Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.
Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a ‘targeting’ vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.
Развитие генных технологий, направленных на позволило строительство клеточных линий и моделей мышей, чтобы исследовать различные биологические системы 1-3. Первым ключевым этапом в модификации геномной последовательности проектирование и строительство гена вектора направленного 4. Ориентация векторы плазмидные конструкции, которые несут аллель интерес, содержащие целевой модификации (ы) фланкированные маркера селекции (например, неомицин) и длинные геномные области, необходимые для эффективного гомологичной рекомбинации в клетках млекопитающего 5. Точное модификации гена достигается путем введения вектора направленного в эмбриональных стволовых (ЭС) клеток 6 или 7 соматических клеток, в результате чего гомологичной рекомбинации между идентичными участками ДНК-последовательности на адресным переносчиком и геномные Результаты локусе передачи предполагаемого модификации в геноме по конверсии генов 8. Такое modifiред ЭС клетки могут быть введены в бластоцисты мыши, чтобы производить потомство (химеры), которые могут затем передать эти измененные аллели через зародышевую линию 9. Альтернативный путь для получения трансгенных мышей предполагает микроинъекции вектора экспрессии генов в одноклеточных зигот мыши, что приводит к случайной интеграции вектора в геном мыши 10. Традиционные методы формирования вектора полагались на обычных "вырезать и вставить 'клонирования с использованием ферментов рестрикции и лигазы ДНК, чтобы клонировать другого маркера выбора и геномных фрагментов в вектор позвоночника. Тем не менее, присущие ограничивающим фактором традиционных клонирования является позиционирование и выбор сайтов рестрикции, особенно с более длинных последовательностей ДНК. Это часто требует нескольких шагов Пересев а также вводит посторонние последовательности ДНК в вектор, который часто приводит к снижению эффективности генного таргетинга.
Recombineering (recombinogenic ENGineering) является ДНК инженерные технологии, которая преодолевает эти ограничения с помощью гомологичной рекомбинации (HR), опосредованного фага рекомбинации белков в E. палочки клетки 11,12. Поскольку любой участок гомологичной последовательности может служить в качестве субстрата recombineering, ограничения доступности сайтов рестрикции удаляются. Большие последовательности ДНК могут быть легко изменены непосредственно в живом организме, таким образом, также сохраняя свою структурную целостность 13. Recombineering очень эффективно с короткими гомологии (50 п.н.) 14 и, следовательно, плечами гомологии (HA) может быть легко включены в синтетические последовательности олиго. В типичной recombineering эксперимента, олиго или двухцепочечной ДНК (дц) фрагмент, содержащий га электропорации в recombineering компетентным Е. палочки клетки, содержащие цели, находящейся либо на хромосоме или на плазмиде 15. Рекомбинация потенциал присуждается индуцируемой экспрессии Красной рекную комбинацию белков фага 16,17 или на RecET белки РАК профага 18. Красный / Rece экзонуклеазную преобразует линейные диДНК к одноцепочечной ДНК (оцДНК) промежуточное соединение, которое затем связывается с его партнером, красный / прямоугольник, одноцепочечной белка отжига (SSAP) 19. Отжиг длительного оцДНК или короткого олигонуклеотида к его комплементарной последовательностью-мишенью происходит на отстающей цепи репликативной вилки и приводит к включению последовательности в сайте-мишени. Отстающей нити оцДНК рекомбинации является основой высокой эффективности recombineering и может быть описана "бета" рекомбинация модели 20,21.
Типичный recombineering рабочий процесс, чтобы построить ген ориентации вектора включает в себя один из двух следующих путей. Один маршрут включает субклонирования желаемого геномной область из мышиного клона ВАС в плазмиду с последующим последовательным включением LoxP рекомбинации сайтов, селективный маркер <sдо> 22 и т.д., или альтернативный маршрут включает в себя ориентированные на ВАС геномного локуса с различными таргетинг векторных элементов по нескольким раундов recombineering 10,23, а затем субклонированием модифицированный локус в плазмиду путем ремонта зазора клонирования 24,25. Вариации на эту тему были использованы в различных высокой пропускной recombineering трубопроводов в рамках программы производства большого мыши 26,27. Тем не менее, эти процедуры включают сложный и длительный этапы, требуют использования специализированных векторов и Е. палочки штаммов (например, клетки, экспрессирующие Cre) и использовать один или несколько промежуточных шагов вектора очистки ДНК и повторного трансформации (таблица 1). Субклонирование плюс вставки (SPI) является новый метод recombineering, что сочетает в себе бета-рекомбинации и ремонт зазора клонирования в единый процесс (рис 1). Вектор сборка SPI является простым, быстрым и гибким, и предлагает значительное улучшение на стандартной recombineering подходов (таблица 1). Здесь мы демонстрируем легкость и практичность использования SPI для разных вектор строительных работ с особым акцентом на построении нестандартные и сложные векторных. Тестовые случаи включали в себя строительство флуоресцентного вектора репортер Достучаться до, двойной выражение меченый белок Достучаться вектор, БАК флуоресцентный репортер вектор и вектор условной нокаутом. Эти рассмотрены разному требование, чтобы локализовать рецептор клеточной поверхности, очистить комплекс ядерного белка или условно удалять экспрессию гена.
Строительство ЭС клеточных линий и моделей мышей исторически вовлечен ген целей с помощью плазмиды конструкций, которые содержали модифицированный аллель 4. Тем не менее, строительство этих сложных ген, направленных векторов оказалось значительное узким местом в своевременном изготовлении таких моделей. Развитие recombineering стратегий, основанных на вектор строительных позволило улучшенные векторных и более эффективным вектором сборки. Тем не менее, настоящие протоколы recombineering еще включать в себя несколько шагов, нуждающихся в промежуточных очистки плазмидной и использовать различные штаммы бактерий. Субклонирование плюс введение предлагает новый подход к вектору конструкции, которая может быть выполнена в одном случае электропорации в BAC принимающей житель напряжения. Полезность SPI в планировании гена был испытан здесь в различных векторных строительства. Во всех случаях, рассмотренных здесь, SPI оказалась эффективной и правильной рекомбинантную плазмиду получали.В большинстве случаев, нескольких различных кассеты были правильно вставлены в направл ющего вектора. Большие кассеты ДНК и векторы легко размещается в протоколе SPI и продемонстрировали гибкость этой системы.
SPI основана на использовании длинных последовательностей гомологии и фосфоротиоат (ВОМ) защиты линейных кассеты ДНК. Модификация ВОМ обеспечивает защиту от экзонуклеазами линейной ДНК 20,21 и долго HA увеличивает эффективность рекомбинации, чтобы позволить мультиплексирование. Тем не менее, синтез длинных последовательностей олигонуклеотидов повышает шансы накопления ошибка позиционирования особенно удаления. Мутации в олиго может быть особенно вредно, если они охватывают кодирующей белок области. Секвенирование ДНК по ГК и покрытия полной длины вставленной кассете настоятельно рекомендуется устранить клонов с каких-либо изменений последовательностей. Использование системы ДНК-полимеразы высокой точности также предложил, чтобы избежать введенияОшибки у ПЦР. Длина и состав ГК субклонирования плазмиды является более важным по отношению к тому, что кассеты вставки (данные не показаны). Для особо чувствительных к задержкам приложений, таких как строительство Достучаться векторов, где любые мутации в экзоне регионов не допускаются, HA кассеты вставки может быть сокращен (50-120 б.п.), чтобы избежать проблем, связанных с длинными олиго. Кассету можно также будут изменены или двойной phosphorothioated (где знания о направлении репликации не доступен). Но мультиплексирования в этих случаях по-прежнему требует длительного защищены HA Пересев плазмиды. Предостережение данном стратегии снижения мультиплексирования эффективности, которые потенциально могут повлиять на SPI клонирование в разных локусах.
Длина вставки кассеты и субклонирования плазмиды является еще одним важным параметром в SPI клонирования. Большие молекулы ДНК электропорации менее эффективно, а эффект носит кумулятивный характер, учитывая Reбованием ввести все кассеты в одной и той же клетке (данные не показаны). Мультиплексирование является наиболее эффективным при меньших кассет для вставки. Фрагментов ДНК больше, чем 3 кб также устанавливают предел Красный опосредованного обработки оцДНК, который является наиболее эффективным до 3 т.п.н. 30. Вставка кассеты, превышающие 3 Кб двойной Резецированная и рекомбинируют менее эффективно с помощью бета-независимого пути 20. Таким образом, скрининг достаточных колоний Для определения правильного клон становится важным в этих случаях. Большая продолжительность рекомбинации после электропорации также увеличивает шансы на выздоровление правильного клона в сложных SPI упражнений. До четырех небольших кассет (<1,5 кб) могут быть вставлены одновременно с процессом SPI, хотя эффективность уплотнения уменьшается с каждым дополнительным кассеты (данные не показаны). Тем не менее, это отражает результат оптимального эксперимента SPI и желательно обратить внимание на ограничения мультиплексирования при использовании многих крупных кассет. </р>
Разработка инструментов редактирования генома как кластерных регулярно interspaced коротких палиндромных повторов (CRISPR) -cas9 эндонуклеазы система позволила создания новых модификаций генома, что привело к более эффективному генной инженерии 36. Тем не менее, эти новые технологии дополняются генного таргетинга векторы, а не вытеснили их. Предполагается, что система CRISPR-CAS может заменить выбор антибиотиков и дальнейшего совершенствования протокола мультиплексирования recombineering.
The authors have nothing to disclose.
T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
|
Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |