Summary
و، حزمة برمجيات المصدر المفتوح القائمة على MATLAB، plusTipTracker، ويمكن استخدامها لتحليل سلسلة صورة-fluorescently المسمى + نصائح لقياس ديناميات أنيبيب.
Abstract
أنيبيب (MT) زائد تتبع نهاية البروتينات (+ نصائح ل) تعريب لتزايد بالإضافة إلى الغايات من النظام التجاري المتعدد الأطراف وتنظيم ديناميات MT 1،2. واحدة من النصائح الأكثر معروفة وتستخدم على نطاق واسع + لتحليل ديناميات MT-ملزم هو نهاية البروتين، EB1، الذي يربط جميع MT زائد نهايات المتزايد، وبالتالي، هو علامة لMT البلمرة 1. وقد استخدمت العديد من الدراسات من السلوك EB1 داخل مخاريط النمو تستغرق وقتا طويلا وبمساعدة الحاسوب متحيزة وطرق ناحية تتبع لتحليل فردي النظام التجاري المتعدد الأطراف 1-3. نهجنا هو قياس المعلمات العالمية لديناميات MT باستخدام حزمة البرامج، plusTipTracker 4، بعد اكتساب عالية الدقة، والصور الحية من المعلمة EB1 في تربيتها مخاريط النمو الجنيني 5. هذا البرنامج هو ومفتوحة المصدر، حزمة سهلة الاستعمال تستند MATLAB الذي يجمع بين الكشف الآلي، وتتبع، والتصور، والتحليل للأفلام من fluorescently المسمى + النصائح. هنا، نقدم بروتوكول لاستخدام plusTipTracker لتحليل + المذنبات TIP fluorescently المسمى في تربيتها القيطم المورق مخاريط النمو. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذا البرنامج لوصف ديناميات MT في مختلف أنواع الخلايا 6-8.
Introduction
الهدف من هذه الطريقة هو الحصول على المعلومات الكمية المتعلقة أنيبيب (MT)، بالإضافة إلى تتبع نهاية البروتين (+ TIP) ديناميات يعيشون في مخاريط النمو. MT + النصائح هي مجموعة من البروتينات التي لتوطين زائد الغايات من النظام التجاري المتعدد الأطراف 9،10. أنها تؤدي مجموعة من الوظائف لتنظيم المعلمات من عدم الاستقرار الديناميكي MT 11، بما في ذلك معدلات البلمرة، كارثة، والإنقاذ. واحد الطريقة المستخدمة جيدا لتحليل ديناميات MT هو تتبع سلوك EB1 TIP +، الذي يربط خصيصا لتزايد MT زائد 1،12 ينتهي. ومن المعروف EB1 لتجنيد عدة بروتينات أخرى لتزايد MT زائد ينتهي 13،14، ومؤخرا تم تأسيس كعامل MT النضج 15، وتعزيز كلا MT النمو وتردد كارثة 15،16.
وقد استخدمت العديد من الدراسات ديناميات MT داخل مخاريط النمو طرق ناحية تتبع لقياس التغيرات في ديناميات EB1-GFP مع مرور الوقت 1-3، وEB1 localizatiإلى MT زائد نهايات يمكن أن تستخدم كعلامة للMT البلمرة. ومن المزايا الرئيسية لدراسة المذنبات EB1-GFP كبديل للنمو MT هي أن ديناميات MT يمكن قياسها حتى في مناطق التداخل MT كبير. في حين أن طريقة المذنبات EB1-GFP تتبع ناحية قدمت معلومات مفيدة إلى MT السلوكيات 1-3، فمن وقتا طويلا ويمكن أن يكون متحيزا. بالإضافة إلى ذلك، كما هي السلوكيات الشاذة النمو مخروط الأرجح نتيجة التحولات الدقيقة في ديناميات هيكل الخلية وتحليلها فقط مجموعة فرعية صغيرة من النظام التجاري المتعدد الأطراف (عادة اللازمة عند اليد تتبع) قد يغيب عن معلومات مهمة.
وبالتالي، فإننا قياس المعلمات ديناميات MT العالمية باستخدام حزمة البرامج، plusTipTracker 4، بعد الحصول على عالية الدقة، والصور الحية من المعلمة EB1 في تربيتها مخاريط النمو الجنيني 5. هذا البرنامج، وضعت في مختبر Danuser، وقد استخدم في العديد من الدراسات التي تميز ديناميكية MT في مختلف أنواع الخلايا 6-8. وهو مفتوح المصدر، لنادية إيه، الحزمة استنادا MATLAB التي تشمل الكشف الآلي، وتتبع، والتصور، والتحليل للأفلام من fluorescently المسمى + النصائح. وهناك قائمة طويلة من تحسب معايير محددة للديناميات MT بواسطة هذا البرنامج (انظر المرجع 4 لمزيد من التفاصيل)، ولكن لتحليل ديناميات MT في مخاريط النمو، المعلمات الأكثر فائدة هي MT مسار النمو سرعة (في / ميكرون دقيقة)، مسار النمو عمر (ثانية)، وطول مسار النمو (في ميكرون). البرنامج يمكن تحميلها مباشرة من موقع Danuser مختبر (تحت "البرنامج"). في حين مختبر Danuser تدعم حاليا واجهة تعليقات أحدث ل + تحليل تتبع TIP، والتي يتم تضمينها في حزمة البرمجيات دعا يو المسار 2.0، ستبقى الأصلي، قائمة بذاتها البرمجيات المتاحة. خوارزميات الكامنة بين البرنامجين هي نفسها (على الأقل عام 2014)، مع وجود اختلاف في واجهة وتحليل النواتج. بالنسبة للمستخدم المبتدئ مع قليل MATLAB و / أو تحليل الحسابية جتربةسينعقد، plusTipTracker ديه المزيد من الميزات سهلة الاستخدام، بما في ذلك الآلية مخرجات المعلمة الإحصائية.
هنا، نحن تصف الخطوات لتحليل الصور من ديناميات EB1-GFP في تربيتها القيطم المورق مخاريط النمو. تم استخدام هذا البروتوكول في ورقة حديثة دراسة ديناميات MT 17. انظر أيضا لوري وآخرون 2012 5 للحصول على تعليمات مفصلة عن مخاريط النمو زراعة معربا عن EB1-GFP. في حين أن هذه الورقة تركز في المقام الأول على دراسة ديناميات EB1-GFP في مخاريط النمو، نفس البروتوكول يمكن استخدامها لأنواع الخلايا الأخرى 17. لجميع أنواع الخلايا، يجب أن يكون الفاصل الزمني بين الإطارات بين 0.5-2 ثانية لتتبع الأمثل + TIP. فترة زمنية تصل إلى 4 ثواني بين الإطارات هو ممكن، ولكن هذه النتائج زيادة الفاصل الزمني في تتبع أخطاء إضافية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتهدف هذا البروتوكول والفيديو لتكون بمثابة رفيق إلى الورقة الأصلية التي تصف مجموعة من البرامج في مزيد من التفاصيل 4، وكذلك التقرير الفني الذي يأتي مع تحميل البرمجيات على الموقع Danuser مختبر. ويتم تشجيع القراء لمراجعة هذه الوثائق بعناية إذا كانت هناك أسئلة إضافية بشأن استخدام البرنامج.
1. قبل تحليل الصور
- تحويل كل فيلم الوقت الفاصل في سلسلة من TIFF (تنسيق ملفات الصور ذات الكلمات الدلالية) ملفات الصور. إذا كان هناك مخاريط النمو متعددة / الخلايا في فيلم معين، المحصول الأول كل مخروط النمو / خلية لخلق تسلسل الصور الخاصة به.
ملاحظة: هذا ليس من الضروري، كما يمكن اختيار مناطق من المصلحة الفردية (ROI) ضمن plusTipTracker. ومع ذلك، باستخدام أبعاد الصورة أصغر يزيد من سرعة المعالجة الحسابية، لذلك يوصى هذه الخطوة إذا كان هناك مساحة فارغة كبير في الصورة. - حفظ كل سلسلة TIFF في تلقاء نفسهامجلد يسمى "الصور" ضمن مسار التي تم تعيينها MATLAB للوصول (لاحظ أن "الصور" حساس لحالة الأحرف). لإضافة مسار جديد، انتقل إلى الدليل الملفات ذات الصلة في الإطار "المجلد الحالي"، انقر بزر الماوس الأيمن على أيقونة دليل، وحدد "إضافة إلى مسار - مختارة المجلدات والمجلدات الفرعية". من المهم أن يتم إضافة مجلد البرامج plusTipTracker إلى مسار، كذلك.
2. plusTipGetTracks
ملاحظة: الخطوة الأولى في تحليل الصور هي للكشف عن المذنبات-EB1 GFP، ربط المذنبات في المسارات، وتحديد معايير ديناميات أنيبيب. يتم الحصول على هذا مع "plusTipGetTracks" القيادة 4.
- لبدء تحليل، تطبيق مفتوح MATLAB واكتب "plusTipGetTracks" في إطار الأوامر. سيؤدي هذا إلى مربع حوار جديد لتظهر.
- انقر على "إقامة مشروعات جديدة" واختيار واحد (أو موره) من TIFF صورة سلسلة السابقة عن طريق اختيار "الصور" المناسبة مجلد (أو الدلائل التي تحتوي على "صور" المجلدات). عند الانتهاء من هذه الخطوة، دليل الملف (roi_1) سيتم إنشاء (في نفس المجلد الذي يحمل "صور") التي سوف تحتوي على ملفات البيانات في المستقبل. ملاحظة: "تعيين مشروعات جديدة" خطوة يمكن أن تكتمل في وقت مبكر، خلال جلسة منفصلة.
- سوف تظهر نافذة جديدة: "تحديد المضلع، انقر بزر الماوس الأيمن على النقطة الأخيرة، وانقر على 'إنشاء قناع". انقر على "OK". وبعد ذلك يتم عرض الصورة الأولى من سلسلة الصورة المحددة. استخدام الماوس للنقر وإنشاء المضلع الذي يشمل مجمل مخروط النمو. انقر نقرا مزدوجا فوق الماوس لإغلاق المضلع.
- مرة واحدة تم إغلاق المضلع، سوف تظهر مربع حوار: "هل تريد تحديد العائد على الاستثمار أخرى؟" إذا كانت الصورة لديه مخروط النمو لتحليل آخر، حدد "نعم". ق غير ذلكالمنتخب "لا".
- تحديد المشاريع التي سيتم تحليلها فورا. انقر على "تحديد المشاريع" وحدد المجلد (roi_X) لتحليل.
- ستظهر شاشة listSelectGUI. حدد المشروع (ق) من الجانب الأيسر من الشاشة ونقلها إلى الجانب الأيمن من الشاشة. انقر على "OK". اختيار موقع لحفظ القائمة المشروع ثم انقر فوق "حفظ".
- حدد "الكشف"، "تتبع"، و "ما بعد المعالجة". مرة واحدة تم إجراء هذه الاختيارات، فإن الجانب الأيمن من مربع الحوار أصبح شكلي. تكوين كل خيار.
- وتستخدم هذه المعايير لربط الكشف عن المذنبات في المسارات MT. وترد تفاصيل لاختيار هذه المعايير تحكم لتتبع على صفحات 9-10 من التقرير الفني PDF التي ترافق حزمة برامج التحميل؛ قراءة هذا التقرير بعناية إذا واجهت المشاكل. لأغراض تتبع المذنبات EB1-GFP في Xenopلنا المورق مخاريط النمو، واستخدام إعدادات تتبع التالية: ابحث عن أنصاف المدى المدى (بكسل) 5-12، الحد الأدنى للطول المسار الفرعية (إطارات) 3. أقصى طول الفجوة (إطارات) 8؛ ماكس فاكتور انكماش 0.8، ماكس زاوية الأمام 50، ماكس زاوية الخلف 10، تذبذب الشعاع 2.5. وتظهر هذه الإعدادات في الشكل 1.
ملاحظة: يتم تعيين انكماش ماكس فاكتور للحد من عدد من "الثغرات المتخلفة" الكشف، إذ أن "الثغرات المتخلفة" ليست مفيدة لتحليل في سياق مخاريط النمو، نظرا للظروف مزدحمة والأخطاء المحتملة في الروابط المسار. بالإضافة إلى ذلك، يتم تعيين كل من زاوية ماكس الأمام وكذلك تذبذب الشعاع عالية نسبيا، والنظام التجاري المتعدد الأطراف مخروط النمو تظهر translocations صغيرة متكررة بالإضافة إلى معدلات النمو والإنكماش، وزيادة هذه إعدادات التحكم تسمح هذه الحركة المتزايدة خلال خطوة الربط.- ملء تجهيز بوست إعدادات تبعا لإعدادات محددة الحصول على الصور المطلوبة.
- بمجرد تكوين الإعدادات، انقر على "ابدأ". سيتم تشغيل البرنامج أيهما إعدادات تم اختيارها. قد يستغرق هذا دقائق إلى ساعات، اعتمادا على عدد من المشاريع المختارة وأحجامها. يعرض إطار الأوامر الوقت المتبقي المقدر لكل وظيفة. عند اكتمال الخطوة plusTipGetTracks، وإطار الأوامر سيتم عرض "انتهى!"
ملاحظة: هناك قائمة طويلة من الآن تم احتساب معايير محددة للديناميات MT بواسطة هذا البرنامج (انظر المرجع 4 لمزيد من التفاصيل)، ولكن لتحليل ديناميات MT في مخاريط النمو، المعلمات الأكثر فائدة لدراسة MT هي مسار النمو سرعة (في ميكرون / دقيقة)، عمر مسار النمو (في ثوان)، وطول مسار النمو (في ميكرون).
3. plusTipSeeTracks
ملاحظة: الآن وبعد أن المسارات أنيبيب تم تحديدها، فإن وظيفة "plustipSeeTracks" يستخدم لمسار التصور 4. هذه الوظيفةيمكن أن توفر نواتج متعددة لتصور، بما في ذلك الخرائط الديناميكية MT المكانية والأفلام السرعة، ولكن هنا، يكون التركيز فقط على استخدام "الأفلام المسار" لعرض المسارات MT فرضه على الصور مخروط النمو. بينما يمكن plusTipGetTracks تحليل الأفلام متعددة في وقت واحد، يمكن plusTipSeeTracks تحليل فيلم واحد فقط في المرة الواحدة.
- اكتب "plusTipSeeTracks" في إطار الأوامر.
- بعد تحميل مربع الحوار، انقر على "المشروع أختر". حدد الدليل الأم يحتوي المشروع على تصور وانقر على "تحديد المجلد". سوف تظهر نافذة جديدة: "حدد المشروع الذي تريد تصور". اختيار ملف لتصور وانقر على "OK".
- بعد ذلك، انقر على "حدد المحفوظة العائد على الاستثمار". انتقل إلى نفس المجلد roi_X بوصفها واحدة المختارة في الخطوة السابقة ثم حدد الملف المسمى "roiYX".
- انقر على "تحديد دليل إخراج" لتعيين ثهنا سوف MATLAB حفظ الملفات التصور المسار. ملاحظة: نوصي باستخدام نفس المجلد الذي يحتوي على بقية البيانات.
- حدد "جعل المسار فيلم" وسوف تظهر شاشة عرض كل plusTipGetTracks المسارات تحسب من المذنبات TIP +. هذه الخطوة يحفظ سلسلة زمنية تتبع في شكل فيلم، في ملف "allTracks_X_X_X". هناك خيار لإنقاذ الفيلم باعتباره AVI، وإلا فإن التنسيق الافتراضي هو كملف Quicktime.mov.
4. plusTipGroupAnalysis
ملاحظة: يتم استخدام هذه الدالة النهائية لإنشاء مجموعات من الأفلام لتحليل ومقارنة MT المعلمات مسارها.
- اكتب "plusTipGroupAnalysis" في إطار الأوامر. لتحديد المجموعات يدويا للمقارنة، الأول دي حدد "مجموعة السيارات من التسلسل الهرمي". ثم، انقر على "تحديد المشاريع". انتقل إلى الدلائل الأصل تحتوي على جميع المجلدات roi_Xلتحليل.
- ستظهر شاشة listSelectGUI. تحديد كافة المشاريع التي تدرج في مجموعات من الجانب الأيسر من الشاشة ونقلها إلى الجانب الأيمن من الشاشة. انقر على "OK". اختيار موقع لحفظ القائمة المشروع ثم انقر فوق "حفظ".
- سوف تظهر نافذة: "الرجاء تحديد المجموعة الأولى من القائمة". انقر على "OK". سوف نافذة listSelectGUI عرض مرة أخرى. هذا الوقت، حدد فقط تلك الملفات التي تتوافق مع المجموعة الأولى التي ينبغي تجميعها معا. انقر على "OK".
- ثم، أدخل اسم المجموعة، وانقر على "OK". سوف تظهر نافذة: "حدد مجموعة أخرى؟" الإجابة وفقا لذلك وتستمر اختيار المجموعات. سوف تظهر نافذة: "حدد موقعا لحفظ قائمة مجموعتك". انتقل إلى الموقع وانقر على "حفظ".
- انقر على "اختر الناتج دليل" لاختيار المجلدات حيث الناتج ستكونالمخزنة.
- تحديد أي نوع من التحليل لإجراء مجموعة - سواء المسارات MT يجب تجميع لكل مجموعة أو لكل خلية التحليل يجب أن يتم تنفيذ. تم تعيينها بالفعل الاختبارات الإحصائية الموصى بها. لتشمل جميع المسارات في التحليل، وعدم اختيار "إزالة المسارات في بداية / نهاية فيلم". خلاف ذلك، وجود هذا الإطار المحدد يزيل أي مسارات النمو MT التي هي في العملية حيث يبدأ الفيلم أو ينتهي.
- بعد إجراء تحليل اختيار المجموعة، حدد "قارن مجموعات".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذا البرنامج كما هو موضح هنا سيقدم عدة ملفات من المعلومات التي قياس ديناميكية TIP + في الخلايا الحية.
وplusTipGetTracks ظيفة يحدد المسارات (باستخدام إعدادات سبيل المثال هو موضح في الشكل 1)، ثم تقدم المعلمات بشأن المسارات TIP +. لعرض المعلومات أن البرنامج قد حصل، انتقل إلى الدليل roi_X الذي تم إنشاؤه في الخطوة 2.2. المجلد "الفذ" يحتوي على "overlayImages"، الذي هو عبارة عن سلسلة من الصور التي تبين المذنبات المكتشفة. دراسة هذه الصور باستخدام صورة برامج التحليل يمكن أن تثبت دقة الكشف المذنب. يحتوي المجلد "الفوقية" أيضا معلومات مفصلة عن إحصاءات المذنب + TIP، بما في ذلك "projData" الملف، فضلا عن "الإحصائيات" الملف. لعرض "الإحصائيات" الملف، اسحبه إلى ورقة عمل مفتوحة من تطبيق جدول البيانات. يحتوي هذا الملف على حسابالمعلمات أنيبيب د لكل فيلم (الشكل 2). كما ذكر أعلاه، تحسب قائمة طويلة من المعايير المحددة للديناميات MT بواسطة هذا البرنامج (انظر المرجع 4 لمزيد من التفاصيل)، بما في ذلك سرعة مسار النمو MT (/ ميكرون في الدقيقة)، عمر مسار النمو (في ثوان)، ونمو طول المسار (في ميكرون).
وplusTipSeeTracks ظيفة ينقذ الفيلم من المذنبات تتبعها، والتي يمكن مراجعتها من قبل فتح الملف "allTracks_X_X_X" (الشكل 3).
وظيفة plusTipGroupAnalysis يجمع بين مجموعات البيانات الفردية إلى مجموعات متعددة ويخلق المجلدات (يسمى perCell أو pooledData، اعتمادا على تحديد التحليل) التي تحتوي على بيانات المعلمة المجموعة، بما في ذلك رسوم بيانية والمؤامرات، وجداول البيانات لمقارنة المجموعات والمعلمات الفردية داخل كل مجموعة (الشكل 4).
الرقم 1. PlusTipGetTracks الإعدادات المستخدمة لالمذنبات EB1-GFP في القيطم المورق مخاريط النمو. هذا الرقم يدل على إعدادات محددة ل"الكشف"، "تتبع"، و "ما بعد تجهيز" الخطوات التي يمكن استخدامها لتحليل EB1-GFP المذنبات في القيطم المورق مخاريط النمو. الأداة plusTipParamSweepGUI، المتاحة ضمن حزمة plusTipTracker، يمكن أن تستخدم لتحسين إعدادات للكائنات النموذجية الأخرى و / أو أنواع الخلايا 7 تتبع.
الشكل 2. قطة من المعلمات MT تم الحصول عليها من تحليل plusTipGetTracks. المجلد "الفوقية"، التي أنشأتها plusTipGetTracks تشغيل، ويحتوي على معلومات تتعلق TIP + جإحصاءات اوميت. عن طريق سحب "الإحصائيات" الملف إلى تطبيق جدول بيانات، يمكن فحص ديناميات أنيبيب المعلمات.
الرقم 3. قطة من فيلم MT المسار تم الحصول عليها من تحليل plusTipSeeTracks. PlusTipSeeTracks يسمح ليس فقط للأنيبيب المسار التصور، ولكن أيضا بمثابة أداة التحقق من قبل مما يتيح للمستخدم لعرض صحة البيانات تم الحصول عليها من plusTipGetTracks.
الرقم 4. قطة من المعلمات MT تم الحصول عليها من plusTipGroupAnalysis. PlusTipGroupAnalysis تقدم للمستخدم طريقة بسيطة لمجموعات مقارنة والمعلمات الفردية بين:ن داخل كل مجموعة من خلال الجمع بين عدة مجموعات البيانات الفردية وتوليد الناتج الإحصائي، والتي يمكن فحصها في تطبيق جدول البيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر PlusTipTracker واضحة، واجهة المستخدم الرسومية بسرعة وتلقائيا للكشف مرئية تقريبا جميع المذنبات EB1-GFP في زنزانة أو النمو مخروط، ربط المذنبات في المسارات، وحساب المعلمات MT. وذكرت وغيرها من المطبوعات تصميم أنواع مماثلة من البرامج (على سبيل المثال، ماركس وآخرون. تستخدم أيضا التحليل الكمي لديناميات EB1 الموسومة في مخاريط النمو 18). ولكن، وهذا البرنامج يبدو أن تكون فريدة من نوعها في سهولة الوصول، كما يتم تنزيله مجانا من موقع مختبر Danuser، والتي تتخصص في تصميم مفتوح المصدر، تسليم المفتاح برامج مفيدة للمجتمع البيولوجي الخلية. في حين أن المطلوب الوصول إلى MATLAB، لا يحتاج المرء إلى أن يكون على دراية تماما مع هذا التطبيق الكمبيوتر للاستفادة من البرنامج. ومع ذلك، هناك بعض النقاط التي تحتاج إلى معالجة لسهولة الاستخدام.
أولا وقبل كل شيء، واحدة من القضايا الأكثر شيوعا التي تنشأ عند استخدام قوات العمليات الخاصةيرتبط tware وتطبيقات الحاسوب للمرة الأولى إلى مسار الملف. إذا حدث هذا الخطأ (مع موجه "خطأ باستخدام السلاح - حجة يجب أن يحتوي على سلسلة خطأ في formatPath ...")، ثم الحل الأسهل هو ضمان أن البرنامج plusTipTracker، فضلا عن الدليل مع كل من "صور" الدلائل، على حد سواء في نفس "MATLAB" مسار الملف. فمن الأفضل إذا هذه ليست في "ملفات البرنامج" الدليل، كما اقترح أن المساحة في "ملفات البرنامج" اسم قد تكون قضية. حول هذا، من المهم أن نلاحظ أن plusTipTracker يوفر مسار الملف الذي يستخدم عند حساب التحليل plusTipGetTracks أولا، وعلى هذا النحو، يجب الحفاظ على هذا مسار الملف عندما يتم الوصول إلى هذه البيانات وتستخدم من قبل مكون آخر من البرنامج. وظائف plusTipGetTracks، plusTipSeeTracks، وplusTipGroupAnalysis عن استخدام مسار حفظ الملف الأصلي، وبالتالي، في محاولة لججميع هذه الوظائف لفيلم معين، بعد نقل الملفات إلى مسار آخر، سوف يؤدي إلى خطأ.
خطأ شائع آخر يحدث أثناء التحليل هو عندما يفشل خلال تتبع الخطوة plusTipGetTracks. يحدث هذا إذا كان الإطار في صورة سلسلة لا يحتوي على المذنبات التي يمكن اكتشافها. هذا وسوف توقف تماما في التحليل وسوف يحدث أي مرحلة ما بعد المعالجة. حل سهل للالتفاف على هذه القضية والسماح للتحليل المضي قدما، هو خلق المذنب وهمية على الصورة في منطقة حيث انها لن تكون مرتبطة بشكل غير صحيح إلى أي المسارات الفعلية. هذا لن يؤثر على المسار المعلمات النهائية، كما سيتم تصفيتها أي المذنب لا وجود له في الحد الأدنى لعدد إطارات متتالية من التحليل النهائي.
ومن بين القضايا الأخرى التي قد تنشأ هي كشف المذنب الخاطئ. هذا يمكن عادة أن تكون ثابتة عن طريق تحسين اختيار منطقة المصالح في الخطوة 2.3. من المهم أن رسم المنطقة ذات الاهتمام عن كثب حول الخلية وعدم رسم فصيل عبد الواحدمنطقة أيدر مما هو ضروري. البرنامج يستخدم هذه المنطقة لتحديد الخلفية التي استخدمت خلال الكشف عن المذنب. إذا كشف المذنب لا يزال دون المستوى الأمثل مع الإعدادات الافتراضية، ويمكن تعديل الإعدادات في نافذة plusTipGetTracks (خلال الخطوة 2.7).
بعد أي تحليل، من المهم جدا للتحقق من صحة الروابط المسار الآلي عن العين، وذلك باستخدام plusTipSeeTracks. قد تحتاج إلى تعديل لخفض أعداد كاذبة إيجابية أو سلبية كاذبة الروابط المذنب إعدادات تتبع. راجع وثائق plusTipTracker الأصلي 4 وكذلك التقرير الفني الذي يصاحب PDF تحميل البرمجيات لمزيد من التفاصيل على تحسين الإعدادات. قد سبق اختبار أداء هذا البرنامج بالمقارنة مع اليد تتبع في الخلايا غير العصبية 4. مخاريط النمو تشكل تحديا مختلفا قليلا، ولكن، وكما تظهر نمو النظام التجاري المتعدد الأطراف مخروط translocations متكررة في كل الاتجاهات 17، بالإضافة إلى النمو وانكماش MT. واحد إيسو.البريد التي لم يتم العثور على أن يكون مصدر القلق الرئيسي هو ما إذا كان النظام التجاري المتعدد الأطراف معبأة بإحكام في مخاريط النمو تشكل صعوبات تتبع 17. كما مجموعة فرعية فقط من النظام التجاري المتعدد الأطراف هي في طور النمو، مع EB1-GFP على الغايات، وحل وتتبع الفردية كانت المذنبات EB1-GFP لا إشكالية. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن هذه الدراسات السابقة المستخدمة القيطم المورق مخاريط النمو، والتي تم اختيارها خصيصا لما لها من كبير نسبيا حجم مخروط النمو (حوالي 10 ميكرون)، بالمقارنة مع غيرها من مخاريط النمو الفقاريات. باستخدام هذه المخاريط نمو أكبر يسمح لأدق-EB1 GFP تحليل المذنب.
لتقييم فائدة ودقة هذا البرنامج لتحليل المسارات EB1-GFP في القيطم مخاريط النمو المورق، قارنا تجربة استخدام plusTipTracker مع اليد تتبع سلسلة بيانات متطابقة (لا تظهر البيانات). الوقت الذي استغرق لتسليم المسار المذنبات EB1-GFP في متوسط مخروط النمو من 39 المسارات المذنب (في 1 دقيقة الوقت الفاصل بين سيريوفاق، مع 2 ثانية بين كل إطار) كان أكثر من ساعتين، مقابل دقيقتين مع البرنامج. وكانت المعلمات التي تم الحصول عليها مع طريقتين مماثلة لسرعة النمو MT (7.4 ميكرون في الدقيقة الآلي لتتبع مقابل 7.0 ميكرون في الدقيقة الواحدة لجهة تتبع). ومع ذلك، لمدى الحياة النمو وطول، وتحليل البرامج يؤدي إلى مسارات أقصر بكثير (بنحو نصف الوقت والمسافة). ومن المقرر أن يتم تقسيم مسارات النمو من قبل البرنامج هذا إذا كان المذنب يذهب داخل وخارج التركيز مع مرور الوقت. في حين أن العين البشرية يمكن التعرف بسهولة أنه هو نفسه المذنب، البرنامج لا. هذه المسألة ليست إشكالية رغم ذلك، إذا كان أحد باستخدام البرنامج من أجل مقارنة شروط متعددة. حيث يتم استخدام المعلمات تتبع مطابقة لجميع الشروط (وعلى افتراض أن المذنبات تذهب داخل وخارج التركيز في نفس المعدل في ظروف متعددة)، ثم أعمار وأطوال النسبية لا تزال قياسات مفيدة للغاية للمقارنة. أما بالنسبة للتحليل الآلي الفئران خطأوفاق، وهذه تعتمد إلى حد كبير على نوعية الصور. في الأفلام عالية إشارة إلى الضجيج، و٪ من المسارات misjoined أو غير صحيحة هي في خانة واحدة. حتى في أفلام ذات جودة أقل (حيث لا تزال المذنبات الفردية واضحة للعيان من خلال العين، ولكن الضوضاء الخلفية أكبر)، ومعدلات الخطأ لا تزال منخفضة بما فيه الكفاية (5-15٪) أن وقتا كبيرا حفظها باستخدام برنامج يستحق التكاليف في الخطأ. هذا هو الحال عند تحليل مئات المخاريط النمو (تم تحليل 60-8 مخاريط النمو لكل حالة في دراسة سابقة 17) على وجه الخصوص.
من المهم أن نلاحظ أن هذا البرنامج صمم للكشف عن المذنبات TIP + التي تربط فقط لتزايد نهايات MT، مثل EB1-GFP. وبالنظر إلى أن الربط وتتبع خوارزميات تتوقع أن المذنبات موجودة فقط على البلمرة النظام التجاري المتعدد الأطراف، وذلك باستخدام هذا البرنامج لتحليل ديناميات + TIP fluorescently الموسومة التي تربط لتقلص MT ينتهي بالإضافة إلى نهايات المتزايد سوف يؤدي إلى معلومات غير صحيحةفيما يحسب سرعات النمو MT.
واحدة من الميزات الفريدة لهذا البرنامج مقارنة مع البرامج الأخرى واحد الجسيمات تتبع، غير أنه يأخذ في الاعتبار السلوكيات المعروفة MT لحساب المعلمات البلمرة فحسب، ولكن أيضا المعلمات انكماش. وذلك من خلال ربط والمذنب EB1 GFP الذي اختفى مع واحد التي شكلت حديثا مباشرة وراء ذلك في نفس المسار (وهذا ما يسمى backgap، أو المسار bgap). في حين أن هذه الخوارزمية يعمل بشكل جيد لبعض أنواع الخلايا، مثل خلايا هيلا 4، بل هو ميزة أقل فعالية عند تحليل ديناميات MT في مخاريط النمو. وذلك لأن كثيرا MT المسارات اتبع بعضهم البعض على نفس مسارات بالضبط في مخاريط النمو (غالبا بعد طول حزم F-أكتين)، وهكذا فإنه عادة ما يكون من المستحيل معرفة ما إذا كان bgap الروابط صحيحة. لهذا السبب، فمن غير المستحسن للاستفادة من مخرجات البيانات bgap في مخاريط النمو.
على الرغم من هذه المحاذير وقضايا بسيطةالتي يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند استخدام plusTipTracker (ومعظم أي برنامج معالجة الصور الآلي)، ويمكن هذا البرنامج أن يكون أداة مفيدة للغاية لتحليل الآلاف من المذنبات EB1-GFP في فترة قصيرة نسبيا من الزمن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plusTipTracker software | Danuser Lab | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | This software may be hosted by another website in the future. If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site. |
| MATLAB software | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ |
References
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).
- Lee, H., et al. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. , 913-926 (2004).
- Purro, S. A., et al. Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).
- Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. Neural Explant Cultures from Xenopus laevis. Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).
- Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).
- Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).
- Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells. PLoS One. 7, e41413 (2012).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).
- Schuyler, S. C., Pellman, D. Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning. Cell. 105, 421-424 (2001).
- Mitchison, T., Kirschner, M.
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).
- Dixit, R., et al. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).
- Li, W., et al. EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells. The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).
- Maurer, S. P., et al. EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics. Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).
- Lowery, L. A., et al. Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth. Neural development. 8, 22 (2013).
- Marx, A., et al. Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules. Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).
