Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.
Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a ‘targeting’ vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.
Utviklingen av genet målrettingsteknologier har aktivert bygging av cellelinjer og musemodeller for å undersøke ulike biologiske systemer 1-3. Et viktig første trinn i ombygging av en genomisk sekvens er design og bygging av et gen målretting vektor 4. Målretting vektorer er plasmidkonstruksjoner som bærer allelet av interesse som inneholder de ønskede endringer (s) flankert av en seleksjonsmarkør (f.eks neomycin), og lange genomiske regioner som kreves for effektiv homolog rekombinasjon i pattedyrceller 5. Presis gen modifikasjon blir oppnådd ved innføring av det målsøkende vektor inn i embryonale stamceller (ES-celler) 6 eller somatiske celler 7, hvorved homolog rekombinasjon mellom like strekninger av DNA-sekvensen i vektoren målretting og de genomiske locus resulterer i overføring av den tilsiktede modifikasjon til genomet av genet konvertering 8. Slik modified ES-celler kan bli injisert i mus blastocyster til å produsere avkom (kimærer) som deretter overfører disse modifiserte alleler via kimlinje 9. En alternativ rute for å fremstille transgene mus som involverer mikroinjeksjon av et gen i ekspresjonsvektoren encellede mus zygoter, noe som fører til tilfeldig integrasjon av vektoren i musegenomet 10. Tradisjonelle metoder for vektor konstruksjon har stolt på konvensjonelle "klipp og lim" kloning ved hjelp av restriksjonsenzymer og DNA ligaser å klone forskjellig seleksjonsmarkør og genomiske fragmenter inn i en vektor ryggrad. Men en iboende begrensende faktor på tradisjonell kloning er posisjonering og valg av restriksjonsseter, spesielt med lengre DNA-sekvenser. Dette nødvendiggjør ofte flere subkloning trinn og introduserer også fremmede DNA-sekvenser i vektoren, noe som ofte fører til en lavere effektivitet av gen-målretting.
Recombineering (recombinogenic engineering) er en DNA engineering teknologi som overvinner disse begrensningene ved hjelp av homolog rekombinasjon (HR) mediert av fag rekombinasjon proteiner i E. coli-celler 11,12. Siden en region av en homolog sekvens kan tjene som et substrat av recombineering, er begrensninger av tilgjengeligheten av restriksjonsseter fjernes. Store DNA-sekvenser kan sømløst modifiseres direkte in vivo, og dermed også bevare sin strukturelle integritet 13. Recombineering er meget effektiv med korte homologier (50 bp) 14 og derfor homologi armer (HA) kan hensiktsmessig inkorporeres i syntetiske oligo-sekvenser. I et typisk eksperiment recombineering, en oligo- eller et dobbelt-trådet DNA (dsDNA) fragment inneholdende HA blir elektroporert inn i kompetente E. recombineering coli-celler inneholdende målet ligger enten på kromosomet eller på et plasmid 15. Rekombinasjon potensialet er gitt av induserbar uttrykk for Red recombination proteiner av fagen 16,17 eller RecET proteiner av rac profag 18. Røde / reče exonuclease konverterer lineære dsDNA til et enkelttrådet DNA (ssDNA) middels, som deretter bundet av sin partner, Rød / RECT, en enkelt-strandet annealing protein (SSAP) 19. Annealing av en lang eller en kort ssDNA oligo til dens komplementære target-sekvensen foregår på lagging tråd av replikasjons gaffelen og fører til inkorporering av sekvensen ved målstedet. Lagging tråd ssDNA rekombinasjon er grunnlaget for den høye effektiviteten av recombineering og kan beskrives ved "beta" rekombinasjon modell 20,21.
En typisk recombineering arbeidsflyt for å bygge et gen rettet vektor omfatter en av de to følgende ruter. En rute omfatter subkloning ønsket genomisk region fra et muse BAC-klon i et plasmid fulgt av sekvensiell innføring av loxP rekombinasjonsseter, en seleksjonsmarkør <sopp> 22 mm, eller den alternative ruten innebærer rettet mot BAC genomisk locus med de ulike målretting vektor elementer ved flere runder med recombineering 10,23 og deretter subkloning av modifiserte locus inn i et plasmid ved gap reparasjon kloning 24,25. Variasjoner over dette temaet har vært brukt i ulike high-throughput recombineering rørledninger som en del av stor museproduksjonsprogrammer 26,27. Imidlertid er disse fremgangsmåtene involverer kompliserte og omstendelige trinn, som krever bruk av spesialiserte vektorer og E. coli-stammer (f.eks Cre uttrykkende celler), og utnytter en eller flere mellomliggende trinn av vektor DNA rensing og re-transformasjon (tabell 1). Subkloning pluss innsetting (SPI) er en ny teknikk som kombinerer recombineering beta rekombinasjon og gapet reparasjon kloning inn i en enkelt prosess (figur 1). SPI vektor monteringen er enkel, rask og fleksibel og gir betydelig forbedring på standard recombimekanikk tilnærminger (tabell 1). Her viser vi den enkle og nytten av å bruke SPI for ulike vektor byggesøknader med særlig vekt på å konstruere ikke-standard og utfordrende vektor design. Test tilfeller omfattet bygging av et fluorescerende reporter Knockin vektor, en dual merket protein uttrykk Knockin vektor, en BAC fluorescerende reporter vektor og en betinget knockout vektor. Disse undersøkt vekslet kravet om å lokalisere en celleoverflatereseptor, rense en atomproteinkompleks eller betinget ablate ekspresjonen av et gen.
Bygging av ES cellelinjer og musemodeller har historisk involvert genet målretting hjelp plasmidkonstruksjoner som inneholdt den modifiserte allelet 4. Imidlertid har konstruksjon av disse komplekse gen rettet mot svektorer viste seg å være en signifikant flaskehals i riktig fremstilling av slike modeller. Utviklingen av recombineering basert vektorbygge strategier har tillatt forbedrede vektor design og mer effektiv vektor montering. Likevel, dagens recombineering protokoller fortsatt involverer flere trinn, krever middels plasmid rensing og bruke ulike bakteriestammer. Subkloning pluss innsetting tilbyr en ny tilnærming til vektorkonstruksjon som kan utføres i en elektroporering arrangementet i den fastboende BAC vertsstammen. Nytten av SPI i genet målretting ble testet her i en rekke vektorkonstruksjons applikasjoner. I alle tilfeller som ble undersøkt her, SPI vist seg å være effektiv, og den korrekte rekombinant plasmid ble fremstilt.I de fleste tilfellene ble de flere forskjellige kassetter korrekt satt i målretting vektor. Store DNA kassetter og vektorer ble enkelt innlemmes i SPI-protokollen og demonstrerte fleksibiliteten i dette systemet.
SPI er avhengig av bruk av lange homologi sekvenser og fosfortioat (PTO) beskyttelse av de lineære DNA-kassetter. PTO modifikasjon confers beskyttelse mot eksonukleaser til det lineære DNA 20,21 og den lange HA øker effektiviteten rekombinasjon for å tillate multipleksing. Imidlertid syntese av lengre oligo-sekvenser øker sjansene for å akkumulere feil særlig delesjoner. Mutasjoner i oligo kan være særlig skadelig hvis de dekker protein-kodende regioner. DNA-sekvensering på tvers av HA og dekker full lengde på den innsatte kassetten er sterkt anbefalt å eliminere kloner med noen sekvensendringer. Anvendelse av et høy-fi-DNA-polymerase-systemet er også foreslått for å unngå innføring av eny PCR feil. Lengden og sammensetningen av HA for subkloning plasmid er mer kritisk i forhold til den for innsetting kassetten (data ikke vist). For spesielt sensitive applikasjoner som bygging av Knockin vektorer, hvor eventuelle mutasjoner i ekson regioner ikke blir tolerert, kan HA for innsettings kassett forkortes (50-120 bp) for å unngå problemer i forbindelse med lange oligos. Innførings kassetten kan også stå umodifisert eller dobbelt phosphorothioated (hvor kunnskap om retningen av replikasjon er ikke tilgjengelig). Men multipleksing i disse tilfellene fortsatt krever lang beskyttet HA Subkloning plasmider. En påminnelse av denne strategien er senking av multipleksing effektivitet som potensielt kan påvirke SPI kloning på forskjellige loci.
Lengden av innførings kassett og subkloning plasmidet er en annen viktig parameter i SPI kloning. Større DNA-molekyler electroporate mindre effektivt og effekten er kumulativ, gitt rekravet for å innføre alle kassettene i den samme cellen (data ikke vist). Multipleksing er mest effektiv med mindre innsetting kassetter. DNA fragmenter større enn 3 kb også plassere en grense på Red mediert ssDNA behandling, som er mest effektive opp til 3 kb 30. Innsetting kassetter som overstiger 3 kb er dual resected og rekombinerer mindre effektivt via en beta uavhengig bane 20. Derfor blir screening av tilstrekkelige kolonier for å identifisere den riktige klone viktig i disse tilfellene. En lengre varighet av rekombinasjon post elektroporering øker også sjansene for utvinning av riktig klone i vanskelige SPI øvelser. Opp til fire små kassetter (<1,5 kb) kan settes inn samtidig med SPI prosessen, selv om multipleksing virkningsgrad avtar med hver ekstra kassett (data ikke vist). Imidlertid gjenspeiler dette utfallet av en optimal SPI eksperiment, og det er tilrådelig å vurdere grensene for multipleksing ved hjelp av mange store kassetter. </p>
Utviklingen av genom redigeringsverktøy som klynget regelmessig avbrutt av korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) -cas9 endonuclease systemet har aktivert etableringen av nye genom modifikasjoner og har ført til mer effektiv genom ingeniør 36. Imidlertid har disse nyere teknologi suppleres gene targeting vektorer snarere enn fortrengt dem. Det er tenkt at CRISPR-cas system kan erstatte antibiotika utvalg og ytterligere forbedre multipleks recombineering protokollen.
The authors have nothing to disclose.
T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
|
Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |