Summary
L', logiciel basé sur MATLAB open source, plusTipTracker, peut être utilisé pour analyser une série d'images de fluorescence marqué + conseils pour quantifier la dynamique des microtubules.
Abstract
Microtubules (MT) plus-fin-suivi protéines (+ TIP) se localisent à la plus-extrémités croissantes de MT et régulent la dynamique MT 1,2. Un des conseils les plus connus et largement utilisés-+ pour analyser la dynamique de MT est la Fin-binding protein, EB1, qui lie tous les MT ainsi que les fins de croissance, et donc, c'est un marqueur de MT polymérisation 1. De nombreuses études sur le comportement des EB1 dans les cônes de croissance ont utilisé beaucoup de temps et, les méthodes de suivi de la main assistée par ordinateur biaisées pour analyser individu MT 1-3. Notre approche consiste à quantifier les paramètres globaux de la dynamique MT en utilisant le logiciel, plusTipTracker 4, suite à l'acquisition de haute résolution, les images en direct de EB1 marqué dans les cônes de croissance embryonnaires cultivées 5. Ce logiciel est un open-source package convivial basé sur MATLAB, qui allie la détection automatique, le suivi, la visualisation et l'analyse des films de + TIP marquées par fluorescence. Ici, nous présentons le protocole d'utilisation plusTipTRâtelier pour l'analyse des comètes marquées par fluorescence TIP + en culture de Xenopus cônes de croissance laevis. Toutefois, ce logiciel peut également être utilisée pour caractériser la dynamique de MT dans divers types de cellules 8.6.
Introduction
Le but de cette méthode est d'obtenir des informations quantitatives sur les microtubules (MT) plus fin de suivi dynamique dans la vie des cônes de croissance protéines (+ TIP). MT + TIP sont un groupe de protéines qui localisent les plus-extrémités de MT 9,10. Ils effectuent une vaste gamme de fonctions pour régler les paramètres de MT instabilité dynamique 11, y compris les taux de polymérisation, catastrophe, et de sauvetage. Une méthode très utilisée pour l'analyse de la dynamique de la MT est de suivre le comportement du TIP EB1 +, qui se lie spécifiquement à la croissance de MT plus-ends 1,12. EB1 est connu pour recruter plusieurs autres protéines à la croissance de MT plus-ends 13,14, et a récemment été mis en place comme un facteur de maturation MT 15, la promotion de la croissance MT et la fréquence des catastrophes 15,16.
De nombreuses études de la dynamique MT dans les cônes de croissance ont utilisé des méthodes de suivi de la main pour mesurer les changements dans la dynamique EB1-GFP au fil du temps 1-3, comme EB1 localizatià MT ainsi que les fins peuvent être utilisés en tant que marqueur pour la polymérisation MT. Un avantage clé de l'examen de comètes EB1-GFP comme une approximation de la croissance MT est que la dynamique MT peuvent être mesurés même dans les régions de chevauchement significatif de MT. Bien que la méthode des comètes EB1-GFP suivi à la main a fourni des indications utiles sur les comportements MT 1-3, il est temps et peut être biaisée. En outre, la croissance aberrante comportements coniques sont probablement le résultat de changements minute à la dynamique du cytosquelette, en analysant seulement un petit sous-ensemble de MT (généralement nécessaire lorsque la main-tracking) peut manquer des informations importantes.
Ainsi, nous mesurons la dynamique de MT mondiaux paramètres à l'aide du logiciel, plusTipTracker 4, après l'acquisition de haute résolution, les images en direct de EB1 marqué dans les cônes de croissance embryonnaires cultivées 5. Ce logiciel, développé dans le Danuser Lab, a été utilisé dans plusieurs études qui caractérisent la dynamique MT dans divers types de cellules 6-8. Il s'agit d'un open-source, nouser-amical, emballage à base de MATLAB qui inclut la détection automatique, le suivi, la visualisation et l'analyse des films de + TIP marquées par fluorescence. Une longue liste de paramètres spécifiques de la dynamique MT sont calculées par ce logiciel (voir référence 4 pour plus de détails), mais pour l'analyse de la dynamique MT dans les cônes de croissance, les paramètres les plus utiles sont MT vitesse de voie de la croissance (en microns / minute), chemin de la croissance durée de vie (en secondes), et la longueur de la piste de croissance (en microns). Le logiciel peut être téléchargé directement depuis le site Danuser Lab (sous «Logiciel»). Alors que le Danuser Lab prend actuellement en charge une interface nouvelle pour + analyse de suivi de TIP, qui est intégré dans un logiciel appelé u-piste 2.0, le logiciel d'origine, autonome restera disponible. Les algorithmes sous-jacents entre les deux programmes sont les mêmes (au moins à partir de 2014), avec seulement une différence de l'interface et d'analyse des sorties. Pour l'utilisateur novice avec peu de MATLAB et / ou l'analyse computationnelle expérence, plusTipTracker a plus de fonctionnalités conviviales, y compris les sorties de paramètres statistiques automatisés.
Ici, nous décrivons les étapes d'analyse d'images de la dynamique EB1-GFP en culture de Xenopus cônes de croissance laevis. Ce protocole a été utilisé dans une étude récente examinant la dynamique MT 17. Voir aussi Lowery et al. 2012 5 pour obtenir des instructions détaillées sur les cônes de croissance de la culture exprimant EB1-GFP. Bien que ce papier essentiellement porté sur l'examen dynamique EB1-GFP dans les cônes de croissance, le même protocole peut être utilisé pour d'autres types de cellules 17. Pour tous les types de cellules, l'intervalle de temps entre les images doit être comprise entre 0,5-2 sec pour optimiser le suivi + TIP. Un intervalle d'au plus 4 secondes de temps entre les images est possible, mais cette augmentation des résultats en temps d'intervalle dans les erreurs de suivi supplémentaires.
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Protocol
Ce protocole et vidéo sont destinés à servir de compagnon à l'article original décrivant le logiciel plus en détail 4, ainsi que le rapport technique qui vient avec le téléchargement de logiciels sur le site Web Danuser Lab. Les lecteurs sont encouragés à examiner attentivement ces documents s'il ya des questions supplémentaires concernant l'utilisation du logiciel.
1 Avant l'analyse d'image
- Convertir chaque film en time-lapse en une séquence de TIFF (Tagged Image File Format) Les fichiers d'image. S'il ya plusieurs cônes de croissance / cellules dans un film donné, première récolte chaque cône de croissance / cellule pour créer sa propre séquence d'image.
Remarque: Ce n'est pas nécessaire, à titre individuel régions-de-intérêt (ROI) peuvent être sélectionnés dans plusTipTracker. Cependant, l'utilisation de plus petites dimensions de l'image augmente la vitesse du traitement de calcul, de sorte que cette étape est recommandée si l'espace blanc significatif dans l'image. - Enregistrez chaque série TIFF dans son propredossier "images" dans un chemin que MATLAB est réglé sur l'accès (à noter que "images" est sensible à la casse). Pour ajouter un nouveau chemin, accédez au répertoire du fichier concerné dans la fenêtre "Current Folder", faites un clic droit sur l'icône du répertoire, et sélectionnez "Ajouter à Chemin - Dossiers sélectionnés et sous-dossiers". Il est important que le dossier du logiciel plusTipTracker être ajoutée à la voie, ainsi.
2. plusTipGetTracks
Note: La première étape de l'analyse d'image est de détecter les comètes EB1-GFP, le lien entre les comètes en pistes, et de déterminer les paramètres de la dynamique des microtubules. Ceci est obtenu avec la commande "plusTipGetTracks" 4.
- Pour commencer l'analyse, l'application de MATLAB ouvert et tapez "plusTipGetTracks" dans la fenêtre de commande. Cela entraînera une nouvelle boîte de dialogue apparaît.
- Cliquez sur "créer de nouveaux projets" et choisir un (ou more) de l'image TIFF série précédente en sélectionnant les "images" appropriées dossier (ou répertoires contenant des "images" dossiers). À l'issue de cette étape, un répertoire de fichiers (roi_1) sera créé (dans le même dossier qui contient des "images") qui contiendra les futurs fichiers de données. Remarque: l'étape "Installer de nouveaux projets» peut être complété à l'avance, au cours d'une session distincte.
- Une nouvelle fenêtre apparaît: "Sélectionner un polygone, faites un clic droit sur ce dernier point, et cliquez sur« Créer un masque ". Cliquez sur "OK". La première image de la série d'images sélectionnée sera alors affiché. Utilisez la souris pour cliquer et de créer un polygone qui englobe l'ensemble du cône de croissance. Double-cliquez sur la souris pour fermer le polygone.
- Une fois le polygone a été fermé, une boîte de dialogue apparaît: «Voulez-vous sélectionner un autre retour sur investissement?" Si l'image a un autre cône de croissance à analyser, sélectionnez «Oui»; s autrementélu «Non».
- Sélectionnez les projets qui seront immédiatement analysés. Cliquez sur "Sélectionner projets" et sélectionnez le dossier (roi_X) à analyser.
- Un écran de listSelectGUI apparaît. Sélectionnez le projet (s) sur le côté gauche de l'écran et de les déplacer sur le côté droit de l'écran. Cliquez sur "OK". Choisissez un emplacement pour enregistrer la liste de projets et cliquez sur "Enregistrer".
- Sélectionnez "détection", "Suivi", et "post-traitement". Une fois ces sélections ont été effectuées, le côté droit de la boîte de dialogue sera configurable. Configurez chaque option.
- Ces paramètres sont utilisés pour relier les comètes détectées en pistes de MT. Détails pour le choix de ces paramètres de contrôle pour le suivi sont inclus sur les pages 9-10 du rapport technique PDF qui accompagne le téléchargement du logiciel; lire attentivement ce rapport en cas de problèmes. Aux fins de suivi des comètes EB1-GFP dans Xenopnous laevis cônes de croissance, utilisez les paramètres de suivi suivantes: un rayon de recherche Range (pixels) 5-12, la longueur minimale Sous-Track (frames) 3; Max Gap Longueur (cadres) 8; Max Factor retrait de 0,8, angle maximum avant 50, angle arrière Max 10, Fluctuation Rayon 2,5. Ces paramètres sont représentés sur la figure 1.
Remarque: Facteur de retrait maximum est fixé à réduire le nombre de «lacunes détectées en retard», comme des «lacunes en arrière" ne sont pas utiles à analyser dans le cadre de cônes de croissance, compte tenu des conditions de surpeuplement et des erreurs probables dans les liens de la piste. En outre, les deux angle Max Forward, ainsi que la fluctuation rayon sont définis relativement élevé, comme MT cône de croissance présentent de petites translocations fréquentes dans plus de croissances et des retraits, et l'augmentation de ces paramètres de contrôle permet à ce mouvement augmenté au cours de l'étape de liaison.- Remplissez les paramètres de post-traitement en fonction des paramètres d'acquisition d'image spécifiques souhaitées.
- Une fois que les paramètres ont été configurés, cliquez sur "Démarrer". Le logiciel fonctionne selon les paramètres ont été sélectionnés. Cela peut prendre quelques minutes à quelques heures, en fonction du nombre de projets sélectionnés et de leurs tailles. La fenêtre de commande affiche le temps restant estimé pour chaque fonction. Lorsque l'étape de plusTipGetTracks est terminée, la fenêtre de commande affiche "Terminé!"
Remarque: Une longue liste de paramètres spécifiques de la dynamique MT ont été calculés par ce logiciel (voir référence 4 pour plus de détails), mais pour l'analyse de la dynamique MT dans les cônes de croissance, les paramètres les plus utiles à examiner sont MT vitesse de voie de la croissance (en microns / minute), la voie de la croissance de vie (en secondes), et la longueur de la piste de croissance (en microns).
3. plusTipSeeTracks
Note: Maintenant que les pistes de microtubules ont été définis, la fonction "plustipSeeTracks» est utilisé pour la piste visualisation 4. Cette fonctionpeuvent fournir des multiples sorties pour la visualisation, y compris la dynamique de MT spatiales des cartes et des films de vitesse, mais ici, l'accent est mis uniquement sur l'utilisation «Track Films" pour afficher les pistes MT superposées sur les images de cône de croissance. Alors que plusTipGetTracks peuvent analyser plusieurs films à la fois, plusTipSeeTracks ne peuvent analyser un film à la fois.
- Tapez "plusTipSeeTracks" dans la fenêtre de commande.
- Après le chargement de la boîte de dialogue, cliquez sur "Select Project". Sélectionnez le répertoire parent contenant le projet de visualiser et cliquez sur "Sélectionner un dossier". Une nouvelle fenêtre apparaît: "Sélectionnez le projet que vous souhaitez visualiser". Choisissez le fichier à visualiser et cliquez sur "OK".
- Ensuite, cliquez sur "Select Saved ROI". Naviguez dans le même dossier roi_X que celle sélectionnée à l'étape précédente et sélectionnez le fichier nommé "roiYX".
- Cliquez sur "Sélectionner le répertoire de sortie" pour désigner wici MATLAB enregistrer les fichiers de visualisation de la piste. Note: Nous vous recommandons d'utiliser le même dossier qui contient le reste des données.
- Sélectionnez "Faire piste Movie" et un écran apparaît affichant toutes les pistes plusTipGetTracks calculées à partir des comètes TIP +. Cette étape permet d'économiser la série de temps suivis dans un format film, dans le fichier "allTracks_X_X_X". Il ya une option pour enregistrer le film au format AVI, sinon le format par défaut est le fichier Quicktime.mov.
4. plusTipGroupAnalysis
Remarque: Cette fonction finale est utilisée pour créer des groupes de films pour l'analyse et la comparaison de leurs paramètres de piste de MT.
- Tapez "plusTipGroupAnalysis" dans la fenêtre de commande. Pour sélectionner manuellement les groupes à comparer, d'abord de-sélectionner "groupe Auto de la hiérarchie". Ensuite, cliquez sur "Sélectionner des projets". Accédez aux répertoires parents contenant tous les dossiers roi_Xà analyser.
- Un écran de listSelectGUI apparaît. Sélectionnez tous les projets à inclure dans les groupes à partir du côté gauche de l'écran et de les déplacer sur le côté droit de l'écran. Cliquez sur "OK". Choisissez un emplacement pour enregistrer la liste de projets et cliquez sur "Enregistrer".
- Une fenêtre s'affiche: "S'il vous plaît sélectionner premier groupe de la liste". Cliquez sur "OK". La fenêtre listSelectGUI s'affiche à nouveau. Cette fois-ci, sélectionner uniquement les fichiers qui correspondent au premier groupe qui devrait être mis en commun. Cliquez sur "OK".
- Ensuite, entrez le nom du groupe, puis cliquez sur "OK". Une fenêtre s'affiche: "Choisissez un autre groupe?" Réponse en conséquence et continuer à sélectionner des groupes. Une fenêtre s'affiche: "Choisissez un emplacement pour enregistrer votre liste de groupe". Accédez à l'emplacement et cliquez sur "Enregistrer".
- Cliquez sur "Sélectionner le répertoire de sortie" pour choisir l'endroit où les dossiers de sortie serontstocké.
- Sélectionnez le type de l'analyse du groupe de mener - si les pistes de MT devraient être mises en commun pour chaque groupe ou par l'analyse cellulaire doit être effectuée. Les tests statistiques recommandées sont déjà désignés. Pour inclure toutes les pistes dans l'analyse, dé-sélectionnez «Supprimer les pistes au début / fin de film". Sinon, ayant cette case sélectionnée supprime toutes les pistes de croissance de MT qui sont en processus que le film commence ou se termine.
- Après la sélection Groupe d'analyse est faite, sélectionnez «Comparer les groupes".
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Representative Results
Grâce à ce logiciel, comme décrit ici fournira plusieurs fichiers d'informations qui permettent de quantifier la dynamique + TIP dans les cellules vivantes.
La fonction plusTipGetTracks identifie les pistes (en utilisant par exemple les paramètres présentés dans la figure 1), puis fournit des paramètres concernant les pistes TIP +. Pour afficher les informations que le logiciel a obtenu, allez dans le répertoire roi_X qui a été créé à l'étape 2.2. Le dossier "feat" contient "overlayImages", qui est une série d'images montrant les comètes détectées. L'examen de ces images à l'aide du logiciel d'analyse d'image peut démontrer la précision de la détection comète. Le dossier «méta» contient également des informations détaillées concernant les statistiques de la comète + de pointe, y compris le fichier "projData", ainsi que le fichier "Statistiques". Pour afficher le fichier "Statistiques", faites-le glisser dans une feuille de calcul ouverte d'un tableur. Ce fichier contient le calculerd paramètres microtubules pour chaque film (Figure 2). Comme indiqué plus haut, une longue liste de paramètres spécifiques de la dynamique MT sont calculées par ce logiciel (voir référence 4 pour plus de détails), y compris la vitesse de la piste de la croissance de la MT (en microns / minute), chemin de la croissance de vie (en secondes), et la croissance longueur de la piste (en microns).
La fonction plusTipSeeTracks enregistre un film des comètes à chenilles, qui peuvent être examinés en ouvrant le fichier "allTracks_X_X_X" (Figure 3).
La fonction plusTipGroupAnalysis combine plusieurs ensembles de données individuelles en groupes et crée des dossiers (Percell ou pooledData nommé, selon laquelle l'analyse est sélectionné) qui contiennent des données de paramètres de groupe, y compris les histogrammes, les complots et les feuilles de calcul pour comparer les groupes et les paramètres individuels au sein de chaque groupe (Figure 4).
Figure 1 PlusTipGetTracks paramètres utilisés pour les comètes EB1-GFP dans Xenopus cônes de croissance laevis. Cette figure montre les paramètres spécifiques pour les étapes "détection", "Suivi", et "post-traitement" qui peuvent être utilisés pour l'analyse de EB1-GFP comètes dans Xenopus cônes de croissance laevis. L'outil plusTipParamSweepGUI, disponible à l'intérieur de l'emballage plusTipTracker, peut être utilisée pour optimiser les paramètres de suivi pour d'autres organismes modèles et / ou des types de cellules 7.
Figure 2: Capture d'écran de paramètres MT obtenus à partir de l'analyse des plusTipGetTracks. Le dossier «méta», créé par plusTipGetTracks course, contient des informations sur + TIP cstatistiques Omet. En faisant glisser le fichier "Statistiques" dans un tableur, les paramètres de la dynamique des microtubules peuvent être examinées.
Figure 3 Capture d'écran de MT film de piste obtenu à partir de l'analyse des plusTipSeeTracks. PlusTipSeeTracks permet non seulement de piste de microtubules visualisation, mais sert aussi comme un outil de vérification en permettant à l'utilisateur de voir la validité des données acquises à partir plusTipGetTracks.
Figure 4 Capture d'écran de paramètres MT obtenus à partir plusTipGroupAnalysis. PlusTipGroupAnalysis offre à l'utilisateur une méthode simple pour en comparant des groupes et des paramètres individuels TREn dans chaque groupe en combinant de multiples ensembles de données individuels et générer la production statistique, qui peut être examiné dans un tableur.
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Discussion
PlusTipTracker fournit une interface utilisateur simple, graphique pour détecter rapidement et automatiquement la quasi-totalité visibles comètes EB1-GFP dans un cône de croissance cellulaire ou, le lien entre les comètes en pistes, et calculer les paramètres MT. Autres publications ont rapporté la conception de types de logiciels similaires (par exemple, Marx et al. Analyse quantitative a également utilisé des dynamiques EB1 marqués dans les cônes de croissance 18). Mais, ce logiciel semble être unique dans sa facilité d'accès, comme il est téléchargeable gratuitement depuis le site Web de la Danuser Lab, qui se spécialise dans la conception open-source, clé en main des logiciels utiles à la communauté biologique des cellules. Bien que l'accès à MATLAB est nécessaire, on n'a pas besoin d'être parfaitement familiarisé avec cette application informatique pour utiliser le logiciel. Cependant, il ya quelques points qui doivent être abordés pour la facilité d'utilisation.
Tout d'abord, l'un des problèmes les plus courants qui se posent lors de l'utilisation du software et l'application de l'ordinateur pour la première fois est en relation avec le chemin de fichier. Si cette erreur se produit (avec le message "Erreur en utilisant cd -. Argument doit contenir une chaîne d'erreur dans formatPath ..."), alors la solution la plus simple est de s'assurer que le logiciel de plusTipTracker, ainsi que le répertoire avec tous les "images" sous-répertoires, sont à la fois dans le même chemin de fichier "MATLAB". Il est préférable que ceux-ci ne sont pas dans le répertoire "Program Files", comme il a été suggéré que l'espace dans le "Program Files" nom peut être un problème. À cet égard, il est important de noter que plusTipTracker enregistre le chemin du fichier qui a été utilisé lors du calcul d'abord l'analyse des plusTipGetTracks, et en tant que tel, ce chemin de fichier doit être entretenu et que les données sont accessibles et utilisé par un autre composant du logiciel. Les fonctions plusTipGetTracks, plusTipSeeTracks, et plusTipGroupAnalysis utilisent tous le chemin du fichier original enregistré, et donc, en essayant de ctoutes ces fonctions pour un film donné, après le déplacement des fichiers vers un autre chemin, se traduira par une erreur.
Une autre erreur commune de se produire lors de l'analyse, c'est quand suivi échoue lors de l'étape de plusTipGetTracks. Cela se produira si une trame dans la série de l'image ne contient pas de comètes détectables. Ce sera complètement arrêter l'analyse et aucun post-traitement se produira. Une solution facile de contourner ce problème et permettre l'analyse de procéder, est de créer une comète maquette sur l'image dans une zone où il ne sera pas lié à tort à toutes les pistes réelles. Ce ne sera pas un impact sur les paramètres de la piste finale, comme toute comète qui n'existe pas dans un nombre minimum de trames consécutives sera filtré de l'analyse finale.
Une autre question qui peut se poser est la détection comète défectueux. Cela peut généralement être résolu en améliorant la sélection région d'intérêt dans l'étape 2.3. Il est important de tirer la région d'intérêt étroitement autour de la cellule et de ne pas tirer awrégion ider que nécessaire. Le logiciel utilise cette région pour déterminer l'arrière-plan utilisé lors de la détection comète. Si la détection comète est encore sous-optimale avec les paramètres par défaut, les paramètres peuvent être ajustés dans la fenêtre plusTipGetTracks (lors de l'étape 2.7).
Après une analyse, il est essentiel de valider les liaisons automatiques par voie oculaire, en utilisant plusTipSeeTracks. Peuvent avoir besoin d'être modifié pour réduire le nombre de faux liens de comète positifs ou faussement négatifs paramètres de suivi. Consultez la documentation de plusTipTracker 4 original ainsi que le rapport technique PDF qui accompagne le téléchargement du logiciel pour plus de détails sur l'optimisation des réglages. Les performances de ce logiciel par rapport à la main-tracking a déjà été testée dans des cellules non neuronales 4. cônes de croissance présentent un défi légèrement différente, cependant, en tant que MT cône de croissance présentent des translocations fréquentes dans toutes les directions 17, en plus de la croissance et de retrait MT. Un ISSUe qui n'a pas été trouvé à être une préoccupation majeure est de savoir si les MT serrés dans les cônes de croissance posent des difficultés de suivi 17. En tant que seul un sous-ensemble de MT sont en phase de croissance, avec EB1-GFP sur les extrémités, la résolution et le suivi individuel des comètes EB1-GFP n'était pas un problème. Cependant, il convient de noter que ces études antérieures utilisées cônes de croissance de Xenopus laevis, qui ont été spécifiquement choisies en raison de leur taille relativement grande du cône de croissance (environ 10 microns), par rapport aux autres cônes de croissance vertébrés. L'utilisation de ces cônes de croissance plus importants permet d'analyser comète EB1-GFP plus précis.
Pour évaluer l'utilité et l'exactitude de ce logiciel pour l'analyse des pistes EB1-GFP dans les cônes de croissance de Xenopus laevis, nous avons comparé l'expérience de l'utilisation de la main-plusTipTracker suivi d'une série de données identiques (données non présentées). Le temps qu'il a fallu à la main-piste comètes EB1-GFP dans un cône de croissance moyen de 39 pistes de comète (en 1 minute time-lapse series, avec 2 secondes entre chaque image) était plus de deux heures, contre deux minutes avec le logiciel. Les paramètres obtenus avec les deux méthodes sont similaires pour la vitesse de croissance de MT (7,4 microns par minute pour automatisé de suivi par rapport à 7,0 microns par minute pour la main-tracking). Cependant, pour la durée de vie de la croissance et de la longueur, un logiciel d'analyse conduit à des pistes beaucoup plus courtes (d'environ la moitié du temps et de la distance). Ceci est dû à des pistes de croissance étant divisé par le logiciel, si une comète qui entre et sort de la mise au point au fil du temps. Alors que l'œil humain peut facilement identifier que c'est la même comète, le logiciel ne fonctionne pas. Ce problème n'est pas problématique si, si l'on utilise le logiciel afin de comparer plusieurs conditions. Étant donné que les paramètres de suivi identiques sont utilisés dans toutes les conditions (et en supposant que les comètes entrent et sortent de mise au point à la même vitesse dans des conditions multiples), les durées de vie et les longueurs relatives des mesures sont encore tout à fait utiles pour la comparaison. Quant à l'analyse automatisée erreur rates, celles-ci dépendent fortement de la qualité des images. Dans des films en haute signal sur bruit, le pour cent de pistes faussement constituées ou incorrectes est dans les chiffres simples. Même dans les films de qualité inférieure (où les comètes individuelles sont encore clairement visibles à l'oeil nu, mais le bruit de fond est plus grande), les taux d'erreur sont encore assez faible (5-15%) que le temps significatif enregistré en utilisant le logiciel vaut le coûts en erreur. Cela est particulièrement le cas lors de l'analyse des centaines de cônes de croissance (60-8 cônes de croissance par l'état ont été analysés dans une étude précédente 17).
Il est important de noter que ce logiciel a été conçu pour détecter les comètes + TIP qui se lient seulement à des fins de MT croissance, comme EB1-GFP. Étant donné que les algorithmes de liaison et de suivi s'attendent à ce que les comètes n'existent que sur la polymérisation de MT, l'utilisation de ce logiciel pour analyser la dynamique d'une + TIP étiquetées par fluorescence qui se lie à la diminution MT se termine en plus à des fins de croissance conduira à des informations incorrectesen ce qui concerne les vitesses de croissance de MT calculées.
Une des caractéristiques uniques de ce logiciel par rapport à d'autres logiciels à une particule de suivi, c'est qu'il prend en compte les comportements connu de MT pour calculer des paramètres non seulement de polymérisation, mais aussi des paramètres retrait. Elle le fait par la liaison d'une comète EB1-GFP qui a disparu avec celui qui a nouvellement formée directement derrière elle dans la même trajectoire (c'est ce qu'on appelle un backgap, ou de la piste bgap). Bien que cet algorithme fonctionne bien pour certains types de cellules, comme les cellules HeLa 4, il s'agit d'une caractéristique moins efficaces dans l'analyse de la dynamique des MT dans les cônes de croissance. C'est parce que MT pistes suivre régulièrement les uns des autres le long des mêmes chemins exacts dans les cônes de croissance (souvent après le long faisceaux F-actine), et il est donc souvent impossible de dire si bgap liens sont corrects. Pour cette raison, il est recommandé de ne pas utiliser les sorties de données de bgap dans les cônes de croissance.
Malgré ces mises en garde et les questions mineuresqui doivent être pris en considération lors de l'utilisation plusTipTracker (et plus un programme de traitement d'image automatisé), ce logiciel peut être un outil très utile pour analyser des milliers de comètes EB1-GFP dans un relativement court laps de temps.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plusTipTracker software | Danuser Lab | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | This software may be hosted by another website in the future. If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site. |
| MATLAB software | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ |
References
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