0,001% poly-L-lysin til hver brønd og inkuberes ved 37 ° C i 10 min. Aspirer opløsning og lad kammerobjektglas at tørre op i mindst 4 timer ved stuetemperatur på et sterilt arbejdsbord. Skyl kammer dias 3gange med 200 pi Hanks saltopløsning derefter forsegle dem med paraffin og alufolie og opbevares ved 4 ° C indtil brug for.
    3. Mens kammeret glider tørrer op, filter-sterilisere liposomer og farveopløsning og opbevares ved 4 ° C indtil brug.
    4. For sonde optagelse analyse med hele kroppen in vivo NIR fluorescens imaging system, forberede 5 små dyrkningskolber for hver af de 3 test cellelinjer (15 kolber i alt). Seed 2 x 10 6 J774A.1, U-118 mg og HT-1080-celler pr dyrkningskolbe med 5 ml af den respektive dyrkningsmedium (i quintuples) og vokse i 16-24 timer. Parallelt med dyrkningskolberne, frø 30.000 celler af hver cellelinie (J774A.1 og HT-1080) eller 20.000 celler (U-118 mg) til 2 brønde i kammeret slide henholdsvis og vokse i 500 pi kulturmedium for 16-24 timer .
    5. Den næste dag, tilsættes 100 nmol (endelig lipid beløb) af Lip-Q til 2 kolber pr cellelinje og til en brønd af hver cellelinie på kammeret slide.Umiddelbart overføre 1 kolbe pr cellelinje til 4 ° C og den anden kasse tilbage til inkubatoren.
      BEMÆRK: Volumenet af proberne tilsat til kolberne og kammeret glider er de samme, at koncentrationen på kammerobjektglas 10 gange højere (5 ml at 500 pi kulturmedium). Dette er nødvendigt fordi mikroskopisk påvisning er mindre følsom end NIR fluorescensimagografi system, hvor cellepellets fra kolberne afbildes.
    6. Tilsæt fri DY-676-COOH ved en koncentration svarende til indholdet farvestof Lip-Q til cellerne i 2 kolber pr cellelinje og til en brønd af hver cellelinie på kammeret slide, derefter straks overføre 1 kolbe pr cellelinie til 4 ° C (energiudtømmelse), og den anden kolbe sammen med kammeret slide tilbage til inkubatoren. Inkuberes alle cellerne i 24 timer ved de tilsvarende betingelser. Cellerne i kolben uden probe tjene som ubehandlet kontrol.
  3. NIRF billedbehandling og semi-kvantitativ analyse
    1. Efter 24 timers inkubation varighed, høste cellerne i kolberne ved vask celler 2 gange med Hanks bufrede saltopløsning (HBSS) og derefter skrabe celler i 500 pi HBSS og pellet ved centrifugering (5 minutter ved 200 xg) i 500 rør pi.
    2. Placer rørene med cellepelleterne (og HBSS) i en NIRF imager og billede ved hjælp af filtre til excitation (615-665 nm) og emission (skåret i> 700 nm).
    3. Fratræk autofluorescens og evaluere intensiteten af ​​mål versus autofluorescens overensstemmelse med producentens anvisninger. Dette vil give de semikvantitative niveauer af fluorescens intensitet som gennemsnit signal (skalerede tællinger / sek), som repræsenterer tæller niveau efter skalering for eksponeringstid, kamera gain, binning og bitdybde, så målingerne kan sammenlignes med hinanden.
  4. Konfokal mikroskopisk analyse
    1. Efter 24 timers inkubation, høste cellerne på kammerobjektglas ved vask 2 gange med 500 pi HBSS.
    2. Fastgør ceLLS med 200 pi HBSS indeholdende 3,7% (v / v) formaldehyd i 30 minutter ved stuetemperatur.
    3. Mens fiksering der foregår, fortyndes DNA pletten, Hoechst-33258 1:50 med monteringsløsning.
    4. Efter fiksering vaskes cellerne 2 gange med HBSS og derefter adskille kamrene fra objektglas. Der tilsættes 50 pi montering opløsning indeholdende DNA-plet på hver plet svarende til brøndene af kammeret glider. Dæk cellerne med dækglas, forsegle kanterne med gennemsigtig neglelak og lufttørre i 10 minutter ved stuetemperatur (mørk).
    5. Billede celler på en passende fluorescensmikroskop eller konfokalt mikroskop. Brug følgende excitation og emission indstillinger for visualisering af de tilsvarende komponenter: kerner (Hoechst-33258: excitation 405 nm, emission 420-480 nm). NBD-DOPE (liposomalt lipid: excitation 488 nm, emission 530 nm). DY-676-COOH (NIR fluorescerende farvestof: excitation 633-645 nm, emission 650-700 nm).
      BEMÆRK: Sørg for, at fluorescens mikroskop available er udstyret med egnede filtre, som tillader excitation og emission af bølgelængder større end 630 nm.

3. liposombaseret In Vivo Fluorescens Imaging for Inflammation

  1. Forberedelse af dyrene og materialer
    1. Hus 8-12 uger gamle NMRI mus, der vejede ca. 36 g under standardbetingelser med foder og vand ad libitum.
    2. Syv dage før starten af ​​eksperimenterne, giver alle mus en lav pheophorbid kost for at reducere væv autofluorescens.
    3. Fireogtyve timer før starten af hvert forsøg, barbere mus ved det ønskede område (f.eks hele ryggen, hvis der ønskes afbildning af bagben ødem).
    4. Dyrene vejes, og beregne mængden af ​​probe, der skal injiceres pr mus (Lip-Q og Lip-dQ 10 pmol (lipidkoncentration) per kg vægt og fri DY-676-COOH (svarende til farvning indholdet af Lip-Q anvendes) .
    5. Billede dyrene iet hele kroppen NIR Fluorescens billeddanner med de samme indstillinger, der anvendes til cellepellets. Denne måling giver autofluorescens af dyrene.
    6. Isotonisk saltopløsning opløses 10 mg zymosan-A i 1 ml, og opbevar natten over ved 4 ° C.
  2. Induktion af inflammation og in vivo NIRF billeddannelse
    1. Forbered 3 sprøjter pr mus indeholder følgende løsninger. Fyld en sprøjte med 50 pi zymosan-A opløsning (10 mg / ml), og den anden sprøjte med 50 pi isotonisk saltvandsopløsning. Fyld den tredje sprøjte med proberne, hvorved Lip-Q og Lip-dQ (10 pmol / kg vægt (lipid)), er udpeget til forsøgsdyr og gratis DY-676-COOH (koncentration som i Lip-Q) til kontroldyr. Sørg sonderne fortyndes med sterilt HBSS til 150 pi endeligt volumen.
    2. Påfør øjencreme på øjnene af dyr for at undgå tørhed og bedøver dyr med 2% isofluran indtil de er dybt i søvn og ikke reagerer ved berøring på poterne (Det tager ca. 2 min).
    3. Placer musen på en varm mat (stadig under bedøvelse) og injicere zymosan-En opløsning subkutant på højre bagben og saltopløsningen på venstre bagben. Injicer straks sonden intravenøst ​​og image dyret derefter så rekordtid af injektion / måling (t = 0 timer). Gem de resulterende billeder som billedet terninger og gentag ovenstående trin for alle andre dyr og respektive prober.
    4. Billede dyrene hver 2 time i 10 timer efter injektion, og derefter ved 24 timer efter injektion, og sørg for, at den fase af målekammeret er varm (for eksempel ved at placere en varm mat nedenunder), for at undgå hypotermi. Efter hver måling placere dyrene i et bur med foder og vand ad libitum og placere buret i et tempereret dyr kammer. Aflive dyrene ved første bedøve med 2% isofluran indtil dyrene ikke længere reagerer at røre ved, så aflive med kuldioxid i 5-10 min, hvilket gørsikker på, at dyrene stoppe vejrtrækningen helt og rigor mortis opstår.
    5. Dissekere mus overensstemmelse med standard protokoller, der kan vurderes online (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) og billede af organer.
    6. Evaluer måleresultaterne i henhold til producentens instruktioner ved først at trække den samlede fluorescens af dyrene (unmixing) og derefter tildele regioner af interesse for autofluorescens (venstre bagben med saltvand) og target fluorescens af betændte område (højre bagben med zymosan-A).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Indkapslingen af ​​høje koncentrationer af fluorescerende farvestoffer, såsom NIRF farvestof DY676-COOH anvendes her i det vandige indre af liposomer fører til et højt niveau af fluorescens quenching. Fluorescens quenching, et fænomen ses med mange fluoroforer i høj koncentration, kan udnyttes i flere in vivo-billeddannelse applikationer, hvor en høj følsomhed og pålidelig detektering af målområdet efterspørges. Anvendelsen af liposomer tilvejebringer også beskyttelse af farvestoffet, der er nødvendig til in vivo anvendelser. En grundig karakterisering af liposomer er nødvendig, og omfatter flere faktorer, såsom størrelsen af farvestof indkapslet, stabilitet og størrelsen af liposomer, fluorescens-quenching og aktiviteten af indkapslet farvestof in vitro og også anvendelighed til in vivo billeddannelse. En sammenligning af den frie farvestof, DY-676-COOH og standset liposomer (Lip-Q) samt en ikke-quenchet liposom (Lip-dQ) med meget lav concentration af det indkapslede farvestoffet er derfor afgørende, især til in vivo karakterisering.

Liposomer fremstillet ved anvendelse af filmen hydrering og ekstruderingsteknik med successive fryse og tø før ekstrudering indeholde resterende frie farvestofmolekyler som med held kan adskilles fra liposomerne på grund af deres længere opholdstid i gelfiltrering matrix, i forhold til de liposomer, som eluerer hurtigere ( Figur 1B). Afhængigt af fortynding efter gelfiltrering, et valgfrit ultracentrifugeringstrin muliggør koncentrationen af liposomer som vist (figur 1C). Baseret på absorptions- og emissions- egenskaber af det indkapslede farvestoffet, koncentrationen af indkapslet farvestof er bestemt ved hjælp af en kalibreringskurve af det frie farvestof (figur 1D). Udover koncentrationen af ​​den indkapslede farvestoffet, er det vigtigt at bestemme størrelsen og homogeniteten af ​​liposomer agtersteforberedelse er. Som det ses i figur 1E elektronmikrofotografier liposomer fremstillet ved den underliggende metode viser en hovedsagelig unilamellære morfologi af de liposomale vesikler indeholdende intravesikulær DY-676-COOH enten i quenching koncentrationsinterval (Lip-Q; 606-846 uM DY-676 ) eller i en koncentration ikke-quenchet farvestof (Lip-dQ; 25 uM DY-676). Endvidere afslører de en homogen størrelsesfordeling på ca. 120 nm og polydispersitet indekser langt under 1 (tabel 1). På grund fluorescensstandsning, Lip-Q viser to absorptionsmaksima i vandig puffer, hvorved en top er karakteriseret ved et skift mod det blå bølgelængder. I overensstemmelse med dette, fluorescensemissionen er meget lav sammenlignet med den frie farvestof (figur 2A og B, højre). Freeze-beskadigelse af liposomer resulterer i frigivelse af farvestof, som bliver fortyndet i den omgivende opløsning. Den blå-forskydes absorptionstop derfor disappears, hvilket resulterer i en enkelt absorptionstop af Lip-Q. Svarende til dette, er en stigning i fluorescensintensitet af fryse-beskadiget Lip-Q set, hvilket indikerer, at fluorescens aktivering af frigivne farvestofmolekyler fandt sted. Den gratis farvestof afslører kun en enkelt maksimal absorption og høj fluorescensintensitet som forbliver på samme niveau, uanset frysning (figur 2A og B, til venstre). Dette fund tyder på, at indkapsling af farvestoffet i liposomer, som i Lip-Q ville beskytte farvestoffet fra miljøet, bevarer høj koncentration og den tilhørende fluorescensundertrykkelse og hvis aktiveres af target udløser ville muliggøre påvisning på grund af stigning i fluorescens.

Liposomale prober med den underliggende lipid sammensætning afslører en fremherskende fagocytisk optagelse som hæmmes af energi udtynding. Dette kan ses via optagelsen af ​​Lip-Q fra den meget fagocytisk murine makrofag cellelinie J774A.1, ogmildt fagocytisk human glioblastoma cell line U-118 mg ved 37 ° C og inhibering ved 4 ° C (figur 3A og B). Den frie farvestof DY-676-COOH afslører optagelse i fagocytiske cellelinier både ved 37 ° C og ved 4 ° C, hvilket indikerer, at den liposomale probe Lip-Q ikke indeholder nogen resterende frie farvestof i opløsningen og kan kun undergå aktiv optagelse. Konfokale laser scanning mikroskopiske billeder yderligere underbygge optagelsen og aktiveringen af Lip-Q i fagocytceller (figur 3C). Manglen på fluorescens i den ikke-fagocytisk human fibrosarcoma cellelinje, HT-1080 viser endvidere, at optagelsen af ​​Lip-Q er overvejende ved fagocytose og ville således være egnede til billeddannelse af betændelse hvor fagocytiske monocytter / makrofager er involveret.

I overensstemmelse med den fagocytiske optagelse af liposomer ses i dyrkede cellelinier, og på grund af fluorescens quenching intravenøs injektion af Lip-Q fører til en tids-afhængig stigning i fluorescensintensitet af ødem i musemodeller (figur 4A, Lip-Q), med meget lav baggrundsfluorescens. Den maksimale fluorescensintensitet af ødem detekteres 8-10 timer efter injektion af Lip-Q. Modsat, relativt stærke NIR-fluorescens af hele mus ses efter anvendelse af den fri DY-676-COOH (figur 4A, DY-676-COOH) eller den altid på liposom Lip-dQ (figur 4A, Lip-dQ ). Sammenlignet med Lip-Q, hurtig perfusion og clearance af den frie DY-676-COOH set 0-4 timer efter injektion forstyrrer billedbehandling, således at pålidelig detektering af ødem er ikke muligt (figur 4A, DY-676-COOH ). Desuden er den ikke-quenchet liposom Lip-dQ afslører en maksimal fluorescens af ødem inden for 2-4 timer efter injektion, der forbliver næsten konstant indtil 8 timer og derefter gradvist aftager svarende til standset Lip-Q-baserede ødem fluorescens. Udførelse semikvantitative analyses, hvorved fastsættes regioner af interesse (ROIs) for ødem versus baggrunden, kan man lave konklusioner om de forskellige detektion med forskellige prober. Ifølge semi-kvantitativ analyse af 5 dyr per gruppe (probe) kan ødem være mere signifikant (P = 0,001) påvist med Lip-Q end med den frie DY-676-COOH eller ikke-quenchet, Lip-dQ (figur 4B).

Imaging organer af mus aflivet 24 timer efter injektion af prober afslører mild ex vivo fluorescens af leveren / galdeblæren og nyrerne og en meget lav eller ingen fluorescens i milt, lunger og hjerte (figur 5), der tjener som bevis for fjernelsen af proberne gennem hepatobiliære rute.

Figur 1
Figur 1: Fremstilling af DY-676-COOH-loaded liposoms. (AC) Skematisk oversigt over syntese trin involveret. (A) Opsætning af filmen hydrering og ekstrudering med nær-infrarødt farvestof DY-676-COOH. (B) Billede af self-made gelfiltrerings- setup viser interfasen mellem ikke-indkapslede (gratis) farvestof og liposomer. Liposomer elueres først og synes blå-grøn på grund af den indkapslede DY-676-COOH (blå) og den inkorporerede grønne phospholipid, NBD-DOPE. (C) repræsentativt billede af liposom-sediment (Lip-Q) efter koncentration ved ultracentrifugering. ( D) Repræsentant kalibreringskurve for DY-676-COOH i 10 mM Tris pH 7,4 (indeholdende 1% Triton X100), der anvendes til kvantificering af liposomal farvestof. (E) Cryo-transmission elektronmikrografi af Lip-Q. Klik her for at se en større version af figuren.


Figur 2:. Fysisk bestemmelse af fluorescens quenching og aktivering in vitro (A) Absorptionsspektra af Lip-Q (højre) og fri DY-676-COOH (venstre) målt i 10 mM Tris-buffer, pH 7,4, før eller efter frysning ved - 80 ° C. Bemærk den karakteristiske dobbelt top af Lip-Q i forhold til gratis DY-676-COOH og forsvinden af det blå-skiftet top efter fryse-skade af Lip-Q. (B) Tilsvarende fluorescensemissionsspektrer af Lip-Q (til højre) og fri DY-676-COOH (venstre) målt i 10 mM Tris-buffer pH 7,4 før eller efter nedfrysning ved -80 ° C.

Figur 3
Figur 3: celleoptagelse og fluorescens aktivering af læbe osomes. Billederne i (A) blev fremstillet ved NIR fluorescens billeddannelse af cellepellets efter eksponering til de tilsvarende prober i 24 timer ved de angivne temperaturer. HT-1080-celler ikke overleve de 24 timers inkubationsperioder ved 4 ° C. De bar diagrammer i (B) repræsenterer den semikvantitative niveauer af fluorescenssignaler fik ved at tildele ROI'er til cellepelleterne i A. Hver bar angiver den gennemsnitlige intensiteter af n = 3 forsøg ± SD. Billeder i (C) er erhvervet ved konfokal laserscanning mikroskopi af celler udsat for sonder på dyrkningskammeret slides i 24 timer ved 37 ° C. Bemærk det høje niveau af fluorescens i høj fagocytisk murine makrofag cellelinie J774A.1 og moderat fluorescens i mild fagocytisk human glioblastoma cell line U-118 mg. Den ikke-fagocytisk human fibrosarcoma cellelinie HT-1080 viser ingen fluorescens af proberne. NBD-DOPE: grønt fluorescerende phospholipid.load / 52136 / 52136fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af figuren.

Figur 4
Figur 4. In vivo optisk billeddannelse af zymosan-induceret ødem hos mus. (A) Musen billedet til venstre viser positionerne af subkutant anvendt zymosan-A (500 ug i 50 pi saltvand) og kontrol saltopløsning (50 pi) på venstre flanke. Intravenøs injektion af de angivne prober og hele kroppen NIR fluorescens billeddannelse ved de angivne tidspunkter afslører gradvis, men stor stigning i fluorescenssignaler af ødem og lav baggrund signaler af Lip-Q (øverste panel) med en maksimal fluorescens ved 8 timer efter injektion. Den frie farvestof afslører perfusion og hurtig clearance i 4 timer efter injektion (midterste rudel), mens Lip-dQ afslører påvisning af ødem med lave signalintensiteter og en generelt større baggrund fluorescens. Den grafiske præsentation i (B) gentage de observerede fluorescenssignaler af ødem detekteres med hver probe i sammenligning med kontrolgruppen region (saltvand) i n = 5 dyr per gruppe. Hvert plot repræsenterer den gennemsnitlige fluorescenssignaler af (n = 5) ± SEM. Med graferne, den maksimale fluorescenssignal af ødem påvist med hver probe er let at skelne (Lip-Q, 8 t; Lip-dQ 2-4 timer og gratis DY-676-COOH, 2 timer efter injektion). Der er en signifikant (P = 0,001) højere fluorescensintensitet af ødem med Lip-Q versus Lip-dQ ved t = 0-24 timer, og med Lip-Q versus gratis DY-676-COOH ved t = 4-24 timer. Klik her for at se en større udgave af figuren.

Figur 5 Figur 5: Bio-optiske ex vivo billeder af organer fra mus 24 timer efter probe ansøgning, og tilsvarende semi-kvantitativ analyse af fluorescensintensiteter af organer. Hver søjle repræsenterer middelværdien af fluorescensintensiteter (n = 4) ± SEM. Klik her for at se en større udgave af figuren.

Liposomformulering Størrelse [nm] Polydispersitetsindeks (PI) Zeta Potential [mV]
Lip-dQ (dequenched) 123,4 ± 0,6 0,055 ± 0,02 -10,6 ± 0,4
Lip-Q (standset) 118,5 ± 0,7 0,04 ± 0,02 -9 ± 2
Lip-NBD (w / o DY-676-COOH) 123,0 ± 1,4 0,04 ± 0,03 -11 ± 1

Tabel 1: Karakterisering af liposomer ved dynamisk lysspredning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Da liposomer også kan tjene som fremføringssystemer til fluorescerende farvestoffer, de gør det muligt billeddannelse af target sygdomme. Indkapslingen af ​​høje koncentrationer af fluorescerende farvestoffer, såsom NIRF farvestof DY676-COOH anvendes her, fører til et højt niveau af fluorescens quenching af den indesluttede farvestof. Fluorescens quenching, et fænomen ses med mange fluoroforer i høj koncentration kan udnyttes i flere in vivo imaging applikationer, hvor en høj følsomhed og pålidelig detektering af målområdet er krævet. Anvendelsen af liposomer tilvejebringer også beskyttelse af farvestoffet, der er nødvendig til in vivo anvendelser.

Filmen hydrering og ekstrudering teknik er en udbredt fremgangsmåde, som muliggør en vellykket fremstilling af liposomer med forskellige størrelsesområder afhængigt behov og tillader modifikationer såsom indkapsling af en lang række forskellige stoffer 25. Det er således egnet til fremstilling af læbenosomes indkapslet med NIR fluorescerende farvestof, DY-676-COOH til billeddiagnostiske formål. Fremgangsmåden giver liposomer med 600-840 uM intravesikulær farvestofkoncentrationer, der er inden for quenchet koncentration af farvestoffet. Den LiposoFast-Basic hånd ekstruder anvendes til homogenisering af spontant dannede vesikeldispersionen er egnet til liposompræparat i lille laboratorieskala, på grund af kompatibiliteten af ​​indretningen, med sprøjter op til 1 ml volumen. Anbefales For præparater i stor skala anvendelsen af ​​større højtrykshomogenisatorer som kan homogenisere vesikel dispersioner med en kapacitet på 1.000 L per time. Gelen filtrering (størrelsesudelukkelse) chromatografi er et afgørende skridt, der sikrer adskillelse af den indkapslede liposomale farvestof fra ikke-indkapslede (gratis) farvemolekyler 26. Længden af ​​gelfiltreringssøjlen er afgørende for effektiv adskillelse af liposomerne fra frit farvestof. Det er således nødvendigt at forberede en kolonne på 28 cm længde to held adskille liposomerne fra den frie DY-676-COOH anvendes her. Interessant, denne længde er to gange så længe der anvendes til at oprense carboxyfluorescein (CF) indlæst liposomer fra fri carboxyfluorescein. Den største ulempe ved gelfiltrering er en fem til seks gange fortynding af de oprensede prøver. Dette kan kompenseres ved ultracentrifugering, hvis stærkt koncentrerede liposomer er nødvendige. Under ultracentrifugering liposomerne sediment og supernatanten kan fjernes let 27. Andre måder at koncentrere liposomer, såsom ved dialyse 28 er mere tidskrævende end ultracentrifugering.

Udover filmen hydrering og ekstrudering metode med omvendt fase inddampning metode 23 samt ethanol injektion metode 24 aktivere liposompræparat med høj indkapslingseffektivitet for mange hydrofile stoffer. Men vores undersøgelser afslørede filmen hydrering kombineret med fryse og tø cykluss at være den mest egnede metode til en tilstrækkelig intraliposomal indkapsling af DY-676-COOH. Forøgelse udgangspunktet DY-676-COOH koncentration anvendes til film hydrering øger effektiviteten og koncentrationen af ​​intraliposomal farvestof, når en fast koncentration på 30 mM lipid anvendes. Trods denne indkapsling effekt med den fryse og tø metode er under 10% af den oprindelige farvestof anvendte koncentration, men dog er tilstrækkeligt til indkapsling af quenching koncentration, der kræves til billeddannelse. Endvidere kan den frie farvestof adskilt fra liposomer ved gelfiltrering genbruges ved afsaltning og dehydrering overensstemmelse med producentens anvisninger, hvilket re-indkapsling muligt og en samlet minimal farvestof tab. Indkapslingen af ​​farvestoffet af den underliggende protokol har ingen indflydelse på størrelsen og morfologien af ​​liposomer som set af polydispersiteten indekser og elektronmikrografi af Lip-Q.

Adskillige enkle metoder kan anvendes til at evaluate aktiviteten af forberedte fluorescerende liposomes.DY-676-COOH har en høj tendens til selv-dæmpningen ved høje koncentrationer 21,29 formentlig som følge af H-dimerdannelse og PI-stabling interaktioner mellem farvemolekyler. Disse interaktioner, som opstår på grund af nærhed af Forster radier farvestofmolekyler ved høje koncentrationer, kan blive tilintetgjort ved fortynding 30. Derfor er indkapsling af høje koncentrationer af DY-676-COOH ikke kun beskytte farvestoffet fra opsonisering in vivo, men også fra den omgivende buffer, og dermed bevare sin høje koncentration og fastholde fluorescensundertrykkelse som kan påvises som et blåt forskudt absorption peak og lav fluorescensemission som det ses i figur 2. Frysning liposomer gradvist ved -80 ° C fører til dannelse af iskrystaller i det vandige indre 31, som forårsager skade på liposomal membran når overilet optøet ved 30 ° C. Frigivelsen, fortynding og fluorescens aktirelse af intra-liposomal DY-676-COOH i buffer efter frysning er åbenbaret i en enkelt absorptionstop og næsten 2,5 gange stigning i fluorescensintensitet (figur 2), hvilket indikerer, at Lip-Q sequesters således en høj, afkølende koncentration af DY-676-COOH og er aktiverbar. Andre metoder til at beskadige liposomalt lipiddobbeltlag såsom anvendelse af detergent eller organiske opløsningsmidler afslører ikke klare forskelle mellem den frie farvestof og den liposomale indkapslet farvestof, da de begge påvirke de spektrale egenskaber af mange fluorescerende farvestoffer 32. Den langsomme nedfrysning og barske optøning metode rapporteres her derfor fungerer som en mere pålidelig og lovende metode til at validere den høje indkapsling af fluoroforer i liposomer og en deraf følgende fluorescensstandsning. Fra absorption og emission spektre af intakt Lip-Q (figur 2), kan en vis grad af residual fluorescens detekteres. Dette kan skyldes ikke-standset farvestof monomerer inden for lipoSomes og også fra elektrostatisk interaktion og indflydelse indkapslet farvestof ved phospholipid polære hovedgrupper 33.

Som det kan ses i figur 3, en tydelig akkumulering af Lip-Q i det stærkt fagocytisk murine makrofag og mild fagocytiske human glioblastoma cell line U-118 mg 34, men ikke i den ikke-fagocytisk human fibrosarcoma cellelinie HT-1080 angiver at Lip-Q- baseret billeddannelse af betændelse ville være gunstigt, eftersom fagocytter er de centrale aktører i inflammatoriske processer. Det faktum, at energi udtynding ophæver optagelsen af ​​Lip-Q, men ikke optagelse af det frie DY-676-COOH underbygger specificiteten af ​​fagocytisk optagelse af Lip-Q og afslører, at Lip-Q forbliver intakt under forsøget, ellers frigivelse af farvestof og energi-uafhængig optagelse ville finde sted, der fører til fluorescenspåvisning. Integrering af grønt fluorescerende phospholipid, NBD-DOPE i liposomdobbeltlaget muliggør mikroskopisk billeddannelse og discrimination mellem ikke-nedbrudt fra cellulære nedbrudte liposomer især hvis tidsafhængige optagelsesforsøg er færdig som rapporteret tidligere 32. De mikroskopiske billeder viser NIR-fluorescens af DY-676-COOH, som korrelerer med niveauet af fluorescensintensiteterne af cellepellets, som bestemt ved semi-kvantitativ analyse efter inkubation ved 37 ° C. I overensstemmelse med dette, murine makrofag cellelinier viser den højeste fluorescens, hvorimod den humane glioblastoma afslører lavere fluorescens både DY-676-COOH og NBD-DOPE end førstnævnte. Som forventet den humane fibrosarcom cellelinje, HT-1080 viser ingen fluorescens af enten liposomale farvestoffer eller den frie DY-676-COOH, der styrker den kendsgerning, at Lip-Q optagelse, er overvejende af fagocytose.

For at undersøge potentialet i Lip-Q-baserede fagocytose drevet in vivo billeddannelse af betændelse, blev adskillige kontroller i betragtning. I betragtning af at den frie DY-676-COOH kan tages op af phagocytOSIS kan opsonisering af Lip-Q udløse farvestoffet, som kan tages op af fagocytter. For at undgå dette, blev Lip-Q fremstillet med 5 mol% PEGylering. Desuden er det nødvendigt at skelne mellem optagelse på grund af betændelse-baserede EPR effekt og aktiv optagelse og fluorescens aktivering. For at løse dette, var det nødvendigt at vurdering og sammenligning af tre forskellige prober, nemlig altid-på, Lip-dQ, den standset Lip-Q og det frie DY-676-COOH i mus med zymosan-induceret ødem. Zymosan-A, som er fremstillet ud fra cellevæggene af Saccharomyces cerevisiae og Candida albicans er en naturlig stimulans af cytokinsekretion via Dectin-1 og toll-like-receptor 2/6 (TLR 2/6). Secernerede cytokiner gengæld fremkalde aktiveringen af downstream kaskader, der resulterer i vaskulære lækager og dermed lette intravasation / ekstravasation af monocytter / makrofager fra en milt reservoir 35 samt neutrofiler, og deres migration til inflammationssteder(Ødem) 36-39. Den zymosan-baserede monocytter / makrofager ekstravasation og migration proces skal kun 4,5-6 timer, der gør zymosan et strategisk redskab til at studere inflammatoriske processer 36-39. På grund af de vaskulære lækager, der resulterer i inflammation, intravenøst ​​injiceret prober kan enten optages af monocytter / makrofager (fagocytter) under deres migration til betændelse websted eller ekstravasatet og tages op i ødem stedet (EPR effekt) 40. Anvendelsen af ​​ikke-quenchet Lip-dQ afslører en samlet stærkere baggrund ødem signaler end Lip-Q og en fluorescens forøgelse af ødem, der afspejler migreringen af ​​monocytter og makrofager. I realiteten er den maksimale fluorescens af ødem set allerede 2-4 timer efter anvendelse af Lip-dQ og forbliver næsten konstant indtil 8 timer. Modsat Lip-dQ og Lip-Q, den frie DY-676-COOH undergår hurtig perfusion efter injektion, og er ryddet inden 4 timer, så tydelig billeddannelse af ødem er ikke mulig. Iterestingly anvendelsen af ​​Lip-Q resulterer i vedvarende stigning i fluorescensintensitet af ødem og meget lave baggrundssignaler. Denne vedvarende stigning i fluorescensintensiteter med læbe-Q tilskrives fluorescensaktivering af liposomalt frigivet farvestof. Tilsammen kan det konkluderes, at bidraget fra EPJ-effekt i Lip-Q baseret imaging er minimal, da Lip-dQ afslører en maksimal fluorescens (EPR effekt og monocyt migration) ved 4 timer efter injektion. Således liposomal indkapsling giver beskyttelse og særskilt levering af DY-676-COOH, hvilket igen muliggør en mere pålidelig in vivo billeddannelse af ødem, udelukkende efter internalisering og nedbrydning (fluorescens aktivering) af fagocytiske celler. Hidtil er anvendelsen af ​​zymosan-induceret bagben ødem at validere billeddannende egenskaber fluorescerende liposomer er ny. Protokollen rapporteret heri kan udvides både indkapsling af forskellige fluorescerende farvestoffer og afbilde effekten af ​​forskellige inhiberende drugs på induktion af inflammation, og udgør derfor et nyttigt redskab til forberedelse og karakterisering af prober egnet til biomedicinsk billeddannelse.

Et andet afgørende skridt i retning af at definere egnede imaging sonder er om kontrol med deres farmakologiske egenskaber og eliminering ruter. Fordelingen af ​​sonder i organer, der spiller afgørende roller i udskillelse, såsom lever og nyrer samt deres korte fastholdelse og passende elimination fra disse organer er normalt et tegn, at sonderne meget sandsynligt vil vise nogen skadelige virkninger på patienten. I overensstemmelse med denne, organer mus fremstillet 24 timer efter injektion af Lip-Q eller fri DY-676-COOH afslører kun mild fluorescens af leveren / galdeblæren og nyrerne, hvilket betyder en foretrukken eliminering af liposomale fluorofor gennem hepatobiliær vej. Den korte indkvartering af proberne i disse organer og deres effektive elimination er underbygget af en 7-fold højere fluorescenssignaler af organer fremstilles 6 timer efter injektion af Lip-Q eller fri DY-676-COOH 32. Disse observationer er i overensstemmelse med eliminering af liposomer 41 og bakker op betydningen af at medtage biodistributionsstudier ved karakterisering prober. Selvom der er rapporteret bivirkninger, såsom hudirritationer og supplere aktivering 42,43 for liposomformuleringer, der anvendes i kliniske anvendelser, blev disse virkninger ikke påvist med de underliggende liposomer. Desuden observation af immune deficiente mus i to uger efter probe injektion førte til fuldstændig clearance af proberne fra musene organer (ikke vist).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft tilskud HI-698 / 10-1 og RU-1652 / 1-1. Vi takker Doreen maj for fremragende teknisk bistand og selskabet DYOMICS GmbH, Jena for deres venlige støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials and equipments for preparation of liposomes
egg phospahtidylcholine Avanti Polar Lipids 840051P Dissolve in chloroform and store in glass vials (214 mg/ml)
cholesterol Sigma C8667 Dissolve in chloroform and store in glass vials (134 mg/ml)
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) Avanti Polar Lipids 880120P Dissolve in chloroform and store in glass vials (122 mg/ml)
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) Avanti Polar Lipids 810145P Dissolve in chloroform and store in glass vials (2 mg/ml)
Sartorius MC1 (d = 0.01 mg) Sartorius AG Research RC 210 P used for weighing the phospholipids
Rotavapor Büchi Labortechnik AG R-114 used for hydration of phospholipid film
Waterbath Büchi Labortechnik AG R-481 used for hydration of phospholipid film
Vacuum Controller Büchi Labortechnik AG B-720 used for hydration of phospholipid film
Vacobox Büchi Labortechnik AG B-177 used for hydration of phospholipid film
Circulation Chiller LAUDA DR. R. WOBSER
GMBH & CO. KG		 WKL 230 used for hydration of phospholipid film
DY-676-COOH Dyomics GmbH 676-00 Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C
Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan Applichem A1086 buffer 10 mM, pH 7.4
Trichlormethan Carl Roth GmbH + Co. KG Y015.2 used for liposome preparation
Sonicator Merck Eurolab GmbH USR 170 H used for liposome preparation
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00) Scientific Industries Inc. SI-0256 used for liposome preparation
Sephadex G25 medium  GE Healthcare Europe GmbH 17-0033-01 used for liposome purification
Triton X100 Ferak Berlin GmbH 505002 used to destruct liposomes  for dye quantification
LiposoFast-Basic Avestin Inc. used for the extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) VWR used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic
Fluostar Optima BMG Labtech used for dye quantification
Zetasizer Nano ZS Malvern used for the determination of liposome size and zetapotential
Ultracentrifuge  Beckmann Coulter GmbH XL 80 used for concentration of the samples
Rotor Beckmann Coulter GmbH SW 55 TI used for concentration of the samples
Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging
Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae Sigma Z4250-250MG used for induction of inflammation
Isotonic Saline (0.9%) Fresenius GmbH PZN-2159621 used for the dilution of Zymosan-A
Isoflurane vaporizer Ohmeda Isotec 4 used for anesthesizing animals
Isoflurane Actavis GmbH  PZN-7253744 anesthesia
Thermo Mat Pro 20 W Lucky Reptile 61202-HTP-20 used to keep animals warm during anesthesia
Omnican-F (1 ml injection)  Braun PZN-3115465 used for subcutaneous and intravenous application of probes
Panthenol eye cream Jenapharm PZN-3524531 used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia
Hanks buffered saline solution PAA Laboratories /Biochrom AG L2045 w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells
8-Well chamber slides BD Biosciences 354108 used for cell culture followed by microscopy 
Cell culture flasks Greiner BioOne
Cell culture media Gibco (life technologies GmbH)
Fetal calf serum  Invitrogen
Poly-L-Lysine solution (0.01%, 50 ml) Sigma P4832 used to coat cell culture chamber slides
Mountant Permafluor ThermoScientific  S21022-3 Mounting solution for microscopy
Hoechst-33258 AppliChem DNA stain for microscopy
Hera-Safe Heraeus Instruments sterile work bench used for cell culture
HERA cell Heraeus Instruments Incubator used for cell culture
LSM510-Meta Zeiss used for confocal microscopy
Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system CRi, Woburn used for whole body fluorescence imaging of small animals
Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV) GE Healthcare used for measurement of absorption
Spectrofluorometer (Jasco FP-6200) Jasco used for measurement of fluorescence emission
Animals
NMRI mice (8-12 weeks old, male) Elevage Janvier, France used for inflammation trials

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
  2. Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers). Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
  3. Cabanes, A., et al. Enhancement of antitumor activity of polyethylene glycol-coated liposomal doxorubicin with soluble and liposomal interleukin 2. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 5, 687-693 (1999).
  4. Gabizon, A., Shmeeda, H., Grenader, T. Pharmacological basis of pegylated liposomal doxorubicin: impact on cancer therapy. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 45, 388-398 (2012).
  5. Balasubramanian, S. V., Bruenn, J., Straubinger, R. M. Liposomes as formulation excipients for protein pharmaceuticals: a model protein study. Pharmaceutical research. 17, 344-350 (2000).
  6. Meyer, J., Whitcomb, L., Collins, D. Efficient encapsulation of proteins within liposomes for slow release in vivo. Biochemical and biophysical research communications. 199, 433-438 (1994).
  7. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et biophysica acta. 858, 161-168 (1986).
  8. Mayer, L. D., Bally, M. B., Hope, M. J., Cullis, P. R. Techniques for encapsulating bioactive agents into liposomes. Chemistry and physics of lipids. 40, 333-345 (1986).
  9. Walde, P., Ichikawa, S. Enzymes inside lipid vesicles: preparation, reactivity and applications. Biomolecular engineering. 18, 143-177 (2001).
  10. Weissleder, R., Ntziachristos, V. Shedding light onto live molecular targets. Nature medicine. 9, 123-128 (2003).
  11. Licha, K., Riefke, B., Ebert, B., Grotzinger, C. Cyanine dyes as contrast agents in biomedical optical imaging. Academic radiology. 9 Suppl 2, S320-S322 (2002).
  12. Pauli, J., et al. Novel fluorophores as building blocks for optical probes for in vivo near infrared fluorescence (NIRF) imaging. Journal of fluorescence. 20, 681-693 (2010).
  13. Holzer, W., et al. Photostability and thermal stability of indocyanine green. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 47, 155-164 (1998).
  14. Gandorfer, A., Haritoglou, C., Kampik, A. Retinal damage from indocyanine green in experimental macular surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 316-323 (2003).
  15. Saxena, V., Sadoqi, M., Shao, J. Degradation kinetics of indocyanine green in aqueous solution. Journal of pharmaceutical. 92, 2090-2097 (2003).
  16. Kodjikian, L., et al. Toxic effects of indocyanine green, infracyanine green, and trypan blue on the human retinal pigmented epithelium. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 243, 917-925 (2005).
  17. Sevick-Muraca, E. M., Houston, J. P., Gurfinkel, M. Fluorescence-enhanced, near infrared diagnostic imaging with contrast agents. Current opinion in chemical biology. 6, 642-650 (2002).
  18. Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
  19. Hilderbrand, S. A., Kelly, K. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Monofunctional near-infrared fluorochromes for imaging applications. Bioconjugate chemistry. 16, 1275-1281 (2005).
  20. Langhals, H., et al. Cyanine dyes as optical contrast agents for ophthalmological surgery. Journal of medicinal chemistry. 54, 3903-3925 (2011).
  21. Pauli, J., et al. An in vitro characterization study of new near infrared dyes for molecular imaging. European journal of medicinal chemistry. 44, 3496-3503 (2009).
  22. Ogawa, M., Kosaka, N., Choyke, P. L., Kobayashi, H. H-type dimer formation of fluorophores: a mechanism for activatable, in vivo optical molecular imaging. ACS chemical biology. 4, 535-546 (2009).
  23. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75, 4194-4198 (1978).
  24. Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et biophysica acta. 298, 1015-1019 (1973).
  25. Fahr, A., van Hoogevest, P., May, S., Bergstrand, N., ML, S. L. Transfer of lipophilic drugs between liposomal membranes and biological interfaces: consequences for drug delivery. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 26, 251-265 (2005).
  26. New, R. R. C. Liposomes a practical approach. , IRL Press at Oxford University Press. (1990).
  27. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16, 2806-2810 (1977).
  28. Schwendener, R. A. The preparation of large volumes of homogeneous, sterile liposomes containing various lipophilic cytostatic drugs by the use of a capillary dialyzer. Cancer drug delivery. 3, 123-129 (1986).
  29. Pauli, J., et al. Suitable labels for molecular imaging--influence of dye structure and hydrophilicity on the spectroscopic properties of IgG conjugates. Bioconjugate chemistry. 22, 1298-1308 (2011).
  30. Wu, P., Brand, L. Resonance energy transfer: methods and applications. Analytical biochemistry. 218, 1-13 (1994).
  31. Stark, B., Pabst, G., Prassl, R. Long-term stability of sterically stabilized liposomes by freezing and freeze-drying: Effects of cryoprotectants on structure. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 41, 546-555 (2010).
  32. Tansi, F. L., et al. Liposomal encapsulation of a near-infrared fluorophore enhances fluorescence quenching and reliable whole body optical imaging upon activation in vivo. Small. 9, 3659-3669 (2013).
  33. Chen, R. F., Knutson, J. R. Mechanism of fluorescence concentration quenching of carboxyfluorescein in liposomes: energy transfer to nonfluorescent dimers. Analytical biochemistry. 172, 61-77 (1988).
  34. Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC cell biology. 6, 14 (2005).
  35. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
  36. Erdo, F., Torok, K., Aranyi, P., Szekely, J. I. A new assay for antiphlogistic activity: zymosan-induced mouse ear inflammation. Agents and actions. 39, 137-142 (1993).
  37. Ajuebor, M. N., et al. Endogenous monocyte chemoattractant protein-1 recruits monocytes in the zymosan peritonitis model. Journal of leukocyte biology. 63, 108-116 (1998).
  38. Ajuebor, M. N., Das, A. M., Virag, L., Szabo, C., Perretti, M. Regulation of macrophage inflammatory protein-1 alpha expression and function by endogenous interleukin-10 in a model of acute inflammation. Biochemical and biophysical research communications. 255, 279-282 (1999).
  39. Ajuebor, M. N., et al. Role of resident peritoneal macrophages and mast cells in chemokine production and neutrophil migration in acute inflammation: evidence for an inhibitory loop involving endogenous IL-10. J Immunol. 162, 1685-1691 (1999).
  40. Binstadt, B. A., et al. Particularities of the vasculature can promote the organ specificity of autoimmune attack. Nature. 7, 284-292 (2006).
  41. Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience reports. 22, 197-224 (2002).
  42. Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Understanding the correlation between in vitro and in vivo immunotoxicity tests for nanomedicines. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 172, 456-466 (2013).
  43. Szebeni, J., et al. Prevention of infusion reactions to PEGylated liposomal doxorubicin via tachyphylaxis induction by placebo vesicles: a porcine model. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 160, 382-387 (2012).

Tags

Bioengineering Drug-levering liposomer Fluorochromer Fluorescens-quenching Optisk billeddannelse Inflammation
Fluorescens-quenching af et liposomalt indkapslet Near-infrarøde fluorofor som et værktøj til<em&gt; In Vivo</em&gt; Optisk Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tansi, F. L., Rüger, R.,… More

Tansi, F. L., Rüger, R., Rabenhold, M., Steiniger, F., Fahr, A., Hilger, I. Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging. J. Vis. Exp. (95), e52136, doi:10.3791/52136 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter