Introduction
Liposomer har undersökts intensivt och fungera som en av de mest biokompatibla biomedicinska läkemedelstillförselsystem för kliniska tillämpningar 1,2. De är i huvudsak består av fosfolipider och kolesterol, som båda är biokompatibla föreningar härma delar av naturliga cellmembran. Med beaktande av följande hydrofila substanser kan inneslutas i det vattenhaltiga inre, kan lipofila medel införlivas i den liposomala fosfolipid tvåskiktsmembran 3. Inkapsling av substanser i det vattenhaltiga inre av liposomer ger skydd mot nedbrytning in vivo och även förhindrar värdsystemet från toxiska effekter av cytotoxiska läkemedel som används för terapi av sjukdomar, t ex kemoterapeutiska medel som syftar till att förstöra tumörceller. Modifieringen av liposomytan med polymerer som polyetylenglykol (PEGylering) ytterligare utökar liposomalt blodcirkulationen tiden in vivo på grund av steriska stabilisering 4. Moreover, liposomer kan binda höga koncentrationer av flera ämnen som proteiner 5,6, hydrofila substanser 7,8 och enzymer 9. De tjänar därför som tillförlitliga kliniska terapeutiska och diagnostiska verktyg som förtjänar deras godkännande för leverans av cytotoxiska läkemedel såsom doxorubicin för cancerbehandling 4. På grund av sin flexibilitet, kan liposomer även laddas med fluorokromer för diagnostiska och bildstyrd kirurgiska ändamål.
Fluorescens avbildning ger en kostnadseffektiv och icke-invasiv in vivo diagnostiskt verktyg som dock kräver vissa grundläggande krav. Det kunde visas att fluorokromer som passar bäst för in vivo-avbildning har karakteristiska absorption och emissionsmaxima i intervallet där ljus Kringspriddhet liksom vävnads autofluorescens som härrör från vatten och hemoglobin är låg. Således sådana prober har sin abs / em maxima mellan 650 och 900 nm 10. Förutom detta är stabiliteten i fluorokromer både in vitro och in vivo kritisk, eftersom opsonisering och snabb clearance i hög grad kan begränsa sin ansökan om in vivo imaging 11. Andra effekter såsom dålig stabilitet och låg känslighet eller cytotoxiska effekter på målorgan som ses med indocyaningrönt (ICG) 12-16, är oönskat och måste tas i beaktande vid utformningen av sönder för in vivo-avbildning. Dessa observationer har lett till en aktiv utveckling av flera prekliniska NIR fluorokromer, nanopartiklar samt nya tekniker för avbildning av inflammatoriska processer, cancer in vivo och för bildstyrd kirurgi 17-20. Trots stabiliteten i de flesta preklinisk NIRF (nära infraröd fluorescens) färgämnen in vitro, deras snabba perfusion och clearance genom levern och njurarna hindrar deras användning i optisk avbildning av sjukdomar och inflammatoriska processer in vivo.
ntent "> Vi presenterar därför ett protokoll för inkapsling av fluorokromer såsom väl karakteriserade nära infraröda fluorescerande färgämne DY-676-COOH, känd för sin tendens att själv utsläckning vid relativt höga koncentrationer 21 i liposomer. Vid höga koncentrationer H- dimerbildning och / eller pi-stapling interaktioner mellan fluoroforen molekyler belägna inom varandras Förster radie resultat i Förster resonansenergiöverföring (FRET) mellan fluorokromen molekyler. Vid låg koncentration utrymmet mellan fluoroforen molekyler ökar, vilket därigenom förhindrar pi-stapling interaktion och H-dimer bildning och resulterar i utsläpp hög fluorescens. Övergången mellan hög och låg koncentration och den medföljande fluorescensutsläckning och aktivering är en lovande strategi som kan utnyttjas för optisk avbildning 22. I detta avseende inkapsling av höga koncentrationer av NIRF färgämnet DY-676-COOH i vatten inre av liposomer är fler favorable för in vivo-avbildning än fritt färgämne. Utmaningen i metoden ligger först och främst i rätt inkapsling och för det andra, i valideringen av de fördelar som följer av att kapsla höga koncentrationer av färgämnet. Vid jämförelse av avbildningsegenskaperna hos kylda liposomer med den hos fritt färgämne och även med en icke-släcktes liposomformulering med låga koncentrationer av färgämnet är oumbärlig. Vi visar med en enkel, men mycket effektiv film hydrering och extrudering protokoll kombineras med alternativa frysa och upptiningscykler som inkapsling av släck koncentrationer av DY-676-COOH i liposomer är genomförbart. Andra metoder som används för att framställa liposomer, såsom omvänd fas avdunstningsmetod 23 liksom etanolinjektionsmetoden 24 möjliggöra liposomberedning med höga inkapslingseffektiviteter för många hydrofila substanser. Emellertid, beskaffenheten av den substans som skall inkapslas kan påverka inkapslingseffektiviteten. I själva verketfilm hydrering och extrudering Protokollet presenteras här avslöjade den högsta effektiviteten för inkapsling av DY-676-COOH. För att illustrera fördelarna med liposomal inkapsling av DY-676-COOH, en zymosan-inducerad ödem modell, som medger undersökning av inflammatoriska processer inom några timmar, användes. Här visas det att liposomer med höga koncentrationer av det inkapslade DY-676-COOH är mer lämpade för hela kroppen in vivo optisk avbildning av inflammatoriska processer än den fria färgämnet eller den icke-släcktes liposomal formulering med låga färgämneskoncentrationer. Således det underliggande protokollet ger en enkel och snabb metod för att producera kylda fluorescerande liposomer och validering av deras aktivering och bildbehandling potential både in vitro och in vivo.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla Förfarandena har godkänts av den regionala djurkommittén och i enlighet med internationella riktlinjer för etisk användning av djur.
1. Beredning av material och instrument
- Framställning av spontant bildade vesikeldispersionen (SFV)
- Lös upp och bereda stamlösningar av följande fosfolipider: 214 mg / ml äggfosfatidylkolin (EPC), 134 mg / ml kolesterol, 122 mg / ml 1,2-distearoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - [metoxi (polyeten glykol) -2000] (ammoniumsalt) (mPEG 2000 -DSPE) och 2 mg / ml 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - (7-nitro-2-1,3-bensoxadiazol-4 yl) (ammoniumsalt) (NBF-DOPE) i kloroform och förvara i glasflaskor.
- Möblera cirka 3 ml kloroform i en rundbottnad kolv och överföra den lämpliga volymen av fosfolipid stamlösning i den rundbottnade kolven för att framställa liposomer sammansatta av EPC: Chol: mPEG 2000 -DSPE vid ett molförhållande av 6,5: 3: 0,5. För dubbel fluorescens märkning av liposomer lägga 0,3 mol% NBD-DOPE till lipidlösningen.
- Indunsta kloroformen från den organiska fosfolipid lösningen under reducerat tryck (300 mbar) vid 55 ° C med användning av en rotationsindunstare.
- Efter en homogen fosfolipid film bildas, minska trycket till 10 mbar under 1-2 h för att avlägsna kvarvarande kloroform insättning.
- Medan kloroform avdunstar, upplösa DY-676-COOH (6,181 M) i 10 mM Tris-buffert pH 7,4 och fylla en Dewar kärl med flytande kväve. Slå på ett ultraljudsbad och inställd på 50 ° C.
- Överför en lämplig volym (0,5-1 ml) av DY-676-COOH (6,181 M) lösning på rundkolven att återfukta den torra fosfolipidfilm och skaka kraftigt tills en spontant bildade vesikel (SFV) spridningsformer. Se till att alla fosfolipider sprids för att undvika fettförlust.
- Noggrant transfer den rundkolv innehållande SFV dispersionen i flytande kväve och frysa dispersionen i 3-5 min. Placera rundkolven i ett ultraljudsbad vid 50 ° C för att tina dispersionen sedan virvel dispersionen kraftigt i 1-2 minuter. Upprepa denna procedur sex gånger, vilket ger totalt sju frysa och upptiningscykler.
- Extrudering av sFv att bilda homogena liposomvesiklar
- Överför SFV dispersionen i en 1 ml spruta (spruta-a) och extrudera dispersionen genom en 100 nm polykarbonatmembran med användning av en LiposoFast-Basic extrudern i sprutan-b.
- Extrudera spridning från sprutan-b, tillbaka i sprutan-a, sedan upprepa cykeln tio gånger. På grund av extrudering, lösningen i sprutan ändras från ett dimmigt utseende till en klar dispersion med tiden. Efter tio cykler (tjugo enkla extrudering steg) ta bort sprutan-b från enheten och extrudera dispersionen för sista gången från sprut en direkt i en steril1,5 ml reaktionsrör.
- Rening av liposomalt inkapslad DY-676-COOH gratis färgämne
- Bered en gel kromatografi kolonn med användning av G25 pärlor indränkt i 10 mM Tris-buffert pH 7,4 (kolonnlängd 28 cm, diameter 0,8 cm).
- Överför 0,5 ml av extruderad vesikeldispersionen på gelén säng och låt prov avloppet i gelmatrisen.
- Eluera liposomerna med 10 mM Tris-buffert pH 7,4 (Figur 1A) och tvätta kolonnen till dess de fria färgämnes avloppet helt ur kolonnen. Om så behövs, samla in och återvinna det fria färgämnet genom avsaltning och uttorkning enligt tillverkarens anvisningar.
- Koncentrera de eluerade liposomer genom ultracentrifuge (200.000 xg, 2 timmar vid 8 ° C) sedan sprida ut dem i tillräcklig volym sterilt 10 mM Tris-buffert pH 7,4.
- Kvantifiering av inkapslat DY-676-COOH koncentration
- Bered en kalibreringskurva genom att lösa DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 nM) i 10 mM Tris-buffert, pH 7,4 innehållande 0,1% Triton X100.
- Lös 2 il (100 nmol slutlig lipid av en 50 mmol / l lager) av liposomerna för 5 min vid rumstemperatur i 100 | il Tris-buffert innehållande 1% Triton X 100 för att förstöra vesiklarna och frigör det inkapslade färgämnet. Späd därefter prover med 10 mM Tris-buffert, pH 7,4 till en slutlig Triton-X100 koncentration av 0,1% (volym / volym) vilket gör en total volym av 1 ml. Förbered alla prover i två exemplar.
- Mät absorption och emission av alla prover (gratis DY-676-COOH och Triton-X100 behandlade liposomer) exciterings λ = 645 nm och en emissions λ = 700 nm. Etablera och använda en kalibreringskurva för den fria färgämne för att bestämma koncentrationen av inkapslat färgämne.
- Liposom karakterisering
- Bestäm storlekar och zeta-potentialen av liposomer genom dynamisk ljusspridning. Späd de liposomala proverna med filtersteriliserat (0,2 ^ m) 10 mM Tris-buffert pH 7,4 till aconcentration av 100-300 pM (lipid). Överför de utspädda proven till en låg volym engångskyvett och mäta provet enligt tillverkarens instruktioner.
- Karakterisera liposomer med elektronmikroskopi att styrka storleken, integritet och homogenitet liposomala vesiklar enligt standardprotokoll.
2. Validering av fluorescens-släckning och Aktivering av Beredda liposomer
- Fysikalisk analys av fluorescenssläckning och aktivering
- Förbered två 1,5 ml rör för Lip-Q och 2 rör för den fria DY-676-COOH. Överför 100 nmol totala lipider (2,38 | il av en 42 mmol / l Lip-Q förrådslösning, innehållande 138 | ig / ml av den inkapslade DY-676-COOH) till motsvarande rör. Transfer gratis DY-676-COOH motsvarar innehållet färgämnet i Lip-Q (0,38 mikrogram, vilket resulterar till exempel från 138 mikrogram / 1000 pl x 2,38 l Lip-Q används). Inkubera en tube hos varje prob vid 4 ° C och frysa det andra röret vid -80 ° C över natten (16 h).
- Värm upp en uppvärmningsblock till 30 ° C. Fyll en kylbox med krossad is och jämvikta en alikvot av 10 mM Tris-buffert, pH 7,4 till rumstemperatur.
- Ta bort sonder från 4 ° C och utjämna till rumstemperatur (insvept i aluminiumfolie för att skydda mot ljus) och snabbt tina sonder från -80 ° C vid 30 ° C i 5 min. Chill de upptinade sonder på is under 1 min innan du överför dem till rumstemperatur (även insvept i aluminiumfolie för att skydda mot ljus).
- Lägg 10 mM Tris-buffert (pH 7,4) till var och en av proberna till 100 ul slutvolym och jämvikta alla prober vid RT under 10 min.
- Pipett 80 pl av varje prob till en låg volym glaskuvett och mäta absorptionen av varje prob 400-900 nm på en spektrometer. Tillbaka sonden till deras motsvarande rör.
- Överför 80 ìl av varje prob i en lämplig glaskuvettoch mäta fluorescens emission på en spektrofluorometer med spännande sonderna vid 674 nm och mäta fluorescensen 694-800 nm.
- Cellulärt upptag och fluorescens aktivering
- Få och kultur följande cellinjer i deras motsvarande odlingsmedia enligt standardbetingelser (37 ° C, 5% CO 2 och 95% fuktad atmosfär). Här använder murin makrofagcellinje J774A.1 (Dulbeccos modifierade Eagles medium kompletterat med 10% (vol / vol) fetalt kalvserum), den humana glioblastom-cellinje, U-118 mg (MEM innehållande essentiella vitaminer och 10% (v / v) fetalt kalvserum) och den humana fibrosarkom-cellinjen, HT-1080 (RPMI med 5% FCS).
- Coat 8-brunnars kammarobjektglasen med poly-L-lysin (lägg 100 | il 0,001% poly-L-lysin till varje brunn och inkubera vid 37 ° C under 10 min. Aspirera lösningen och låter kammarobjektglasen torka upp i minst fyra h vid RT på en steril arbetsbänk. Skölj kammare diabilder 3gånger med 200 pl Hanks saltlösning försegla dem sedan med paraffin och aluminiumfolie och förvara vid 4 ° C tills det behövs.
- Medan kammaren glasen sinar, filter-sterilisera liposomerna och färgämneslösning och förvara vid 4 ° C tills det behövs.
- För sondupptagningsanalys med hela kroppen in vivo NIR fluorescens bildsystem, förbereda 5 små odlingsflaskor för varje 3 prov cellinjer (15 kolvar totalt). Seed 2 x 10 6 J774A.1, U-118 mg och HT-1080 celler per odlingskolv med 5 ml av respektive odlingsmedium (i quintuples) och växa i 16-24 timmar. Parallellt med de odlingsflaskor, utsäde 30.000 celler av varje cellinje (J774A.1 och HT-1080) eller 20.000 celler (U-118 mg) till 2 brunnar i kammaren slide respektive och växa i 500 l odlingsmedium för 16-24 tim .
- Nästa dag, tillsätt 100 nmol (slutlig lipid belopp) av Lip-Q till 2 flaskor per cellinje och till en brunn i varje cellinje på kammar slide.Överför omedelbart en kolv per cellinje till 4 ° C och den andra kolven tillbaka till inkubatorn.
OBSERVERA: Volymen av proberna till kolvarna och de kammare diabilder är desamma, vilket gör koncentrationen på kammarobjektglas 10-faldigt högre (5 ml är till 500 pl odlingsmedium). Detta är nödvändigt eftersom mikroskopisk detektion är mindre känslig än NIR fluorescens avbildningssystemet där cellpelletar från kolvarna avbildas. - Lägg den fria DY-676-COOH vid en koncentration som motsvarar innehållet färgämnet i Lip-Q till cellerna i 2 flaskor per cellinje och till en brunn i varje cellinje på kammar slide, sedan omedelbart överföra 1 kolv per cellinje till 4 ° C (energibrist) och den andra kolven tillsammans med kammaren sliden tillbaka till inkubatorn. Inkubera alla celler under 24 h vid motsvarande förhållanden. Cellerna i kolven utan sond tjänar som obehandlad kontroll.
- NIRF imaging och semi-kvantitativ analys
- Efter 24 timmars inkubation varaktighet, skörda cellerna i kolvarna genom tvättning celler två gånger med Hanks buffrade saltlösning (HBSS) sedan skrapa celler i 500 | il HBSS och pellet genom centrifugering (5 min vid 200 xg) i 500 | il rör.
- Placera rören med cell pellets (och HBSS) i en NIRF imager och bild med hjälp av filter för excitation (615-665 nm) och emission (sänkning> 700 nm).
- Dra autofluorescens och utvärdera intensiteten i målet kontra autofluorescens enligt tillverkarens anvisningar. Detta kommer att ge de halv kvantitativa nivåer av fluorescensintensitet som genomsnittlig signal (skalade räkningar / sek), som representerar räkna nivåer efter skalning för exponeringstid, kamera vinst, binning och bitdjup, så att mätningarna är jämförbara med varandra.
- Konfokal mikroskopisk analys
- Efter 24 timmars inkubation, skörda cellerna på kammar diabilder genom att tvätta två gånger med 500 l HBSS.
- Fäst cells med 200 | il HBSS innehållande 3,7% (volym / volym) formaldehyd under 30 min vid RT.
- Medan fixering pågår, späd DNA fläcken, Hoechst-33258 01:50 med monteringslösning.
- Efter fixering, tvätta cellerna 2 gånger med HBSS sedan separera kamrarna från glas. Lägg 50 pl monterings lösning innehållande DNA-fläck på varje fläck som motsvarar brunnarna i kammare diabilder. Täck cellerna med täckglas, försegla kanterna med transparent nagellack och lufttorka i 10 min vid RT (mörkret).
- Bild celler på en lämplig fluorescensmikroskop eller konfokalmikroskop. Använd följande excitation och emissionsinställningar för visualisering av motsvarande komponenter: kärnor (Hoechst-33258: excitation 405 nm, emission 420-480 nm). NBD-DOPE (liposomal lipid: excitation 488 nm, emission 530 nm). DY-676-COOH (NIR fluorescerande färgämne: excitation 633-645 nm, emission 650-700 nm).
OBS: Se till att fluorescensmikroskop aillgängliga är försedd med lämpliga filter som tillåter excitation och emission av våglängder högre än 630 nm.
3. Liposom Baserade In Vivo Fluorescens avbildning av inflammation
- Förberedelse av djur och material
- Hus 8-12 veckor gamla manliga NMRI möss vägde ca 36 g under standardförhållanden med mat och vatten efter behag.
- Sju dagar före starten av experiment, ge alla möss en låg feoforbid diet för att minska vävnads autofluorescens.
- Tjugofyra timmar före starten av varje experiment, raka möss vid önskat område (t.ex. hela ryggen område om avbildning av bakbenet ödem önskas).
- Väg djuren och beräkna mängden sond som ska injiceras per mus (Lip-Q och Lip-dQ vid 10 imol (lipidkoncentrationen) per kg vikt och fri DY-676-COOH (motsvarande färga innehållet i Lip-Q används) .
- Bild djuren ien hel kropp NIR fluorescens imager med samma inställningar som används för cellpellets. Denna mätning ger autofluorescens av djuren.
- Lös 10 mg zymosan-A i 1 ml isoton koksaltlösning och förvaras över natten vid 4 ° C.
- Induktion av inflammation och in vivo NIRF imaging
- Förbered 3 sprutor per mus innehåller följande lösningar. Fyll en spruta med 50 pl zymosan-En lösning (10 mg / ml) och den andra sprutan med 50 | il isoton saltlösning. Fyll den tredje sprutan med sonder, vari Lip-Q och Lip-dQ (10 mikromol / kg vikt (lipid)) är avsedda för försöksdjur och gratis DY-676-COOH (koncentration som i Lip-Q) för kontrolldjur. Se till sonderna späds med steril HBSS till 150 pl slutlig volym.
- Applicera ögonkräm på ögonen på djuren för att undvika torrhet och söva djuren med 2% isofluran tills de är djupt sover och inte reagerar vid beröring på tassarna (detta tar ca 2 min).
- Placera musen på en varm matta (fortfarande under narkos) och injicera zymosan-A-lösningen subkutant på höger bakben och saltlösning på vänster bakben. Omedelbart injicera sonden intravenöst och därefter bild djuret sedan rekordtiden injektion / mätning (som t = 0 h). Rädda de resulterande bilderna som bild kuber och upprepa stegen ovan för alla andra djur och respektive sönder.
- Bildens djuren varje 2 h under 10 h efter injektion och sedan vid 24 h efter injektion, och se till att det skede av mätkammaren är varm (t.ex. genom att placera en varm matta på undersidan), för att undvika hypotermi. Efter varje mätning, placera djuren i en bur med mat och vatten efter behag och placera buren i en tempererad djurkammare. Euthanize djuren genom att först anesthetizing med 2% isofluran tills djuren inte längre reagerar på beröring, sedan avliva med koldioxid under 5-10 min, vilket görSe till att djuren sluta andas helt och rigor mortis inträffar.
- Dissekera mössen enligt standardprotokoll som kan utvärderas på nätet (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) och bild organen.
- Utvärdera mätresultaten enligt tillverkarens instruktioner genom att först dra den totala fluorescens av djuren (unmixing) sedan tilldela regioner av intresse för autofluorescens (vänster bakben med saltlösning) och målet fluorescens av inflammerade området (höger bakben med zymosan-A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inkapslingen av höga koncentrationer av fluorescerande färgämnen såsom NIRF färgämnet DY676-COOH används här i det vattenhaltiga inre av liposomer leder till en hög grad av fluorescenssläckning. Fluorescensutsläckning, ett fenomen som ses med många fluoroforer vid hög koncentration, kan utnyttjas i flera in vivo imaging applikationer där en hög känslighet och pålitlig detektering av målområdet frågas. Användningen av liposomer ger också skydd av färgämnet som är nödvändig för in vivo applikationer. En grundlig karakterisering av liposomerna är nödvändigt och innefattar flera faktorer såsom nivån av färgämne inkapslat, stabilitet och liposomernas storlek, fluorescensutsläckning och aktivitet av inkapslat färgämne in vitro och även tillämpbarhet för in vivo avbildningsändamål. En jämförelse av den fria färgämnet, DY-676-COOH och kylda liposomer (Lip-Q) samt en icke-kylda liposomer (Lip-dQ) med mycket låg concentranson av den inkapslade färgämnet är därför kritisk särskilt för in vivo karakteriseringar.
Liposomer framställda med användning av filmen hydrering och strängsprutningsteknik med successiv frysa och upptiningscykler innan extrudering innehålla kvarvarande fria färgämnesmolekyler som framgångsrikt kan separeras från liposomerna på grund av deras längre retention i gelfiltrering matris, jämfört med liposomerna som eluerar snabbare ( Figur 1B). Beroende på graden av utspädning efter gelfiltrering, möjliggör ett valfritt ultracentrifuge steg koncentrationen av liposomerna såsom illustreras (Figur 1C). Baserat på absorptions- och emissionsegenskaperna hos den inkapslade färgämnet, är koncentrationen av inkapslat färgämne bestämda med hjälp av en kalibreringskurva för fritt färgämne (figur 1D). Förutom koncentrationen av den inkapslade färgämnet, är det viktigt att bestämma storlek och homogenitet liposomer akterutförberedelse er. Som ses i figur 1E, elektronmikrofotografier av liposomer framställda med den underliggande metoden avslöjar en mestadels unilamellär morfologi av de liposomala vesiklarna, innehållande intravesikulär DY-676-COOH antingen inom härdningskoncentrationsområde (Lip-Q; 606-846 pM DY-676 ) eller färgämneskoncentration ej kylda (Lip-dQ, 25 ^ M DY-676). Vidare avslöjar de en homogen storleksfördelning av ca 120 nm och polydispersitet indexen långt under 1 (tabell 1). På grund av fluorescensquenchning, visar Lip-Q två absorptionsmaxima i vattenbuffert, varvid en topp karakteriseras av en förskjutning mot de blå våglängder. I linje med detta, är fluorescensemissionen mycket låg jämfört med den fritt färgämne (Figur 2A och B, höger). Fryst skada av liposomer resulterar i frisättning av färgämnet, vilket blir utspädd i den omgivande lösningen. Den blå-skiftat absorptionstopp därför disappears, vilket resulterar i en enda absorptionstopp Lip-Q. I enlighet med detta är en ökning av fluorescensintensiteten hos fryst skadade Lip-Q sett, vilket indikerar att fluorescens aktivering av frisatta färgämnesmolekyler har ägt rum. Den fria färgämnet avslöjar bara en enda maximal absorption och hög fluorescensintensitet som ligger kvar på samma nivå, oavsett frysning (Figur 2A och B, vänster). Detta fynd tyder på att inkapsling av färgämnet i liposomer, som i Lip-Q skulle skydda färgen från omgivningen, bibehåller hög koncentration och tillhörande fluorescensutsläckning och om aktiveras av målgrupp triggers skulle göra det möjligt att upptäcka på grund av ökad fluorescens.
Liposomala sonder med den underliggande lipidkompositionen avslöjar en övervägande fagocytisk upptagning som hämmas av energibrist. Detta kan ses via upptag av Lip-Q med den mycket fagocytiska murina makrofagcellinje J774A.1, ochmilt fagocytisk human glioblastomcellinje U-118 mg vid 37 ° C och hämning vid 4 ° C (figur 3A och B). Den fritt färgämne DY-676-COOH avslöjar upptag i de fagocytiska cellinjer både vid 37 ° C och vid 4 ° C, vilket indikerar att den liposomala sond Lip-Q innehåller någon återstående fritt färgämne i lösningen och kan endast genomgå aktivt upptag. Konfokala laserskanning mikroskopiska bilder bygga ytterligare upptag och aktivering av Lip-Q i fagocyterande celler (Figur 3C). Vidare hindrar bristen av fluorescens i den icke-fagocytiska humana fibrosarkom-cellinje, indikerar HT-1080 att upptaget av Lip-Q är övervägande genom fagocytos och således skulle vara lämpliga för avbildning av inflammation där fagocytiska monocyter / makrofager är inblandade.
I överensstämmelse med den fagocytiska upptag av liposomer som ses i odlade cellinjer, och på grund av fluorescenssläck intravenös injektion av Lip-Q leder till en tids-beroende ökning av fluorescensintensitet av ödem i musmodeller (figur 4A, Lip-Q), med mycket låg bakgrundsfluorescens. Den maximala fluorescensintensitet ödem upptäcks 8-10 timmar efter injektion av Lip-Q. I motsatts relativt stark NIR-fluorescens av hela musen ses efter applicering av den fria DY-676-COOH (Figur 4A, DY-676-COOH) eller alltid-på liposomer, Lip-dQ (Figur 4A, Lip-dQ ). Jämfört med Lip-Q, snabb perfusion och clearance av den fria DY-676-COOH som sett 0-4 h efter injektion, stör avbildning, så att tillförlitlig detektering av ödem inte är möjligt (figur 4A, DY-676-COOH ). Vidare, den icke-släcktes liposom, Lip-dQ avslöjar en maximal fluorescens av ödem inom 2-4 h efter injektion, som förblir nästan konstant fram till 8 h, sedan gradvis minskar liknar den släcktes Lip-Q-baserade ödem fluorescens. Utföra semikvantitativ analyses, vari regioner av intresse (ROI) är inställda för ödem kontra bakgrunden, kan man dra slutsatser om de olika nivåerna av detektion med olika sonder. Enligt semikvantitativ analys av fem djur per grupp (sond), kan ödem vara mer påtagligt (P = 0,001) detekteras med Lip-Q än med den fria DY-676-COOH eller ej kylda, Lip-dQ (Figur 4B).
Imaging organ hos möss avlivades 24 h efter injektion av prober avslöjar milda ex vivo fluorescens av lever / gallblåsa och njurar och en mycket låg eller ingen fluorescens av mjälte, lungor och hjärta (figur 5), som tjänar som bevis för eliminering av prob genom hepatobiliära vägen.
Figur 1: Beredning av DY-676-COOH belastad liposomers. (AC) Schematisk översikt över syntessteg inblandade. (A) Inställning av filmen hydrering och extrudering med det nära infraröda färgämnet DY-676-COOH. (B) Bild på self-made gelfiltrering inställning visar inter mellan icke-inkapslad (gratis) färgämne och liposomer. Liposomer eluerar först och att synas blå-grön på grund av den inkapslade DY-676-COOH (blå) och den införlivade gröna fosfolipid, NBD-DOPE. (C) representativ bild av liposom-sediment (Lip-Q) efter koncentrering genom ultracentrifugering. ( D) Representant kalibreringskurva för DY-676-COOH i 10 mM Tris pH 7,4 (innehållande 1% Triton X100) som används för kvantifiering av liposomalt färgämne. (E) Cryo-transmissionselektronmikroskopbild av Lip-Q. Klicka här för att se en större version av bilden.
Figur 2:. Fysikalisk bestämning av fluorescenssläckning och aktivering in vitro (A) Absorptionsspektra av Lip-Q (till höger) och gratis DY-676-COOH (vänster) mätt i 10 mM Tris-buffert pH 7,4, före eller efter frysning vid - 80 ° C. Notera den karakteristiska dubbla topp Lip-Q jämfört med fri DY-676-COOH och försvinnandet av den blå-skiftat topp efter frysskador av Lip-Q. (B) Motsvarande fluorescens emissionsspektra av Lip-Q (till höger) och fri DY-676-COOH (vänster) mätt i 10 mM Tris-buffert pH 7,4 före eller efter frysning vid -80 ° C.
Figur 3: Cellular upptag och fluorescens aktivering av läppen osomes. Bilderna i (A) framställdes genom NIR fluorescens avbildning av cellpelletar efter exponering för de motsvarande sonderna för 24 h vid de angivna temperaturerna. HT-1080 celler levde inte de 24 hr inkubationsperioderna vid 4 ° C. Baren diagrammen i (B) representerar de halv kvantitativa nivåer av fluorescens signaler fick genom att tilldela ROI till cellpellets i A. Varje stapel betecknar den genomsnittliga intensiteter av n = 3 experiment ± SD. Bilder i (C) förvärvades av konfokala laserskanning mikroskopi av celler som utsätts för sonder på kultur kammare diabilder i 24 timmar vid 37 ° C. Notera den höga nivån av fluorescens i hög fagocytisk murin makrofagcellinje J774A.1 och måttlig fluorescens i milda fagocytisk human glioblastomcellinje U-118 mg. Den icke-fagocytiska human fibrosarkom cellinje HT-1080 visar ingen fluorescens av sonderna. NBD-DOPE: grönt fluorescerande fosfolipid.belastning / 52.136 / 52136fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av bilden.
Figur 4. In vivo optisk avbildning av zymosan-inducerad ödem hos möss. (A) Musen Bilden till vänster visar positionerna för subkutant tillämpad zymosan-A (500 mikrogram i 50 pl saltlösning) och styr saltlösning (50 ^) på vänsterkanten. Intravenös injektion av de angivna prober och hela kroppen NIR fluorescens avbildning vid de angivna tidpunkterna avslöjar gradvis, men hög ökning fluorescens signaler av ödem och låg bakgrundssignaler från Lip-Q (övre panelen) med en maximal fluorescens vid 8 h efter injektion. Den fria färgämnet avslöjar perfusion och snabb clearance inom 4 timmar efter injektion (mellersta fönstretl), medan läpp dQ avslöjar detektering av ödem med låga signalnivåer och en övergripande högre bakgrundsfluorescens. Den grafiska presentationen i (B) upprepa de observerade fluorescenssignaler på ödem detekterades med varje sond jämfört med kontrollregionen (saltlösning) i n = 5 djur per grupp. Varje kurva representerar den genomsnittliga fluorescenssignaler av (n = 5) ± SEM. Med diagrammen, är den maximala fluorescenssignalen av ödem detekterades med varje sond lätt skiljas (Lip-Q, 8 h; Lip-dQ 2-4 h och fri DY-676-COOH, 2 h efter injektion). Det finns en signifikant (P = 0,001) högre fluorescensintensitet av ödem med Lip-Q kontra Lip-dQ vid t = 0-24 tim, och med Lip-Q kontra fri DY-676-COOH vid t = 4-24 tim. Klicka här för att se en större version av bilden.
Figur 5: Bio-optiska bilder ex vivo av organ från möss 24 h efter sond ansökan och motsvarande semikvantitativ analys av fluorescensintensiteterna hos de organ. Varje stapel representerar medelvärdet av fluorescensintensiteter (n = 4) ± SEM. Klicka här för att se en större version av bilden.
| Liposomformulering | Storlek [nm] | Polydispersitetsindex (PI) | Zeta Potential [mV] |
| Lip-dQ (dequenched) | 123,4 ± 0,6 | 0,055 ± 0,02 | -10,6 ± 0,4 |
| Lip-Q (kylda) | 118,5 ± 0,7 | 0,04 ± 0,02 | -9 ± 2 |
| Lip-NBD (v / o DY-676-COOH) | 123,0 ± 1,4 | 0,04 ± 0,03 | -11 ± 1 |
Tabell 1: Karakterisering av liposomer genom dynamisk ljusspridning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eftersom liposomer kan också fungera som leveranssystem för fluorescerande färger, de möjliggör avbildning av målsjukdomar. Inkapslingen av höga koncentrationer av fluorescerande färgämnen såsom NIRF färgämnet, DY676-COOH som används här, leder till en hög grad av fluorescensdämpning av den inneslutna färgämnet. Fluorescensutsläckning, ett fenomen som ses med många fluoroforer vid hög koncentration kan utnyttjas i flera in vivo imaging applikationer, där en hög känslighet och tillförlitlig detektering av målområdet frågas. Användningen av liposomer ger också skydd av färgämnet som är nödvändig för in vivo applikationer.
Filmen hydratisering och strängsprutningsteknik är en allmänt använd metod, som möjliggör framgångsrik beredning av liposomer med olika storleksområden, beroende på behov, och medger modifieringar såsom inkapsling av en mängd olika substanser 25. Därför är det lämpligt för beredning av läppenosomes inkapslas med NIR fluorescerande färgämnet, DY-676-COOH för avbildningsändamål. Metoden ger liposomer med 600-840 ^ M intravesikulär färgämneskoncentrationer, som ligger inom den släcktes koncentrationen av färgämnet. Den LiposoFast-Basic handen extruder används för homogenisering av spontant bildade vesikeldispersionen är lämplig för liposomframställning i små laboratorieskala, på grund av kompatibilitet enheten, med sprutor upp till 1 ml volym. För storskaliga preparat rekommenderas användning av större högtrycks homogenizers som kan homogenisera vesikler dispersioner med en kapacitet på 1.000 L per timme. Den gelfiltrering (storlek uteslutning) kromatografi är ett avgörande steg som säkerställer separation av den inkapslade liposomalt färgämnet från icke-inkapslade (gratis) färgämnesmolekyler 26. Längden på gelfiltreringskolonnen är avgörande för effektiv separation av liposomema från fritt färgämne. Således är det nödvändigt att framställa en kolonn med åtminstone 28 cm längd to framgångsrikt separera liposomerna från den fria DY-676-COOH användas här. Intressant nog är denna längd två gånger så länge som den som används för att rena karboxyfluorescein (CF) laddade liposomer gratis karboxyfluorescein. Den största nackdelen med gelfiltrering är en 5-6-faldig utspädning av de renade proven. Detta kan kompenseras genom ultracentrifugering, om högkoncentrerade liposomer behövs. Under ultracentrifuge liposomerna sedimenterar och supernatanten kan tas bort lätt 27. Andra sätt att koncentrera liposomer såsom genom dialys 28 är mer tidskrävande än ultracentrifuge.
Förutom film hydrering och extruderingsmetod, omvänd fas avdunstningsmetod 23 liksom etanolinjektionsmetoden 24 möjliggöra liposomberedning med hög inkapslingseffektivitet för många hydrofila substanser. Men våra undersökningar visade filmen hydra kombinerat med frysning och tö cykelns vara den lämpligaste metoden för en tillräcklig intraliposomal inkapsling av DY-676-COOH. Öka start DY-676-COOH koncentration som används för film hydrering ökar effektiviteten och koncentrationen av intraliposomal färgämne, då en fast lipid koncentration av 30 mM används. Trots detta inkapslings effekt med frysning och upptining är under 10% av utgångsfärgämneskoncentrationen som används, men dock är tillräckligt för inkapsling av släckningskoncentrationen som krävs för avbildning. Vidare kan den fritt färgämne separerades från liposomer genom gelfiltrering återvinnas genom avsaltning och dehydratisering enligt tillverkarens instruktioner, vilket gör åter inkapsling möjlig och en total minimal färgämnesförlust. Inkapslingen av färgämnet genom det underliggande protokollet inte har något inflytande på storleken och morfologin hos liposomerna som sett av polydispersitet index och elektronmikrograf av Lip-Q.
Flera enkla metoder kan användas för att evaluate aktiviteten av beredd fluorescerande liposomes.DY-676-COOH har en hög tendens att själv utsläckning vid höga koncentrationer 21,29 troligen till följd av H-dimer bildning och pi-stapling interaktioner mellan färgämnesmolekyler. Dessa interaktioner som uppstår på grund av närheten till Förster radier färgämnesmolekyler vid höga koncentrationer, kan förintas genom utspädning 30. Därför gör inkapsling av höga koncentrationer av DY-676-COOH inte bara skyddar färgen från opsonisering in vivo, men också från den omgivande bufferten, därigenom bibehålla sin höga koncentration och behålla fluorescensutsläckning som kan detekteras som en blå-skiftat absorption topp och emission låg fluorescens såsom visas i fig 2. Frysning liposomer gradvis vid -80 ° C leder till bildning av iskristaller i den vattenhaltiga inre 31 som orsakar skador på liposomala membranet då obetänksamt tinades vid 30 ° C. Frisläppandet, utspädning och fluorescens actition av det intra-liposomalt DY-676-COOH i buffert efter frysning avslöjas i en enda absorptionstopp och nästan 2,5-faldig ökning av fluorescensintensitet (Figur 2), vilket tyder på att Lip-Q binder därmed en hög, dämpar koncentration av DY-676-COOH och är aktiverbar. Andra metoder för att skada liposomalt lipidbiskiktet såsom användning av rengöringsmedel eller organiska lösningsmedel som inte avslöjar tydliga skillnader mellan den fria färgämnet och liposomalt inkapslade färgämnet, eftersom de båda påverkar de spektrala egenskaperna hos många fluorescerande färgämnen 32. Den långsamma frysningen och hårda upptiningsmetoden redovisas här tjänar därför som en mer tillförlitlig och lovande metod för att validera hög inkapsling av fluoroforer i liposomer och en åtföljande fluorescensutsläckning. Från absorptions- och emissionsspektra av intakt Lip-Q (figur 2), kan en viss nivå av kvarvarande fluorescens detekteras. Detta kan bero på icke-släcktes färgämnes monomerer inom liposomes och även från elektrostatisk interaktion och påverkan av inkapslat färgämne av fosfolipid polära huvudgrupper 33.
Såsom kan ses i figur 3, en distinkt ackumulering av Lip-Q i den starkt fagocytiska murina makrofag och mild fagocytiska human glioblastom-cellinje, U-118 mg 34, men inte i den icke-fagocytiska humana fibrosarkom-cellinjen HT-1080, indikerar att Lip-Q- baserad avbildning av inflammation skulle vara gynnsamt, eftersom fagocyter är de viktigaste spelarna i inflammatoriska processer. Det faktum att energibrist upphäver upptag av Lip-Q men inte upptag av den fria DY-676-COOH bestyrker specificitet fagocytiska upptag av Lip-Q och avslöjar att Lip-Q förblir intakt under försöket, annars frisättning av färgämnet och energioberoende upptag skulle ske som leder till fluorescens detektion. Bädda det grönt fluorescerande fosfolipid, NBD-DOPE i liposombiskiktet möjliggör mikroskopisk avbildning och discrimination mellan icke-degraderas från cellulära degraderade liposomer speciellt om tidsberoende upptagsförsök görs som rapporterats tidigare 32. De mikroskopiska bilder avslöjar NIR-fluorescens av DY-676-COOH som korrelerar med nivåerna av fluorescensintensiteter av cellpellets, som bestäms av semi-kvantitativ analys efter inkubation vid 37 ° C. I enlighet med detta, de murina makrofagcellinjer visar den högsta fluorescens, medan den humana glioblastom avslöjar lägre fluorescens av både DY-676-COOH och NBD-DOPE än det förra. Som väntat den mänskliga fibrosarkom cellinje, HT-1080 avslöjar ingen fluorescens av antingen liposomala färgämnen eller fri DY-676-COOH, vilket stärker det faktum att Lip-Q upptag, är främst genom fagocytos.
För att undersöka potentialen i Lip-Q-baserade fagocytos driven in vivo imaging av inflammation, har flera kontroller beaktas. Med tanke på att den fria DY-676-COOH kan tas upp av phagocytOsis, kan opsonisering av Lip-Q leda till frisättning av färgämnet, som kan komma att tas upp av fagocyter. För att undvika detta, var Lip-Q beredd med 5 mol% PEGylering. Vidare är det nödvändigt att skilja mellan upptag på grund av inflammation baserade EPR effekt och aktivt upptag och fluorescens aktivering. För att lösa detta, var det nödvändigt att utvärdera och jämföra tre olika sonder, nämligen ständig, Lip-dQ, den kylda Lip-Q och fri DY-676-COOH i möss med zymosan-inducerad ödem. Zymosan-A som framställs från cellväggarna av Saccharomyces cerevisiae och Candida albicans är en naturlig stimulant av cytokinutsöndring via dectin-1 och Toll-like receptors 2/6 (TLR 2/6). Utsöndrade cytokiner i sin tur inducerar aktivering av nedströms kaskader som resulterar i vaskulära läckage och därigenom underlätta intravasering / extravasering av monocyter / makrofager från en mjälten reservoar 35 samt neutrofiler, och deras migration till inflammationsställen(Ödem) 36-39. Den zymosan baserade monocyter / makrofager extravasering och migrationsprocessen behöver bara 4,5-6 tim vilket gör zymosan ett strategiskt verktyg för att studera inflammatoriska processer 36-39. På grund av de vaskulära läckage som resulterar vid inflammation, intravenöst injicerat prober kan antingen tas upp av monocyter / makrofager (fagocyter) under sin migration till inflammationsstället eller extravasera och tas upp vid ödem plats (EPR effekt) 40. Användningen av den icke-släcktes Lip-dQ avslöjar en övergripande starkare bakgrund till ödem signaler än Lip-Q, och en fluorescensökning av ödem som återspeglar migreringen av monocyter och makrofager. I själva verket är den maximala fluorescens av ödem redan sett 2-4 timmar efter applicering av Lip-dQ och förblir nästan konstant fram till 8 timmar. Motståndare till Lip-dQ och Lip-Q, den fria DY-676-COOH genomgår snabb perfusion efter injektion och rensas inom 4 timmar, så att distinkt avbildning av ödem är inte möjligt. Iterestingly, användningen av Lip-Q resulterar i ihållande ökning av fluorescensintensitet av ödem och mycket låga bakgrundssignaler. Denna ihållande ökning fluorescensintensiteter med Lip-Q skrivs fluorescens aktivering av liposomalt släppt färgämne. Sammantaget kan man dra slutsatsen att bidraget från EPR-effekt i Lip-Q baserad avbildning är minimal eftersom Lip-dQ avslöjar en maximal fluorescens (EPR effekt och monocyt migration) vid 4 timmar efter injektion. Således ger liposomalt inkapsling skydd och distinkt leverans av DY-676-COOH, vilket i sin tur möjliggör en mer tillförlitlig in vivo imaging av ödem, uteslutande efter interna och nedbrytning (fluorescens aktivering) av fagocytceller. Hittills är ny användning av zymosan-inducerad bakbenet ödem att validera bildegenskaper fluorescerande liposomer. Protokollet som rapporteras häri kan utökas både genom inkapsling av olika fluorescerande färgämnen och genom avbildning av effekten av olika inhiberande drugs på induktion av inflammation, och utgör därför ett användbart verktyg för beredning och karakterisering av prober som lämpar sig för biomedicinsk avbildning.
En annan avgörande steg mot att definiera lämpliga avbildningssonder är kontrollen av deras farmakologiska egenskaper och rutter eliminering. Fördelningen av prober i organ som spelar avgörande roller i utsöndring, såsom lever och njurar samt deras korta retention och lämplig eliminering från dessa organ är vanligtvis en indikation, att sonderna mycket sannolikt kommer att visa några negativa effekter på patienten. I enlighet med detta, organ möss ställdes 24 h efter injektion av Lip-Q eller den fria DY-676-COOH avslöjar endast mild fluorescens av lever / gallblåsa och njurar, vilket innebär ett föredraget eliminering av den liposomala fluoroforen genom det hepatobiliära vägen. Den korta boende av sonderna i dessa organ och deras effektiva elimineringen styrks av en 7-fold högre fluorescens signaler av organ förberett 6 timmar efter injektion av Lip-Q eller den fria DY-676-COOH 32. Dessa observationer är förenliga med eliminering av liposomer 41 och backar upp vikten av att ta biodistributionsstudier när karakterisera sonder. Även negativa biverkningar, såsom hudirritationer och komplementaktivering 42,43 har rapporterats för liposomala formuleringar som används i kliniska tillämpningar, har sådana effekter som inte upptäcks med de underliggande liposomer. Dessutom observation av immun brist möss för två veckor efter sond injektion ledde till fullständig clearance av sonderna från möss organen (visas ej).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft bidrag HI-698 / 10-1 och RU-1652 / 1-1. Vi tackar Doreen maj för utmärkt tekniskt bistånd och företaget DYOMICS GmbH, Jena för deras vänliga stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials and equipments for preparation of liposomes | |||
| egg phospahtidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (214 mg/ml) |
| cholesterol | Sigma | C8667 | Dissolve in chloroform and store in glass vials (134 mg/ml) |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880120P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (122 mg/ml) |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 810145P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (2 mg/ml) |
| Sartorius MC1 (d = 0.01 mg) | Sartorius AG | Research RC 210 P | used for weighing the phospholipids |
| Rotavapor | Büchi Labortechnik AG | R-114 | used for hydration of phospholipid film |
| Waterbath | Büchi Labortechnik AG | R-481 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacuum Controller | Büchi Labortechnik AG | B-720 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacobox | Büchi Labortechnik AG | B-177 | used for hydration of phospholipid film |
| Circulation Chiller | LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG |
WKL 230 | used for hydration of phospholipid film |
| DY-676-COOH | Dyomics GmbH | 676-00 | Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C |
| Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan | Applichem | A1086 | buffer 10 mM, pH 7.4 |
| Trichlormethan | Carl Roth GmbH + Co. KG | Y015.2 | used for liposome preparation |
| Sonicator | Merck Eurolab GmbH | USR 170 H | used for liposome preparation |
| Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00) | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | used for liposome preparation |
| Sephadex G25 medium | GE Healthcare Europe GmbH | 17-0033-01 | used for liposome purification |
| Triton X100 | Ferak Berlin GmbH | 505002 | used to destruct liposomes for dye quantification |
| LiposoFast-Basic | Avestin Inc. | used for the extrusion of liposomes | |
| Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) | VWR | used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic | |
| Fluostar Optima | BMG Labtech | used for dye quantification | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter GmbH | XL 80 | used for concentration of the samples |
| Rotor | Beckmann Coulter GmbH | SW 55 TI | used for concentration of the samples |
| Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging | |||
| Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae | Sigma | Z4250-250MG | used for induction of inflammation |
| Isotonic Saline (0.9%) | Fresenius GmbH | PZN-2159621 | used for the dilution of Zymosan-A |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda Isotec 4 | used for anesthesizing animals | |
| Isoflurane | Actavis GmbH | PZN-7253744 | anesthesia |
| Thermo Mat Pro 20 W | Lucky Reptile | 61202-HTP-20 | used to keep animals warm during anesthesia |
| Omnican-F (1 ml injection) | Braun | PZN-3115465 | used for subcutaneous and intravenous application of probes |
| Panthenol eye cream | Jenapharm | PZN-3524531 | used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia |
| Hanks buffered saline solution | PAA Laboratories /Biochrom AG | L2045 | w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells |
| 8-Well chamber slides | BD Biosciences | 354108 | used for cell culture followed by microscopy |
| Cell culture flasks | Greiner BioOne | ||
| Cell culture media | Gibco (life technologies GmbH) | ||
| Fetal calf serum | Invitrogen | ||
| Poly-L-Lysine solution (0.01%, 50 ml) | Sigma | P4832 | used to coat cell culture chamber slides |
| Mountant Permafluor | ThermoScientific | S21022-3 | Mounting solution for microscopy |
| Hoechst-33258 | AppliChem | DNA stain for microscopy | |
| Hera-Safe | Heraeus Instruments | sterile work bench used for cell culture | |
| HERA cell | Heraeus Instruments | Incubator used for cell culture | |
| LSM510-Meta | Zeiss | used for confocal microscopy | |
| Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system | CRi, Woburn | used for whole body fluorescence imaging of small animals | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV) | GE Healthcare | used for measurement of absorption | |
| Spectrofluorometer (Jasco FP-6200) | Jasco | used for measurement of fluorescence emission | |
| Animals | |||
| NMRI mice (8-12 weeks old, male) | Elevage Janvier, France | used for inflammation trials | |
References
- Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
- Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers). Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
- Cabanes, A., et al. Enhancement of antitumor activity of polyethylene glycol-coated liposomal doxorubicin with soluble and liposomal interleukin 2. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 5, 687-693 (1999).
- Gabizon, A., Shmeeda, H., Grenader, T. Pharmacological basis of pegylated liposomal doxorubicin: impact on cancer therapy. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 45, 388-398 (2012).
- Balasubramanian, S. V., Bruenn, J., Straubinger, R. M. Liposomes as formulation excipients for protein pharmaceuticals: a model protein study. Pharmaceutical research. 17, 344-350 (2000).
- Meyer, J., Whitcomb, L., Collins, D. Efficient encapsulation of proteins within liposomes for slow release in vivo. Biochemical and biophysical research communications. 199, 433-438 (1994).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et biophysica acta. 858, 161-168 (1986).
- Mayer, L. D., Bally, M. B., Hope, M. J., Cullis, P. R. Techniques for encapsulating bioactive agents into liposomes. Chemistry and physics of lipids. 40, 333-345 (1986).
- Walde, P., Ichikawa, S. Enzymes inside lipid vesicles: preparation, reactivity and applications. Biomolecular engineering. 18, 143-177 (2001).
- Weissleder, R., Ntziachristos, V. Shedding light onto live molecular targets. Nature medicine. 9, 123-128 (2003).
- Licha, K., Riefke, B., Ebert, B., Grotzinger, C. Cyanine dyes as contrast agents in biomedical optical imaging. Academic radiology. 9 Suppl 2, S320-S322 (2002).
- Pauli, J., et al. Novel fluorophores as building blocks for optical probes for in vivo near infrared fluorescence (NIRF) imaging. Journal of fluorescence. 20, 681-693 (2010).
- Holzer, W., et al. Photostability and thermal stability of indocyanine green. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 47, 155-164 (1998).
- Gandorfer, A., Haritoglou, C., Kampik, A. Retinal damage from indocyanine green in experimental macular surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 316-323 (2003).
- Saxena, V., Sadoqi, M., Shao, J. Degradation kinetics of indocyanine green in aqueous solution. Journal of pharmaceutical. 92, 2090-2097 (2003).
- Kodjikian, L., et al. Toxic effects of indocyanine green, infracyanine green, and trypan blue on the human retinal pigmented epithelium. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 243, 917-925 (2005).
- Sevick-Muraca, E. M., Houston, J. P., Gurfinkel, M. Fluorescence-enhanced, near infrared diagnostic imaging with contrast agents. Current opinion in chemical biology. 6, 642-650 (2002).
- Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
- Hilderbrand, S. A., Kelly, K. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Monofunctional near-infrared fluorochromes for imaging applications. Bioconjugate chemistry. 16, 1275-1281 (2005).
- Langhals, H., et al. Cyanine dyes as optical contrast agents for ophthalmological surgery. Journal of medicinal chemistry. 54, 3903-3925 (2011).
- Pauli, J., et al. An in vitro characterization study of new near infrared dyes for molecular imaging. European journal of medicinal chemistry. 44, 3496-3503 (2009).
- Ogawa, M., Kosaka, N., Choyke, P. L., Kobayashi, H. H-type dimer formation of fluorophores: a mechanism for activatable, in vivo optical molecular imaging. ACS chemical biology. 4, 535-546 (2009).
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75, 4194-4198 (1978).
- Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et biophysica acta. 298, 1015-1019 (1973).
- Fahr, A., van Hoogevest, P., May, S., Bergstrand, N., ML, S. L. Transfer of lipophilic drugs between liposomal membranes and biological interfaces: consequences for drug delivery. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 26, 251-265 (2005).
- New, R. R. C. Liposomes a practical approach. , IRL Press at Oxford University Press. (1990).
- Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16, 2806-2810 (1977).
- Schwendener, R. A. The preparation of large volumes of homogeneous, sterile liposomes containing various lipophilic cytostatic drugs by the use of a capillary dialyzer. Cancer drug delivery. 3, 123-129 (1986).
- Pauli, J., et al. Suitable labels for molecular imaging--influence of dye structure and hydrophilicity on the spectroscopic properties of IgG conjugates. Bioconjugate chemistry. 22, 1298-1308 (2011).
- Wu, P., Brand, L. Resonance energy transfer: methods and applications. Analytical biochemistry. 218, 1-13 (1994).
- Stark, B., Pabst, G., Prassl, R. Long-term stability of sterically stabilized liposomes by freezing and freeze-drying: Effects of cryoprotectants on structure. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 41, 546-555 (2010).
- Tansi, F. L., et al. Liposomal encapsulation of a near-infrared fluorophore enhances fluorescence quenching and reliable whole body optical imaging upon activation in vivo. Small. 9, 3659-3669 (2013).
- Chen, R. F., Knutson, J. R. Mechanism of fluorescence concentration quenching of carboxyfluorescein in liposomes: energy transfer to nonfluorescent dimers. Analytical biochemistry. 172, 61-77 (1988).
- Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC cell biology. 6, 14 (2005).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Erdo, F., Torok, K., Aranyi, P., Szekely, J. I. A new assay for antiphlogistic activity: zymosan-induced mouse ear inflammation. Agents and actions. 39, 137-142 (1993).
- Ajuebor, M. N., et al. Endogenous monocyte chemoattractant protein-1 recruits monocytes in the zymosan peritonitis model. Journal of leukocyte biology. 63, 108-116 (1998).
- Ajuebor, M. N., Das, A. M., Virag, L., Szabo, C., Perretti, M. Regulation of macrophage inflammatory protein-1 alpha expression and function by endogenous interleukin-10 in a model of acute inflammation. Biochemical and biophysical research communications. 255, 279-282 (1999).
- Ajuebor, M. N., et al. Role of resident peritoneal macrophages and mast cells in chemokine production and neutrophil migration in acute inflammation: evidence for an inhibitory loop involving endogenous IL-10. J Immunol. 162, 1685-1691 (1999).
- Binstadt, B. A., et al. Particularities of the vasculature can promote the organ specificity of autoimmune attack. Nature. 7, 284-292 (2006).
- Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H.
- Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Understanding the correlation between in vitro and in vivo immunotoxicity tests for nanomedicines. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 172, 456-466 (2013).
- Szebeni, J., et al. Prevention of infusion reactions to PEGylated liposomal doxorubicin via tachyphylaxis induction by placebo vesicles: a porcine model. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 160, 382-387 (2012).
