Summary
המבוססת על MATLAB, חבילת תוכנות הקוד הפתוחה, plusTipTracker, ניתן להשתמש בו לסדרת תמונה של + טיפים, שכותרתו fluorescently לנתח לכמת דינמיקת microtubule.
Abstract
Microtubule (MT) בתוספת-מעקב-end חלבונים (+ טיפים) בתרגום לתוספת-סיום הגדילה של MTS ולהסדיר דינמיקת MT 1,2. אחד הטיפים הידועים ביותר ושימוש נרחב + לניתוח דינמיקת MT הוא כריכה-End החלבון, EB1, הקושר את כל תוספת-קצות MT גדלו, ובכך, מהווה סמן לפילמור MT 1. מחקרים של EB1 התנהגות בתוך קונוסים צמיחה רבים השתמשו זמן רב ו, שיטות עבודת יד מעקב בעזרת מחשב מוטה לנתח פרט MTs 1-3. הגישה שלנו היא לכמת פרמטרים הגלובליים של דינמיקת MT שימוש בחבילת התוכנה, 4 plusTipTracker, בעקבות הרכישה של רזולוציה גבוהה, תמונות בשידור חיות של EB1 מתויג בקונוסים צמיחה עובריים בתרבית 5. תוכנה זו היא חבילה מבוססת MATLAB, קוד פתוח, ידידותי למשתמש, המשלבת איתור אוטומטי, מעקב, הדמיה, וניתוח לסרטים של + טיפים, שכותרתו fluorescently. כאן, אנו מציגים הפרוטוקול לשימוש plusTipTracker לניתוח השביטים עצה + fluorescently שכותרתו בקונוסים צמיחת laevis תרבותיים צפרדעים. עם זאת, תוכנה זו יכולה לשמש גם כדי לאפיין דינמיקת MT בסוגי תאים שונים 6-8.
Introduction
מטרתה של שיטה זו היא לקבל מידע כמוני אודות microtubule (MT) בתוספת-מעקב סוף החלבון (+ טיפ) דינמיקה בחיים קונוסים צמיחה. MT + טיפים מועילים בקבוצה של חלבונים הלמקם את התוספת-הקצוות של MTS 9,10. הם מבצעים מגוון רחב של פונקציות להסדיר פרמטרים של חוסר יציבות MT הדינמי 11, כוללים שיעורים של פילמור, קטסטרופה, והצלה. שיטה המשמשת היטב אחד לניתוח דינמיקת MT היא לעקוב אחר ההתנהגות של EB1 עצה +, אשר נקשר באופן ספציפי לMT גדל בתוספת-מסתיים 1,12. EB1 ידוע לגייס כמה חלבונים אחרים לMT גדל בתוספת-מסתיים 13,14, ולאחרונה כבר נקבע כגורם התבגרות MT 15, קידום שניהם צמיחת MT ותדירות אסון 15,16.
מחקרים של דינמיקת MT בתוך קונוסים צמיחה רבים מנוצלים שיטות עבודת יד מעקב כדי למדוד שינויים בדינמיקת EB1-GFP לאורך הזמן 1-3, כlocalizati EB1לMT יכול לשמש תוספת מסתיימת כסמן לפילמור MT. יתרון עיקרי לבחינת שביטים EB1-GFP כמדד לצמיחת MT הוא שדינמיקת MT ניתן למדוד גם באזורים של החפיפה MT משמעותית. בעוד השיטה של שביטים EB1-GFP יד מעקב סיפקה תובנות שימושיות לMT התנהגויות 1-3, זה זמן רב ויכול להיות מוטה. בנוסף, כצמיחה חריגה התנהגויות קונוס עשויות התוצאה של משמרות דקות בדינמיקת cytoskeletal, ניתוח תת קבוצה קטנה בלבד של MTS (בדרך כלל נדרשות כאשר יד מעקב) עלול להחמיץ מידע משמעותי.
לפיכך, אנו מודדים פרמטרים דינמיקת MT הגלובליים באמצעות חבילת התוכנה, 4 plusTipTracker, לאחר הרכישה של רזולוציה גבוהה, תמונות בשידור חיות של EB1 מתויג בקונוסים צמיחה עובריים בתרבית 5. תוכנה זו, שפותחה במעבדת Danuser, נעשתה שימוש במספר מחקרים המאפיינים את דינמיקת MT בסוגי תאים שונים 6-8. זה קוד פתוח,אה ידידותי, חבילה מבוססת MATLAB הכוללת זיהוי אוטומטי, מעקב, הדמיה, וניתוח לסרטים של + טיפים, שכותרתו fluorescently. רשימה של פרמטרים ספציפיים של דינמיקת MT מחושבים על ידי תוכנה זו ארוכה (ראה 4 קוד לפרטים נוספים), אבל לניתוח של דינמיקת MT בקונוסים צמיחה, הפרמטרים השימושיים ביותר הם מהירות מסלול של צמיחת MT (במיקרון / דקה), מסלול של צמיחה חיים (בשניות), ואורך מסלול של צמיחה (במיקרון). את התוכנה ניתן להוריד מאתר אינטרנט המעבדה Danuser ישירות (תחת "תוכנה"). בעוד המעבדה Danuser תומכת כעת ממשק חדש לניתוח מעקב עצה +, אשר שולב לתוך חבילת תוכנה בשם u-מסלול 2.0, התוכנה המקורית, עצמאית תישאר זמינה. האלגוריתמים הבסיסיים בין שתי התוכניות הם אותם (לפחות כמו של 2014), עם רק הבדל של תפוקות ממשק וניתוח. למשתמש המתחיל עם MATLAB הקטן ו / או התנסות אנליזה חישוביתence, יש plusTipTracker תכונות ידידותי למשתמש יותר, ובכלל זה תפוקות פרמטר סטטיסטיות אוטומטיות.
כאן, אנו מתארים את השלבים לניתוח תמונות של דינמיקת EB1-GFP בקונוסים צמיחת laevis תרבותי צפרדעים. פרוטוקול זה נוצל בשנים האחרונה בעיתון בחינת דינמיקת MT 17. ראו גם אל אפלולי ואח. 2012 5 להוראות מפורטות לגבי קונוסים צמיחת culturing להביע EB1-GFP. בעוד מאמר זה התמקד בעיקר בבחינת דינמיקת EB1-GFP בקונוסים צמיחה, באותו הפרוטוקול יכול לשמש לסוגי תאים אחרים 17. לכל סוגי התאים, מרווח הזמן בין מסגרות צריך להיות בין 0.5-2 שניות למעקב עצה + אופטימלי. מרווח זמן של עד 4 שניות בין המסגרות אפשרי, אבל זה עלה תוצאות מרווח זמן בשגיאות מעקב נוספות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול והסרטון הזה נועדו לשמש כבן לוויה למאמר המקורי המתאר את חבילת התוכנה בפירוט רב יותר 4, כמו גם את הדוח הטכני שמגיע עם תוכנות להורדה באתר האינטרנט של המעבדה Danuser. קוראים מוזמנים לעיין במסמכים אלה בזהירות אם יש שאלות נוספות בנוגע לשימוש בתוכנה.
.1 לפני ניתוח תמונה
- להמיר כל סרט הזמן לשגות לתוך רצף של TIFF (פורמט קובץ תמונה שתייגת) קבצי תמונה. אם יש קונוסים צמיחה מרובים / תאים בסרט נתון, יבול ראשון כל חרוט צמיחה / תא כדי ליצור תמונה ברצף משלה.
הערה: זה אינו הכרחי, כפי שניתן לבחור אזורים של ריבית בודדים (ROI) בתוך plusTipTracker. עם זאת, שימוש בממדי תמונה קטנים יותר מגדיל את המהירות של העיבוד חישוביים, כך שלב זה מומלץ אם יש שטח ריק משמעותי בתמונה. - להציל את כל סדרת TIFF משלותיקייה בשם "תמונות" בתוך נתיב שMATLAB מוגדר גישה (שים לב כי "תמונות" היא תלויות רישיות). כדי להוסיף לדרך חדשה, לנווט לספריית קבצים הרלוונטית בחלון "התיקייה הנוכחית", לחץ לחיצה ימנית, על סמל הספרייה, ובחר באפשרות "הוסף לנתיב - תיקיות נבחרות ותת תיקיות". חשובה שתיקיית תוכנת plusTipTracker תתווסף לנתיב, כמו גם.
.2 PlusTipGetTracks
הערה: הצעד הראשון בניתוח תמונה היא לזהות את כוכבי שביט EB1-GFP, לקשר שביטים למסלולים, ולקבוע את הפרמטרים של דינמיקת microtubule. זה שהושג עם "plusTipGetTracks" הפקודה 4.
- כדי להתחיל ניתוח, יישום MATLAB פתוח והקלד "plusTipGetTracks" לתוך החלון הפקודה. זה יגרום תיבת הדו שיח חדשה להופיע.
- לחץ על "הגדרת פרויקטים חדשים" ובחר באחת (או מורה) של סדרת תמונת TIFF הקודמת על ידי בחירה "תמונות" המתאימות תיקייה (או ספריות המכילות "דימויים" תיקיות). עם השלמת שלב זה, ספריית קבצים (roi_1) ייווצר (באותה התיקייה שמכילה "תמונות") שיכילו את קבצי נתונים העתידיים. הערה: ניתן להשלים את הצעד "פרויקטים חדשים שהוקם" לפני הזמן, במהלך נפרד.
- חלון חדש יופיע: "בחר מצולע, לחץ לחיצה ימנית על הנקודה האחרונה, ולחץ על 'צור מסכה'". לחץ על "אישור". התמונה הראשונה בסדרת התמונה שנבחרה לאחר מכן ניתן תהיה מוצג. השתמש בעכבר כדי ללחוץ וליצור מצולע המקיף את מכלול חרוט הצמיחה. לחץ לחיצה כפולה על העכבר כדי לסגור את המצולע.
- ברגע שהמצולע סגור, תיבת הדו שיח תופיע: "האם אתה רוצה לבחור את ההחזר על ההשקעה אחרת?" אם התמונה יש חרוט צמיחה אחר לנתח, בחר "כן"; אחרת זההנבחר "לא".
- בחר את הפרויקטים שינותחו באופן מיידי. לחץ על "בחרו פרויקטים" ובחר את התיקייה (roi_X) כדי לנתח.
- מסך listSelectGUI יופיע. בחר את הפרויקט (ים) מהצד השמאלי של המסך ולהעביר אותן לצד ימין של המסך. לחץ על "אישור". בחר מיקום לשמירת רשימת הפרויקט ולחץ על "שמור".
- בחר באפשרות "איתור", "מעקב", ו "לאחר עיבוד". ברגע שבחירות אלה נעשו, בצד ימין של תיבת הדו שיח יהפוך להגדרה. קביעת תצורה של כל אופציה.
- פרמטרים אלה משמשים כדי לקשר שביטים זוהו במסלולי MT. פרטים עבור בחירת הפרמטרים שליטה אלה למעקב כלולים בדפי 9-10 של טכני דווח PDF המלווה את הורדת חבילת תוכנה; לקרוא דוח זה בזהירות אם בעיות הם נתקלו. לצורך מעקב אחר השביטים EB1-GFP בXenopשלנו laevis קונוסים צמיחה, להשתמש בהגדרות המעקב הבאות: חפש טווח רדיוס (פיקסלים) 5-12, אורך תת מסלול מינימאלי (מסגרות) 3; אורך מקסימאלי גאפ (מסגרות) 8; מקס כיווץ פקטור 0.8, זווית מקס קדימה 50, זווית מקס אחורה 10, תנודות רדיוס 2.5. הגדרות אלה שמוצגים באיור 1.
הערה: מקס כיווץ פקטור מוגדר לצמצם את מספר "הפערים לאחור" מזוהים, כמו "פערים אחורה" אינם מועילים לניתוח בהקשר של קונוסים צמיחה, בהתחשב בתנאים הצפופים וצפויות השגיאות בקשרי מסלול. בנוסף, שניהם זווית מקס קדימה, כמו גם שינויי הרדיוס מוגדר גבוהה יחסית, כMTs חרוט צמיחת תערוכת טרנסלוקציות תכופה קטנה בנוסף לגידולים וshrinkages, וחיזוק הגדרות שליטה אמורה, מאפשר תנועה מוגברת במהלך שלב ההצמדה.- מלא את פוסט עיבוד הגדרות בהתאם להגדרות רכישת תמונה הספציפיות הרצויות.
- ברגע שההגדרות הוגדרו, לחץ על "התחל". התוכנה תפעל לפי הגדרות שנבחרו. פעולה זו עשויה להימשך דקות עד שעות, תלוי במספר פרויקטים שנבחרו והגדלים שלהם. Command Window מציג הזמן המשוער שנותר לכל פונקציה. כאשר צעד plusTipGetTracks הושלם, החלון הפקודה יציג את "סיים!"
הערה: רשימה של פרמטרים ספציפיים של דינמיקת MT יש עכשיו כבר מחושבים על ידי תוכנה זו ארוכה (ראה 4 קוד לפרטים נוספים), אבל לניתוח של דינמיקת MT בקונוסים צמיחה, הפרמטרים השימושיים ביותר לבחינה הן מהירות מסלול של צמיחת MT (במיקרון / דקה), חיים במסלול צמיחה (בשניות), ואורך מסלול של צמיחה (במיקרון).
.3 PlusTipSeeTracks
הערה: כעת, לאחר שמסלולי microtubule הוגדרו, "plustipSeeTracks" הפונקציה משמש להדמיה מסלול 4. פונקציה זויכול לספק במספר יציאות להדמיה, כוללים מפות דינמיקת MT במרחב ובסרטים במהירות, אבל כאן, הדגש הוא אך ורק על שימוש ב" סרטי מסלול "כדי להציג מסלולי MT על גבי התמונות חרוטים צמיחה. בעוד plusTipGetTracks יכול לנתח סרטים מרובים בו זמנית, plusTipSeeTracks יכול רק לנתח סרט אחד בכל פעם.
- הקלד "plusTipSeeTracks" לתוך החלון הפקודה.
- לאחר טעינת תיבת הדו שיח, לחץ על "בחר פרויקט". בחר את ספריית האב המכילה את הפרויקט לדמיין ולחץ על "בחר תיקייה". חלון חדש יופיע: "בחר בפרויקט שאתה רוצה לדמיין". בחר את הקובץ לדמיין ולחץ על "אישור".
- לאחר מכן, לחץ על "בחר שמורים את ההחזר על ההשקעה". נווט לאותה התיקייה roi_X כאחד שנבחר בשלב הקודם ובחר את הקובץ בשם "roiYX".
- לחץ על "בחר ספריית פלט" לייעד wכאן MATLAB יחסוך קבצי ההדמיה המסלול. שים לב: אנו ממליצים על שימוש באותה התיקייה שמכילה את שאר הנתונים.
- בחר באפשרות "הפוך מסלול סרט" ומסך יופיע בו מוצגות כל plusTipGetTracks המסלולים מחושב משביטי עצה +. פעולה זו תשמור את סדרת זמן במעקב בפורמט סרט, בקובץ "allTracks_X_X_X". יש אפשרות לשמירת הסרט כAVI, אחרת פורמט ברירת המחדל הוא כקובץ Quicktime.mov.
.4 PlusTipGroupAnalysis
הערה: הפונקציה אחרונה זו משמשת ליצירת קבוצות של סרטים לניתוח והשוואה של הפרמטרים מסלול MT שלהם.
- הקלד "plusTipGroupAnalysis" לתוך החלון הפקודה. כדי לבחור באופן ידני את הקבוצות להשוואה, הראשון דה בחר "קבוצה אוטומטית מהיררכיה". לאחר מכן, לחץ על "פרויקטים בחרו". נווט אל ספריות אב המכילות את כל תיקיות roi_Xכדי לנתח.
- מסך listSelectGUI יופיע. בחר את כל הפרויקטים שייכללו בקבוצות מהצד השמאלי של המסך ולהעביר אותן לצד ימין של המסך. לחץ על "אישור". בחר מיקום לשמירת רשימת הפרויקט ולחץ על "שמור".
- יופיע חלון: "אנא בחר קבוצה ראשונה מהרשימה". לחץ על "אישור". חלון listSelectGUI יציג שוב. הפעם, בחרו רק את קבצים שמתאימים לקבוצה הראשונה שצריך להיות ויקווה יחד. לחץ על "אישור".
- לאחר מכן, הזן את שם הקבוצה, ולחץ על "אישור". יופיע חלון: "בחר בקבוצה אחרת?" תשובה בהתאם, ולהמשיך בחירת קבוצות. יופיע חלון: "בחר מיקום לשמירת רשימת הקבוצות שלך". נווט אל המיקום ולחץ על "שמור".
- לחץ על "מדריך פלט בחר" לבחור בי תיקיות הפלט תהיהמאוחסן.
- בחר איזה סוג של ניתוח קבוצה לנהל - אם מסלולי MT יש ייקוו לכל קבוצה או לניתוח תא צריכה להתבצע. המבחנים הסטטיסטיים המומלצים כבר מיועדים. כדי לכלול את כל המסלולים בניתוח, בטל את הבחירה "הסר מסלולים בתחילת / סיום של סרט". אחרת, יש תיבה זו נבחרה מסיר את כל מסלולי צמיחת MT שנמצאים בתהליך כסרט מתחיל או מסתיים.
- לאחר בחירת ניתוח הקבוצה מורכבת, בחר "השוואת קבוצות".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שימוש בתוכנה זו, כמתואר כאן יספק כמה קבצי מידע שלכמת דינמיקת עצה + בתאים חיים.
PlusTipGetTracks הפונקציה מזהה את הרצועות (באמצעות הגדרות דוגמא מוצגות באיור 1), ולאחר מכן מספק פרמטרים לגבי מסלולי עצה +. כדי להציג את המידע שהתוכנה קיבלה, ללכת לספריית roi_X שיצרה בשלב 2.2. התיקייה "ההישג" מכילה "overlayImages", שהיא סדרה של תמונות המציגות את כוכבי השביט שזוהה. בחינת תמונות אלה באמצעות תוכנת ניתוח תמונה יכול להוכיח את הדיוק של זיהוי שביט. התיקייה "meta" מכילה גם מידע מפורט לגבי סטטיסטיקת שביט עצה +, כולל את הקובץ "projData", כמו גם את הקובץ "סטטיסטיקה". כדי להציג את קובץ "סטטיסטיקה", לגרור אותה לגיליון עבודה פתוח של יישום גיליון אלקטרוני. קובץ זה מכיל המחשבוןפרמטרים microtubule ד עבור כל סרט (איור 2). כפי שצוין לעיל, רשימה של פרמטרים ספציפיים של דינמיקת MT ארוכה מחושבת על ידי תוכנה זו (ראה 4 קוד לפרטים נוספים), כולל מהירות מסלול של צמיחת MT (במיקרון / דקה), חיים במסלול צמיחה (בשניות), ואורך מסלול של צמיחה (במיקרון).
PlusTipSeeTracks הפונקציה חוסך סרט של השביטים במעקב, אשר יכול להיבדק על ידי פתיחת הקובץ "allTracks_X_X_X" (איור 3).
PlusTipGroupAnalysis הפונקציה משלב ערכות נתונים בודדות מרובות לקבוצות ויוצרת תיקיות (perCell בשם או pooledData, תלוי באיזה ניתוח נבחר) המכילים נתונים פרמטר קבוצה, כולל היסטוגרמות, מגרשים, וגיליונות אלקטרוניים להשוואת קבוצות ופרמטרים בודדים בתוך כל אחת מקבוצות (איור 4).
הגדרות .1 PlusTipGetTracks איור משמשות לשביטי EB1-GFP בקונוסים צמיחת laevis Xenopus. נתון זה מראה את ההגדרות הספציפיות עבור "זיהוי", "מעקב", ו "לאחר עיבוד" צעדים שניתן להשתמש בו לניתוח EB1-GFP שביטים בקונוסים צמיחת laevis Xenopus. כלי plusTipParamSweepGUI, זמין בתוך חבילת plusTipTracker, ניתן להשתמש כדי לייעל את הגדרות מעקב לאורגניזמים מודל אחרים ו / או סוגי תאים 7.
איור 2 מסך של פרמטרים MT המתקבלים מניתוח plusTipGetTracks. התיקייה "meta", נוצר על ידי plusTipGetTracks פועל, מכיל מידע בנוגע ל+ TIP גסטטיסטיקת omet. על ידי גרירת הקובץ "סטטיסטיקה" ליישום גיליון אלקטרוני, ניתן לבחון פרמטרים דינמיקת microtubule.
מסך איור 3 של סרט מסלול MT המתקבל מניתוח plusTipSeeTracks. PlusTipSeeTracks מאפשר לא רק להדמיה מסלול microtubule, אלא גם משמש ככלי אימות על ידי המאפשר למשתמש להציג את תקפויות הנתונים שנרכשו מplusTipGetTracks.
איור 4 מסך של פרמטרים MT המתקבלים מplusTipGroupAnalysis. PlusTipGroupAnalysis מציע למשתמש שיטה פשוטה לקבוצות השוואה ופרמטרים בודדים between בתוך כל קבוצה על ידי שילוב של ערכות נתונים בודדים מרובות וייצור תפוקה סטטיסטית, אשר יכול להיבחן ביישום גיליון אלקטרוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PlusTipTracker מספק ממשק משתמש פשוט, גרפי כדי לזהות במהירות ובאופן אוטומטי שביטים EB1-GFP כמעט כל גלויים בקונוס תא או צמיחה, לקשר שביטים למסלולים, ולחשב פרמטרים MT. פרסומים אחרים דיווחו העיצוב של סוגים דומים של תוכנה (לדוגמא, מרקס et al. ניתוח כמו גם מנוצל של דינמיקת EB1 מתויגת בקונוסים צמיחה 18). אבל, תוכנה זו נראית ייחודית בה להקל על גישה, כפי שהוא להורדה חופשית מאתר האינטרנט של המעבדה Danuser, המתמחה בעיצוב בקוד פתוח, Turn-Key תוכנות שימושיות לקהילת התא הביולוגית. בעוד נדרשת גישה לMATLAB, אף אחד לא צריך להיות מוכר באופן מלא עם יישום מחשב זה כדי לנצל את התוכנה. עם זאת, יש כמה נקודות שצריכות להתייחס לנוחות שימוש.
קודם כל, אחד הנושאים הנפוצים ביותר שעולים בעת שימוש בתוכנה עבור מtware ויישום מחשב בפעם הראשונה קשור לנתיב הקובץ. אם שגיאה זו מתרחשת (עם הפקודה "השגיאה באמצעות דיסק -. טיעון חייב לכלול מחרוזת שגיאה בformatPath ..."), ואז הפתרון הקל ביותר הוא להבטיח שתוכנת plusTipTracker, כמו גם הספרייה עם כל "התמונות" תיקיות המשנה, שניהם באותו נתיב הקובץ "MATLAB". זה הכי טוב אם אלה אינם בספרייה "Program Files", כפי שהוא כבר הציע שהרווח בשם "Program Files" עשוי להיות בעיה. התייחס לזה, חשוב לשים לב כי plusTipTracker חוסך את נתיב הקובץ שנוצל בעת חישוב ניתוח plusTipGetTracks הראשון, ובתור שכזה, נתיב קובץ זה חייב להישמר כאשר הנתונים אלה הוא לגשת ומועסקים על ידי רכיב אחר בתוכנה. PlusTipGetTracks פונקציות, plusTipSeeTracks, וכל plusTipGroupAnalysis להשתמש בנתיב הקובץ שנשמר המקורי, ובכך, מנסה גכל הפונקציות האלה לסרט נתון, לאחר שעבר את הקבצים לנתיב אחר, תגרום לשגיאה.
שגיאה נפוצה נוספת להתרחש במהלך הניתוח היא כאשר המעקב נכשל במהלך שלב plusTipGetTracks. זה יתרחש אם מסגרת בסדרת התמונה לא מכילה שביטים לזיהוי. זה יבלום לחלוטין את הניתוח ולא לאחר עיבוד יתרחש. תיקון קל לעקוף בעיה זו ולאפשר הניתוח כדי להמשיך, הוא ליצור שביט מדומה על התמונה באזור שבו לא יהיה קשור באופן שגוי לכל מסלולים בפועל. הדבר לא ישפיע על הפרמטרים מסלול הסופיים, כמו כל כוכב שביט שאינו קיים במספר מינימאלי של מסגרות רצופות יהיה מסונן מהניתוח הסופי.
נושא אחר אחת שעלולה להתעורר הוא גילוי כוכב שביט פגום. זה בדרך כלל ניתן לתקן על ידי שיפור בחירת האזור של הריבית בשלב 2.3. חשוב לצייר את האזור של עניין בשיתוף פעולה הדוק סביב התא ולא לצייר awאזור אידר מנחוץ. התוכנה משתמשת באזור זה על מנת לקבוע את הרקע השתמש במהלך איתור כוכב שביט. אם גילוי כוכב שביט הוא עדיין לא אופטימלי עם הגדרות ברירת המחדל, יכולות להיות מותאמות להגדרות בחלון plusTipGetTracks (במהלך שלב 2.7).
לאחר כל ניתוח, זה קריטי כדי לאמת את קשרי מסלול האוטומטיים על ידי העין, באמצעות plusTipSeeTracks. הגדרות מעקב ייתכן שתצטרכנה להיות שונה כדי להפחית את מספרם של קשרי שביט כוזבים חיוביים או שליליים שגויים. עיין בתיעוד המקורי plusTipTracker 4, כמו גם הטכני דווח PDF המלווה את הורדת תוכנה לפרטים על אופטימיזציה של ההגדרות. הביצועים של תוכנה זו בהשוואה ליד המעקב כבר בעבר נבדקו בתאים שאינם עצביים 4. קונוסים צמיחה מהווים אתגר מעט שונה, לעומת זאת, כMTs החרוט צמיחת תערוכת טרנסלוקציות תכופה לכל הכיוונים 17, בנוסף לצמיחת MT והצטמקות. הנפק אחדדואר שלא נמצא להיות דאגה העיקרית הוא האם MTs צפוף בקונוסים צמיחה להקשות מעקב 17. כמו שרק קבוצת משנה של MTS נמצא בשלב הגובר, עם EB1-GFP בקצוות, פתרון ומעקב אחר השביטים EB1-GFP בודדים לא היו בעייתיים. עם זאת, יש לציין כי מחקרים אלה קודמים שימשו קונוסים צמיחת laevis Xenopus, אשר נבחרו במיוחד בגלל גודל חרוט צמיחה הגדול יחסית שלהם (כ 10 מיקרון), בהשוואה לקונוסים צמיחת חוליות אחרות. באמצעות קונוסים צמיחה גדולים אלה מאפשר ניתוח שביט EB1-GFP מדויק יותר.
כדי להעריך את השירות ודיוק של תוכנה זו לניתוח מסלולי EB1-GFP בקונוסים צמיחת laevis Xenopus, השווינו את החוויה של שימוש בplusTipTracker עם יד מעקב של סדרת נתונים זהה (מידע לא מוצג). הזמן שנדרש למסור מסלול שביטים EB1-GFP בחרוט צמיחה ממוצע של 39 מסלולי כוכב שביט (בסרי הזמן לשגות דקה 1es, עם 2 שניות בין כל מסגרת) היה יותר משעות, בהשוואה לשתי דקות עם התוכנה. הפרמטרים שהושגו עם שתי השיטות היו דומים למהירות צמיחת MT (7.4 מיקרון לדקה לאוטומטי מעקב לעומת 7.0 מיקרון לדקה עבור יד מעקב). עם זאת, לכל חיים צמיחה ואורך, ניתוח תוכנה מוביל למסלולים קצרים יותר באופן משמעותי (בכמחצית הזמן ומרחק). זאת בשל מסלולי צמיחה מתפצלים על ידי התוכנה אם כוכב שביט נכנס ויוצא מהפוקוס לאורך זמן. בעוד שהעין האנושית יכולה לזהות בקלות שזה אותו השביט, התוכנה לא. אם כי בעיה זו היא לא בעייתית, אם הוא משתמש בתוכנה על מנת להשוות מספר תנאים. מאז פרמטרים מעקב זהים משמשים לכל התנאים (ובהנחה שהשביטים להיכנס ומחוץ לפוקוס באותו השיעור במספר תנאים), ולאחר מכן את החיים ואורכים יחסי עדיין מדידות די שימושיות להשוואה. באשר לחולדת שגיאת ניתוח אוטומטיתes, אלה תלויים במידה רבה באיכות של התמונות. בסרטי אות לרעש גבוהים, אחוזים ממסלולי misjoined או שגויים הוא בחד הספרתי. אפילו בסרטים באיכות נמוכה יותר (שבו כוכבי שביט בודדים עדיין נראים לעין על ידי עין באופן ברור, אך רעשי הרקע הוא גדולים יותר), שיעורי השגיאה עדיין נמוכים מספיק (5-15%) שהזמן המשמעותי שנשמר על ידי שימוש בתוכנה הוא שווה עלויות בטעות. הדבר נכון במיוחד במקרה כאשר מאות ניתוח של קונוסים צמיחה (60-8 צמיחת קונוסים למצב נותחו במחקר קודם 17).
חשוב לציין כי תוכנה זו נועדה לגילוי שביטים עצה + שרק נקשרים לקצות MT גובר, כגון EB1-GFP. בהתחשב בכך שאלגוריתמי ההצמדה ומעקב מצפים שכוכבי שביט קיימים רק על polymerizing MTS, באמצעות תוכנה זו כדי לנתח את הדינמיקה של TIP + fluorescently- מתויג שנקשר למתכווץ MT מסתיים בנוסף לסיום גדילה יוביל למידע שגוילגבי מהירויות צמיחת MT מחושבים.
אחת התכונות הייחודיות של תוכנה זו בהשוואה לתוכנת חלקיק יחיד מעקב אחר, הוא שזה לוקח בהתנהגויות MT חשבון ידועות לחישוב פרמטרים לא רק פילמור, אלא גם פרמטרים הצטמקות. הוא עושה זאת על ידי קישור שביט EB1-GFP שנעלם עם אחד שהוקם זה עתה ישירות מאחוריה באותו המסלול (זה נקרא backgap, או מסלול bgap). בעוד אלגוריתם זה עובד היטב עבור סוגים מסוימים של תאים, כגון תאי הלה 4, זה הוא תכונה פחות יעילה בעת ניתוח דינמיקת MT בקונוסים צמיחה. סיבה לכך הוא MT עוקב לעתים קרובות בצע אחד את השני לאורך בדיוק את אותו השבילים בקונוסים צמיחה (לעתים קרובות הבא יחד חבילות F-אקטין), וכך הוא בדרך כלל אי אפשר לדעת אם bgap קשרים נכונים. מסיבה זו, לא מומלץ לנצל את תפוקות נתונים bgap בקונוסים צמיחה.
למרות אזהרות קטין אלה ונושאיםאשר חייב להילקח בחשבון בעת השימוש בplusTipTracker (ורוב כל תכנית עיבוד תמונה אוטומטית), תוכנה זו יכולה להיות כלי שימושי מאוד לניתוח אלפי שביטים EB1-GFP בסכום זמן קצר יחסית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plusTipTracker software | Danuser Lab | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | This software may be hosted by another website in the future. If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site. |
| MATLAB software | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ |
References
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).
- Lee, H., et al. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. , 913-926 (2004).
- Purro, S. A., et al. Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).
- Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. Neural Explant Cultures from Xenopus laevis. Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).
- Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).
- Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).
- Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells. PLoS One. 7, e41413 (2012).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).
- Schuyler, S. C., Pellman, D. Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning. Cell. 105, 421-424 (2001).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).
- Dixit, R., et al. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).
- Li, W., et al. EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells. The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).
- Maurer, S. P., et al. EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics. Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).
- Lowery, L. A., et al. Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth. Neural development. 8, 22 (2013).
- Marx, A., et al. Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules. Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).
