Summary
El paquete de software basado en MATLAB código abierto, plusTipTracker, se puede utilizar para analizar series de imágenes de fluorescencia + Filtros marcado para cuantificar la dinámica de microtúbulos.
Abstract
Microtúbulos (MT) plus de fin de seguimiento de las proteínas (+ consejos) localizar a las crecientes más-extremos de MTs y regulan la dinámica de MT 1,2. Uno de los consejos más conocidos y utilizados ampliamente + para el análisis de la dinámica de MT es la proteína, EB1 Fin de Unión, que une a todos los que crecen MT plus-extremos, y por lo tanto, es un marcador para la polimerización MT 1. Muchos estudios de comportamiento EB1 dentro conos de crecimiento se han utilizado mucho tiempo y, métodos tendenciosos mano de seguimiento con ayuda de computadora para analizar individuo MTs 1-3. Nuestro enfoque consiste en cuantificar los parámetros globales de la dinámica de MT utilizando el paquete de software, plusTipTracker 4, tras la adquisición de alta resolución, imágenes en directo de EB1 etiquetados en los conos de crecimiento embrionarias cultivadas 5. Este software es un código abierto, paquete basado en MATLAB, fácil de usar que combina la detección automática, el seguimiento, la visualización y el análisis de las películas de + Filtros marcadas con fluorescencia. A continuación, presentamos el protocolo para el uso de plusTipTracker para el análisis de los cometas TIP marcadas con fluorescencia + en los conos de crecimiento laevis cultivadas Xenopus. Sin embargo, este software también puede ser utilizado para caracterizar la dinámica de MT en diversos tipos celulares 6-8.
Introduction
El objetivo de este método es la obtención de información cuantitativa respecto a los microtúbulos (MT) plus de fin de seguimiento de la dinámica en los conos de crecimiento que vive proteína (+ TIP). MT + consejos son un grupo de proteínas que se localizan en las plus-extremos de los MT 9,10. Llevan a cabo una serie de funciones para regular los parámetros de MT inestabilidad dinámica 11, como los porcentajes de polimerización, la catástrofe, y el rescate. Un método muy usado para el análisis de la dinámica de MT es realizar un seguimiento del comportamiento de la EB1 TIP +, que se une específicamente a la creciente MT plus-termina 1,12. EB1 es conocido por reclutar otras proteínas a la creciente MT plus-termina 13,14, y recientemente se ha establecido como un factor de maduración de MT 15, promoviendo tanto el crecimiento de MT y la frecuencia catástrofe 15,16.
Muchos estudios sobre la dinámica de MT en los conos de crecimiento se han utilizado métodos de la mano-de seguimiento para medir los cambios en la dinámica EB1-GFP en el tiempo 1-3, como localizati EB1a MT-más extremos pueden ser utilizados como un marcador para la polimerización de MT. Un beneficio clave para el examen de los cometas EB1-GFP como un proxy para el crecimiento MT es que la dinámica de MT se pueden medir incluso en las regiones de solapamiento significativo MT. Mientras que el método de los cometas EB1-GFP-tracking mano ha proporcionado información útil sobre MT comportamientos 1-3, es mucho tiempo y puede estar sesgado. Además, ya que el crecimiento aberrante comportamientos cono son probablemente el resultado de los cambios de hora en la dinámica del citoesqueleto, analizando sólo un pequeño subconjunto de los MT (suele ser necesario cuando la mano-seguimiento) puede perder información importante.
Por lo tanto, medimos los parámetros globales de dinámica MT utilizando el paquete de software, plusTipTracker 4, después de la adquisición de alta resolución, imágenes en directo de EB1 etiquetados en los conos de crecimiento embrionarias cultivadas 5. Este software, desarrollado en el Laboratorio de Danuser, se ha utilizado en varios estudios que caracterizan la dinámica de MT en diversos tipos de células 6-8. Es un código abierto, noser-amistoso, paquete basado en MATLAB que incluye la detección automática, el seguimiento, la visualización y el análisis de las películas de + Filtros marcadas con fluorescencia. Una larga lista de parámetros específicos de la dinámica de MT se calculan por este software (ver referencia 4 para más detalles), pero para el análisis de la dinámica de MT en los conos de crecimiento, los parámetros más útiles son MT velocidad senda del crecimiento (en micras / minuto), la senda del crecimiento curso de la vida (en segundos), y la longitud de la pista de crecimiento (en micras). El software se puede descargar directamente desde la página web Danuser Lab (en "Software"). Mientras que el Laboratorio Danuser actualmente soporta una nueva interfaz para el análisis de seguimiento + TIP, que se incorpora en un paquete de software llamado u-pista 2.0, el software original, independiente seguirá estando disponible. Los algoritmos subyacentes entre los dos programas son los mismos (por lo menos a partir de 2014), con sólo una diferencia de salidas de la interfaz y de análisis. Para el usuario principiante con poco MATLAB y / o análisis computacional expericia, plusTipTracker tiene más características fáciles de usar, incluyendo salidas de parámetros estadísticos automatizados.
A continuación, describimos los pasos para el análisis de imágenes de la dinámica EB1-GFP en los conos de crecimiento laevis cultivadas Xenopus. Este protocolo se utilizó en un artículo reciente sobre la dinámica de MT 17. Ver también Lowery et al. 2012 5 para instrucciones detalladas de los conos de crecimiento del cultivo que expresan EB1-GFP. Si bien este documento se centró principalmente en el examen de la dinámica de EB1-GFP en los conos de crecimiento, el mismo protocolo se puede utilizar para otros tipos de células 17. Para todos los tipos de células, el intervalo de tiempo entre tramas debe estar entre 0,5-2 seg para el seguimiento óptimo + TIP. Un intervalo de tiempo de hasta 4 segundos entre tramas es posible, pero este aumento de los resultados de tiempo de intervalo en errores de seguimiento adicionales.
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Protocol
Este protocolo y el vídeo tienen el propósito de servir como un compañero al documento original que describe el paquete de software en más detalle 4, así como el informe técnico que acompaña la descarga del software en el sitio web Danuser Lab. Se anima a los lectores a revisar estos documentos cuidadosamente si hay preguntas adicionales con respecto al uso del software.
1. Antes de Análisis de Imágenes
- Convertir cada película de lapso de tiempo en una secuencia de TIFF (Tagged Image File Format) archivos de imagen. Si hay varios conos de crecimiento / células en una película dada, primera cosecha de cada cono de crecimiento / célula para crear su propia secuencia de imágenes.
Nota: Esto no es necesario, como regiones-de-interés (ROI) individuales se pueden seleccionar dentro plusTipTracker. Sin embargo, utilizando dimensiones de imagen más pequeños aumenta la velocidad del procesamiento computacional, lo que se recomienda este paso si hay espacio en blanco significativo en la imagen. - Guarde cada serie TIFF en su propiacarpeta llamada "imágenes" en un camino que MATLAB se establece en el acceso (tenga en cuenta que "las imágenes" es entre mayúsculas y minúsculas). Para agregar un nuevo camino, navegue hasta el directorio de archivos correspondiente en la ventana de "carpeta actual", haga clic derecho en el icono de directorio y seleccione "Agregar a Path - Seleccionado Carpetas y Sub-Carpetas". Es importante que se añadirá la carpeta del software plusTipTracker al Camino, también.
2. plusTipGetTracks
Nota: El primer paso en el análisis de imagen es detectar las cometas EB1-GFP, vincular las cometas en pistas, y determinar los parámetros de la dinámica de microtúbulos. Esto se logra con el comando "plusTipGetTracks" 4.
- Para comenzar el análisis, la aplicación MATLAB abierta y escriba "plusTipGetTracks" en la ventana de comandos. Esto hará que un nuevo cuadro de diálogo que aparezca.
- Haga clic en "Set Up Nuevos Proyectos" y seleccionar uno (o more) de la anterior TIFF serie de imágenes mediante la selección de las "imágenes" apropiadas carpeta (o directorios que contienen "imágenes" carpetas). Una vez finalizado este paso, un directorio de archivos (roi_1) será creado (en la misma carpeta que contiene "imágenes") que contendrá los ficheros de datos futuras. Nota: el paso "Configurar Nuevos Proyectos" se puede completar antes de tiempo, durante una sesión separada.
- Una nueva ventana aparecerá: "Seleccione un polígono, haga clic derecho en este último punto, y hacer clic en" Crear máscara '". Haga clic en "Aceptar". A continuación, se muestra la primera imagen de la serie de imágenes seleccionadas. Usa el ratón para hacer clic y crear un polígono que abarca la totalidad del cono de crecimiento. Haga doble clic en el ratón para cerrar el polígono.
- Una vez que el polígono se ha cerrado, un cuadro de diálogo aparecerá: "¿Usted desea seleccionar otro ROI?" Si la imagen tiene otro cono de crecimiento para analizar, seleccionar "Sí"; s de lo contrarioelegidos "No".
- Seleccione los proyectos que serán analizadas inmediatamente. Haga clic en "Seleccionar Proyectos" y seleccione la carpeta (roi_X) para analizar.
- Aparecerá una pantalla listSelectGUI. Seleccione el proyecto (s) desde el lado izquierdo de la pantalla y moverlos hacia el lado derecho de la pantalla. Haga clic en "Aceptar". Elija una ubicación para guardar la lista de proyectos y haga clic en "Guardar".
- Seleccione "Detección", "Tracking" y "Post-proceso". Una vez realizadas estas selecciones, el lado derecho del cuadro de diálogo se convertirá configurable. Configure cada opción.
- Estos parámetros se utilizan para vincular los cometas detectados en pistas MT. Detalles para la elección de estos parámetros de control para el seguimiento se incluyen en las páginas 9 a 10 del Informe Técnico PDF que acompaña la descarga del paquete de software; leer este informe con cuidado si se encuentran problemas. Para los propósitos de seguimiento de cometas EB1-GFP en Xenopnos laevis conos de crecimiento, utilizan los ajustes de seguimiento siguientes: Radio de búsqueda Rango (píxeles) 5-12, Longitud mínima Sub-Track (frames) 3; Max longitud de hueco (frames) 8; Max Factor Contracción 0,8, ángulo delantero máximo 50, ángulo de Max hacia atrás 10, Fluctuación Radio 2.5. Estos valores se muestran en la Figura 1.
Nota: Max Factor Contracción está configurado para reducir el número de "lagunas detectadas atrasadas", como "brechas hacia atrás" no son útiles para analizar en el contexto de los conos de crecimiento, dadas las condiciones de hacinamiento y los posibles errores en los vínculos de la pista. Además, tanto el ángulo delantero máximo, así como la fluctuación del radio se fijan relativamente alta, como MT cono de crecimiento exhiben pequeños desplazamientos frecuentes, además de crecimientos y contracciones, y el aumento de estos parámetros de control permite para este aumento en el movimiento durante la etapa de vinculación.- Complete los ajustes post-procesamiento en función de los ajustes de adquisición de imágenes específicas deseadas.
- Una vez que los ajustes se han configurado, haga clic en "Iniciar". El software se ejecutará lo que los ajustes han sido seleccionados. Esto puede tomar minutos u horas, dependiendo del número de proyectos seleccionados y sus tamaños. La ventana de comandos muestra el tiempo restante estimado para cada función. Cuando se completa el paso plusTipGetTracks, la ventana de comandos mostrará "¡Ya está!"
Nota: Una larga lista de parámetros específicos de la dinámica de MT ahora se han calculado por este software (ver referencia 4 para más detalles), pero para el análisis de la dinámica de MT en los conos de crecimiento, los parámetros más útiles para el estudio son MT velocidad senda del crecimiento (en micras / minuto), tiempo de vida senda del crecimiento (en segundos), y la longitud de la pista de crecimiento (en micras).
3. plusTipSeeTracks
Nota: Ahora que las pistas de los microtúbulos se han definido, la función "plustipSeeTracks" se utiliza para la pista de visualización 4. Esta funciónpueden proporcionar múltiples salidas para la visualización, incluyendo mapas de dinámica de MT espaciales y películas de velocidad, pero aquí, la atención se centra exclusivamente en el uso de "Películas Track" para mostrar pistas MT superpuestas sobre las imágenes de cono de crecimiento. Mientras plusTipGetTracks pueden analizar varias películas a la vez, plusTipSeeTracks sólo pueden analizar una película a la vez.
- Escriba "plusTipSeeTracks" en la ventana de comandos.
- Una vez cargado el cuadro de diálogo, haga clic en "Seleccionar proyecto". Seleccione el directorio principal que contiene el proyecto de visualizar y haga clic en "Seleccionar carpeta". Una nueva ventana aparecerá: "Seleccione el proyecto que desea visualizar". Elija el archivo para visualizar y haga clic en "Aceptar".
- A continuación, haga clic en "Select Guardados ROI". Navegue a la misma carpeta roi_X que la seleccionada en el paso anterior y seleccione el archivo con el nombre "roiYX".
- Haga clic en "Seleccionar Directorio de salida" para designar waquí MATLAB guardará los archivos de visualización de pista. Nota: Se recomienda el uso de la misma carpeta que contiene el resto de los datos.
- Seleccione "Crear pista de película", y aparecerá una pantalla que muestra todas las pistas plusTipGetTracks calculados a partir de los cometas TIP +. Este paso guarda la serie de tiempo seguido en un formato de película, en el archivo "allTracks_X_X_X". Hay una opción para guardar la película como AVI, de lo contrario el formato por defecto es como un archivo Quicktime.mov.
4. plusTipGroupAnalysis
Nota: Esta función final se utiliza para crear grupos de películas para el análisis y la comparación de sus parámetros de pista MT.
- Escriba "plusTipGroupAnalysis" en la ventana de comandos. Para seleccionar manualmente los grupos para comparar, primero de-seleccionar "Auto grupo de jerarquía". A continuación, haga clic en "Seleccionar proyectos". Vaya a los directorios padre que contienen todas las carpetas roi_Xpara analizar.
- Aparecerá una pantalla listSelectGUI. Seleccione todos los proyectos a incluir en los grupos de la parte izquierda de la pantalla y moverlos hacia el lado derecho de la pantalla. Haga clic en "Aceptar". Elija una ubicación para guardar la lista de proyectos y haga clic en "Guardar".
- Una ventana aparecerá: "Por favor, seleccione primer grupo de la lista". Haga clic en "Aceptar". La ventana listSelectGUI mostrará de nuevo. Esta vez, seleccionar sólo los archivos que corresponden al primer grupo que deben ser agrupados juntos. Haga clic en "Aceptar".
- A continuación, introduzca el nombre del grupo y haga clic en "Aceptar". Una ventana aparecerá: "Seleccione otro grupo?" Respuesta en consecuencia y continuará la selección de grupos. Una ventana aparecerá: "Seleccione una ubicación para guardar la lista de grupos". Vaya a la ubicación y haga clic en "Guardar".
- Haga clic en "Select Output Directory" para elegir dónde las carpetas de salida seráalmacenado.
- Seleccione el tipo de análisis de grupo para llevar a cabo - si las pistas MT deben agruparse para cada grupo o por el análisis de células se debe realizar. Las pruebas estadísticas recomendadas ya están designados. Para incluir todas las pistas en el análisis, de-seleccionar "Eliminar pistas al inicio / final de la película". De lo contrario, teniendo este cuadro seleccionado elimina cualquier pista de crecimiento MT que están en proceso como la película comienza o termina.
- Una vez realizada la selección Grupo de Análisis, seleccione "Búsqueda de grupos".
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Representative Results
El uso de este software aquí descrito ofrecer varios archivos de información que cuantifican + dinámica TIP en las células vivas.
Los plusTipGetTracks función identifica las pistas (utilizando la configuración de ejemplo que se muestran en la Figura 1) y, a continuación, proporciona parámetros respecto a las pistas TIP +. Para ver la información que el software ha obtenido, vaya al directorio roi_X que se creó en el paso 2.2. La carpeta "hazaña" contiene "overlayImages", que es una serie de imágenes que muestran los cometas detectados. El examen de estas imágenes utilizando la imagen de software de análisis puede demostrar la eficiencia de la detección cometa. La carpeta "meta" también contiene información detallada sobre las estadísticas de los cometas + TIP, incluido el archivo "projData", así como el archivo de "Estadísticas". Para ver el archivo "Stats", arrastrarlo a una hoja de cálculo abierta de una aplicación de hoja de cálculo. Este archivo contiene el calculod parámetros microtúbulos para cada película (Figura 2). Como se señaló anteriormente, una larga lista de parámetros específicos de la dinámica de MT se calculan por este software (ver referencia 4 para más detalles), incluyendo la velocidad senda del crecimiento MT (en micras / minuto), tiempo de vida senda del crecimiento (en segundos), y el crecimiento de longitud de la pista (en micras).
Los plusTipSeeTracks función guarda una película de los cometas de orugas, que pueden ser revisados por abrir el archivo "allTracks_X_X_X" (Figura 3).
El plusTipGroupAnalysis función combina múltiples conjuntos de datos individuales en grupos y crea carpetas (llamado Percell o pooledData, dependiendo de que se selecciona el análisis) que contienen datos de los parámetros de grupo, incluyendo histogramas, diagramas y hojas de cálculo para comparar los grupos y parámetros individuales dentro de cada grupo (Figura 4).
Figura 1. PlusTipGetTracks ajustes utilizados para cometas EB1-GFP en Xenopus laevis conos de crecimiento. Esta figura muestra la configuración específica para los pasos "de detección", "Tracking" y "Post-proceso" que se pueden utilizar para el análisis de EB1-GFP cometas en Xenopus laevis conos de crecimiento. La herramienta plusTipParamSweepGUI, disponible en el paquete de plusTipTracker, se puede utilizar para optimizar los ajustes de seguimiento para otros organismos modelo y / o tipos de células 7.
Figura 2 Captura de pantalla de los parámetros de MT obtenidos del análisis plusTipGetTracks. La carpeta "meta", creado por plusTipGetTracks ejecutan, contiene información sobre + TIP cEstadísticas omet. Arrastrando el archivo "Estadísticas" en una aplicación de hoja de cálculo, parámetros de la dinámica de los microtúbulos se pueden examinar.
Figura 3 Captura de pantalla de MT película pista obtenida de análisis plusTipSeeTracks. PlusTipSeeTracks no sólo permite la visualización de pista de los microtúbulos, pero también sirve como una herramienta de verificación, permitiendo al usuario ver la validez de los datos obtenidos de plusTipGetTracks.
Figura 4 Captura de pantalla de los parámetros de MT obtenidos de plusTipGroupAnalysis. PlusTipGroupAnalysis ofrece al usuario un método simple para comparar grupos y parámetros individuales between dentro de cada grupo mediante la combinación de múltiples conjuntos de datos individuales y la generación de la producción estadística, que puede ser examinado en una aplicación de hoja de cálculo.
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Discussion
PlusTipTracker proporciona una interfaz de usuario sencilla, gráfica para detectar de forma rápida y automática prácticamente todos los cometas visibles EB1-GFP en un cono o el crecimiento celular, vincular las cometas en pistas, y calcular los parámetros de MT. Otras publicaciones han informado el diseño de tipos similares de software (por ejemplo, Marx et al. También utilizó el análisis cuantitativo de la dinámica de EB1 marcadas en los conos de crecimiento 18). Pero, este programa parece ser único en su facilidad de acceso, ya que se puede descargar gratuitamente desde el sitio web del Laboratorio Danuser, que se especializa en el diseño de código abierto, llave en software útil para la comunidad biológica celular. Si bien se requiere el acceso a MATLAB, uno no necesita ser completamente familiarizado con esta aplicación informática con el fin de utilizar el software. Sin embargo, hay algunos puntos que deben abordarse para facilidad de uso.
En primer lugar, uno de los problemas más comunes que surgen al utilizar el software y aplicación informática para la primera vez que se relaciona con la ruta del archivo. Si se produce este error (con el símbolo "Error usando cd -. Argumento debe contener una cadena de errores en formatPath ..."), a continuación, la solución más fácil es para asegurar que el software plusTipTracker, así como el directorio con todas las "imágenes" subdirectorios, son a la vez en la misma ruta de archivo "MATLAB". Es mejor si estos no están en el directorio "Archivos de programa", como se ha sugerido que el espacio en el "Archivos de programa" nombre puede ser un problema. Relacionado con esto, es importante señalar que plusTipTracker ahorra la ruta del archivo que se utilizó cuando calculando primero el análisis plusTipGetTracks, y como tal, esta ruta de archivo debe mantenerse cuando se accede a estos datos y empleado por otro componente del software. Las funciones plusTipGetTracks, plusTipSeeTracks y plusTipGroupAnalysis todos utilizan la ruta del archivo original guardado, y por lo tanto, tratar de ctodas aquellas funciones para una película determinada, después de mover los archivos a otro camino, se producirá un error.
Otro error común que se produzca durante el análisis es cuando Tracking falla durante el paso plusTipGetTracks. Esto ocurrirá si un fotograma de la serie de imágenes no contiene cometas detectables. Esto detendrá por completo el análisis y no post-procesamiento se producirá. Una solución fácil de eludir este problema y permitir el análisis de proceder, es la creación de un cometa simulacro en la imagen en un área donde no se incorrectamente vinculada a las pistas reales. Esto no afectará a los parámetros finales de la pista, ya que cualquier cometa que no existe en un número mínimo de cuadros consecutivos se filtra fuera del análisis final.
Otro problema que puede surgir es la detección cometa defectuoso. Esto por lo general se puede solucionar mediante la mejora de la selección de región de interés en el paso 2.3. Es importante señalar a la región de interés de cerca alrededor de la célula y no llamar la awregión Ider de lo necesario. El software utiliza esta región para determinar el fondo utilizado durante la detección cometa. Si la detección del cometa es todavía inferior al óptimo con la configuración predeterminada, los ajustes se pueden configurar en la ventana plusTipGetTracks (durante el paso 2.7).
Después de todo análisis, es fundamental para validar los vínculos de pista automatizados por ojo, usando plusTipSeeTracks. Ajustes de seguimiento pueden necesitar ser modificados para reducir el número de falsos vínculos cometa positivos o falsos negativos. Consulte la documentación plusTipTracker 4 original, así como el Informe Técnico PDF que acompaña la descarga del software para obtener más información sobre la optimización de la configuración. El rendimiento de este software en comparación con la mano de seguimiento anteriormente ha sido probado en células no neuronales 4. Los conos de crecimiento representan un desafío ligeramente diferente, sin embargo, como MTs cono de crecimiento presentan translocaciones frecuentes en todas las direcciones 17, además del crecimiento MT y la contracción. Uno issue que no resultó ser una de las principales preocupaciones es si los MTs apretados en los conos de crecimiento plantean dificultades de seguimiento 17. Como sólo un subconjunto de MTs están en la fase de crecimiento, con EB1-GFP en los extremos, la resolución y seguimiento de cometas individuales EB1-GFP no fue problemática. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que estos estudios previos utilizados Xenopus laevis conos de crecimiento, que se eligen específicamente debido a su tamaño relativamente grande del cono de crecimiento (aproximadamente 10 micras), en comparación con otros conos de crecimiento de vertebrados. El uso de estos conos de crecimiento de mayor tamaño permite el análisis del cometa-EB1 GFP más precisa.
Para evaluar la utilidad y precisión de este software para analizar pistas EB1-GFP en Xenopus laevis conos de crecimiento, se comparó la experiencia de usar plusTipTracker con la mano-el seguimiento de una serie de datos idénticos (datos no mostrados). El tiempo que se tardó en entregar pistas cometas EB1-GFP en un cono de crecimiento promedio de 39 pistas de cometas (en una seri de lapso de tiempo 1 minutoes, con 2 segundos entre cada fotograma) era más de dos horas, dos minutos en comparación con el software. Los parámetros obtenidos con los dos métodos fueron similares para la velocidad de crecimiento MT (7,4 micras por minuto para seguimiento automático frente a 7,0 micras por minuto en la mano-tracking). Sin embargo, para toda la vida y el crecimiento de la longitud, el software de análisis conduce a pistas significativamente más cortos (de aproximadamente la mitad del tiempo y la distancia). Esto se debe a las pistas de crecimiento que se divide por el software si un cometa va en y fuera de foco con el tiempo. Mientras que el ojo humano puede identificar fácilmente que es el mismo cometa, el software no lo hace. Este problema no es problemático, sin embargo, si uno está utilizando el software con el fin de comparar varias condiciones. Desde parámetros de seguimiento idénticos se utilizan para todas las condiciones (y suponiendo que los cometas van en y fuera de foco a la misma velocidad en múltiples condiciones), entonces los tiempos de vida relativas y longitudes son todavía mediciones muy útiles para la comparación. En cuanto a análisis automatizado error rataES, éstos dependen en gran medida de la calidad de las imágenes. En películas de alta relación señal-ruido, el porcentaje de pistas misjoined o incorrectas es de un solo dígito. Incluso en películas de menor calidad (donde los cometas individuales son todavía claramente visibles por el ojo, pero el ruido de fondo sea mayor), las tasas de error son todavía lo suficientemente baja (5-15%) que el tiempo significativo ahorrado utilizando el software vale la costos en error. Esto es especialmente el caso cuando el análisis de cientos de conos de crecimiento (sesenta hasta ocho conos de crecimiento por condición se analizaron en un estudio previo 17).
Es importante tener en cuenta que este software fue diseñado para detectar cometas + TIP que sólo se unen a extremos MT crecimiento, tales como EB1-GFP. Dado que los algoritmos de vinculación y seguimiento esperan que sólo existen los cometas en la polimerización de MTs, el uso de este software para analizar la dinámica de un + TIP-marcado con fluorescencia que se une a la reducción MT termina además de extremos en crecimiento conducirá a información incorrectacon respecto a las velocidades de crecimiento MT calculados.
Una de las características únicas de este software en comparación con otro software de partículas de seguimiento único, es que toma en cuenta los conocidos comportamientos MT para calcular no sólo los parámetros de polimerización, sino también los parámetros de contracción. Lo hace mediante la vinculación de un cometa-EB1 GFP que ha desaparecido con uno que ha recién formado directamente detrás de él en la misma trayectoria (esto se llama un backgap o pista bgap). Mientras que este algoritmo funciona bien para algunos tipos de células, tales como células HeLa 4, es una característica menos eficaz cuando se analiza la dinámica de MT en los conos de crecimiento. Esto se debe a MT pistas con frecuencia se suceden a lo largo de las mismas rutas exactas en los conos de crecimiento (a menudo siguientes a lo largo de los haces de actina F), por lo que por lo general es imposible decir si bgap vínculos son correctos. Por esta razón, no se recomienda utilizar las salidas de datos bgap en los conos de crecimiento.
A pesar de estas advertencias y problemas menoresque debe ser tenido en cuenta cuando se utiliza plusTipTracker (y la mayoría de cualquier programa de procesamiento de imágenes automatizado), este software puede ser una herramienta muy útil para el análisis de miles de cometas EB1-GFP en un período relativamente corto de tiempo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plusTipTracker software | Danuser Lab | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | This software may be hosted by another website in the future. If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site. |
| MATLAB software | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ |
References
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).
- Lee, H., et al. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. , 913-926 (2004).
- Purro, S. A., et al. Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).
- Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. Neural Explant Cultures from Xenopus laevis. Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).
- Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).
- Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).
- Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells. PLoS One. 7, e41413 (2012).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).
- Schuyler, S. C., Pellman, D. Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning. Cell. 105, 421-424 (2001).
- Mitchison, T., Kirschner, M.
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).
- Dixit, R., et al. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).
- Li, W., et al. EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells. The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).
- Maurer, S. P., et al. EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics. Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).
- Lowery, L. A., et al. Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth. Neural development. 8, 22 (2013).
- Marx, A., et al. Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules. Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).
