Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.
Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a ‘targeting’ vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.
Lo sviluppo di tecnologie di targeting dei geni ha consentito la costruzione di linee cellulari e modelli di topo per studiare diversi sistemi biologici 1-3. Una chiave prima fase nella modifica di una sequenza genomica è il progetto e la costruzione di un gene targeting vettore 4. Vettori targeting sono costrutti plasmide che portano l'allele di interesse contenente le modifiche desiderate (s) affiancato da un marcatore di selezione (ad esempio, la neomicina), e lunghe regioni genomiche necessarie per un efficiente ricombinazione omologa in cellule di mammifero 5. Modificazione genetica precisa si ottiene l'introduzione del vettore targeting in staminali embrionali (ES) cellule o cellule somatiche 6 7, in cui la ricombinazione omologa tra tratti identici di sequenza di DNA sul vettore targeting ei risultati locus genomico nel trasferimento della modificazione previsto al genoma mediante conversione genica 8. Tale modificellule ed ES possono essere iniettati in blastocisti di topo per produrre prole (chimere) che possono poi trasmettere questi alleli modificati tramite la linea germinale 9. Un percorso alternativo per produrre topi transgenici comporta la microiniezione di un vettore di espressione genica in singoli zigoti unicellulari topo, che porta l'integrazione casuale del vettore nel genoma del mouse 10. I metodi tradizionali di costruzione del vettore si sono basati su tradizionali 'copia e incolla' clonazione utilizzando enzimi di restrizione e ligasi del DNA per clonare le diverse marcatore di selezione e frammenti genomici in un vettore backbone. Tuttavia, un fattore limitante intrinseca della clonazione tradizionale è il posizionamento e la scelta di siti di restrizione, soprattutto con sequenze di DNA più lunghe. Ciò richiede spesso più passaggi subcloning ed introduce anche sequenze di DNA estraneo nel vettore, che spesso porta ad una minore efficienza di gene targeting.
Recombineering (eng recombinogenicineering) è una tecnologia di ingegneria DNA che supera queste limitazioni utilizzando la ricombinazione omologa (HR) mediato da proteine fago ricombinazione a E. coli 11,12. Da una regione di una sequenza omologa può servire come substrato di recombineering, i vincoli di disponibilità di siti di restrizione vengono rimossi. Le grandi sequenze di DNA possono essere facilmente modificati direttamente in vivo, quindi anche preservare la loro integrità strutturale 13. Recombineering è molto efficiente con omologie brevi (50 bp) 14 e, pertanto, le braccia di omologia (HA) possono essere comodamente incorporati in sequenze oligo sintetici. In un esperimento recombineering tipico, un oligo o un DNA a doppia elica (dsDNA) frammento contenente HA è elettroporate in recombineering competente E. coli contenenti il bersaglio sia situato sul cromosoma o su un plasmide 15. Il potenziale di ricombinazione è conferito dalla espressione inducibile della rec Redombination proteine del fago 16,17 o le proteine RecET del rac profago 18. Il exonuclease Red / Rece converte dsDNA lineare ad un singolo filamento di DNA (ssDNA) intermedio, che viene poi legato dal suo partner, Rosso / Rect, un singolo filamento di proteine ricottura (SSAP) 19. La ricottura di un lungo ssDNA o una breve oligo alla sua sequenza bersaglio complementare si verifica sul filamento in ritardo della forcella replica e conduce all'incorporazione della sequenza al sito bersaglio. Fanalino di filo ssDNA ricombinazione è la base della elevata efficienza di recombineering e può essere descritto dal 'beta' modello ricombinazione 20,21.
Un flusso di lavoro tipico recombineering per costruire un vettore gene targeting coinvolge uno dei due seguenti percorsi. Una via comporta subcloning regione genomica desiderata da un clone BAC topo in un plasmide seguita dall'inserimento sequenziale di siti di ricombinazione LoxP, un marcatore di selezione <sup> 22 ecc, o il percorso alternativo comporta mira il BAC locus genomico con i diversi elementi di targeting vettore di vari cicli di recombineering 10,23 e poi subcloning il locus modificato in un plasmide mediante riparazione gap clonazione 24,25. Variazioni su questo tema sono state utilizzate in diversi gasdotti ad alta produttività recombineering nell'ambito di programmi di produzione di grandi dimensioni del mouse 26,27. Tuttavia, queste procedure comportano fasi complicate e lunghe, richiedono l'uso di vettori specializzati e E. coli ceppi (ad esempio, cellule che esprimono Cre) e utilizzare uno o più stadi intermedi di purificazione del DNA vettoriale e ri-trasformazione (Tabella 1). Subcloning più inserimento (SPI) è una tecnica recombineering romanzo che combina beta ricombinazione e riparazione gap clonazione in un unico processo (Figura 1). Montaggio vettore SPI è semplice, veloce e flessibile e offre un miglioramento significativo recombi serieneering approcci (Tabella 1). Qui, dimostriamo la facilità e l'utilità di usare SPI per diverse applicazioni della costruzione del vettore con una particolare enfasi sulla costruzione di disegni vettoriali non standard e stimolanti. Casi di test inclusi la costruzione di una fluorescenza giornalista knockin vettore, una duplice espressione proteica tag Knockin vettore, un BAC fluorescenza giornalista vettoriale e un ko vettore di condizionale. Questi esaminate variamente il requisito di localizzare un recettore sulla superficie cellulare, purificare un complesso proteico nucleare o condizionatamente ablazione l'espressione di un gene.
Costruzione di linee di cellule ES e modelli di topo è storicamente coinvolto gene targeting utilizzando costrutti plasmide che contenevano l'allele 4 modificato. Tuttavia, la costruzione di questi complessi vettori gene targeting ha dimostrato di essere un collo di bottiglia significativo nella produzione tempestiva di tali modelli. Lo sviluppo di strategie di costruzione vettore recombineering base ha permesso di disegni vettoriali migliorate e assemblaggio vettore più efficiente. Tuttavia, protocolli recombineering attuali coinvolgono ancora più passaggi, richiedono intermedio di purificazione plasmide e utilizzano diversi ceppi batterici. Subcloning oltre inserimento offre un nuovo approccio alla costruzione del vettore che può essere eseguita in un evento elettroporazione nel ceppo ospite BAC residente. L'utilità di SPI in gene targeting stato qui testato in una varietà di applicazioni edili vettoriale. In tutti i casi esaminati qui, SPI ha dimostrato di essere efficiente e il plasmide ricombinante corretto è stato prodotto.Nella maggioranza dei casi, le molteplici cassette diversi stati correttamente inseriti nel vettore targeting. Grandi cassette di DNA e vettori erano facilmente alloggiati nel protocollo SPI e dimostrato la flessibilità del sistema.
SPI si basa sull'utilizzo di lunghe sequenze di omologia e fosforotioato (PTO) Protezione delle cassette di DNA lineari. Modifica PTO conferisce protezione da esonucleasi al DNA lineare 20,21 e la lunga HA aumenta l'efficienza di ricombinazione per consentire multiplexing. Tuttavia, la sintesi di sequenze oligo lunghi aumenta le possibilità di accumulare errori soprattutto le eliminazioni. Le mutazioni nel oligo può essere particolarmente dannoso se coprono le regioni codificanti proteine. Sequenziamento del DNA attraverso il HA e copre l'intera lunghezza della cassetta inserita è altamente raccomandato per eliminare cloni con alterazioni sequenza. L'uso di un sistema di DNA polimerasi ad alta fedeltà viene anche suggerito di evitare l'introduzione di unerrori y PCR. La lunghezza e la composizione del HA del plasmide subcloning è più critica rispetto a quella della cassetta di inserimento (dati non mostrati). Per applicazioni particolarmente sensibili come la costruzione di vettori Knockin, dove eventuali mutazioni in regioni esone non sono tollerati, l'HA della cassetta di inserimento può essere ridotto (50-120 bp) per evitare problemi connessi con lunghe oligo. La cassetta di inserimento può anche essere lasciata phosphorothioated non modificato o doppia (dove la conoscenza della direzione di replica non è disponibile). Ma multiplexing in questi casi richiede ancora molto protetto HA plasmidi subcloning. Un avvertimento di questa particolare strategia è l'abbassamento di efficienza multiplexing che possono potenzialmente influire clonazione SPI a diversi loci.
La lunghezza della cassetta inserimento e il plasmide subcloning è un altro parametro importante nella clonazione SPI. Molecole di DNA più grandi elettroporazione meno efficiente e l'effetto è cumulativo, dato il requirement introdurre tutte le cassette nella stessa cella (dati non mostrati). Multiplexing è più efficiente con cassette di inserimento più piccoli. DNA frammenti maggiore di 3 kb anche porre un limite elaborazione ssDNA Red mediata, che è più efficace fino a 3 kb 30. Cassette di inserimento superiori a 3 kb sono dual resecato e ricombinano meno efficiente attraverso una beta percorso indipendente 20. Pertanto, lo screening di colonie sufficienti a identificare il clone corretta diventa importante in questi casi. Una durata più lunga di ricombinazione dopo elettroporazione aumenta anche le possibilità di recupero del corretto clone in esercizi SPI difficili. Fino a quattro cassette piccole (<1,5 kb) possono essere inseriti simultaneamente con il processo di SPI, se l'efficienza multiplexing diminuisce con ciascuna cassetta aggiuntiva (dati non mostrati). Tuttavia, questo riflette il risultato di un esperimento ottimale SPI ed è opportuno considerare i limiti di multiplexing utilizzando molte grandi cassette. </p>
Lo sviluppo di strumenti di editing del genoma come cluster brevi ripetizioni palindromiche regolarmente intervallati (CRISPR) sistema endonuclease -cas9 ha permesso la creazione di nuove modifiche del genoma e ha portato a più efficiente di ingegneria del genoma 36. Tuttavia, queste nuove tecnologie sono integrate vettori gene targeting piuttosto che soppiantato. Si prevede che il sistema CRISPR-cas potrebbe sostituire la selezione antibiotica e ulteriormente affinare il protocollo recombineering multiplex.
The authors have nothing to disclose.
T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
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Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |