Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.
Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a ‘targeting’ vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.
Utvecklingen av genmålsökning teknik har gjort det möjligt att bygga cellinjer och musmodeller för att undersöka olika biologiska system 1-3. En viktig första etapp i modifiering av en genomsekvens är design och konstruktion av en gen målvektor 4. Inriktning vektorer är plasmidkonstruktioner som bär allelen av intresse innehåller de önskade ändringarna (s) flankerad av en selektionsmarkör (t.ex. neomycin), och långa iska regioner som krävs för en effektiv homolog rekombination i däggdjursceller 5. Exakt genmodifiering uppnås genom införandet av målsökningsvektom i embryonala stamceller (ES-celler) 6 eller somatiska celler 7, varvid homolog rekombination mellan identiska sträckor av DNA-sekvens på målsökningsvektom och iska locus leder överföringen av den avsedda ändringen till genomet genom genomvandling 8. Sådan modified ES-celler kan injiceras i musblastocyster att producera avkommor (chimärer) som sedan kan överföra dessa modifierade alleler via könsceller 9. En alternativ väg för att producera transgena möss involverar mikroinjektion av en gen-expressionsvektor i encelliga mus zygoter, vilket leder till slumpmässig integration av vektorn i musgenomet 10. Traditionella metoder för vektorkonstruktion har förlitat sig på konventionella "klippa och klistra" kloning med hjälp av restriktionsenzymer och DNA-ligaser att klona de olika urvalsmarkör och genomiska fragment i en vektor ryggrad. Emellertid är en inneboende begränsande faktor av traditionell kloning placeringen och val av restriktionsställen, i synnerhet med längre DNA-sekvenser. Detta kräver ofta flera subkloning steg och även introducerar främmande DNA-sekvenser i vektorn, vilket ofta leder till en lägre verkningsgrad genmålsökning.
Recombineering (rekombinogena engineering) är ett DNA-teknik som övervinner dessa begränsningar genom homolog rekombination (HR) medierad av fag rekombinationsproteiner i E. coli-celler 11,12. Eftersom varje region av en homolog sekvens kan tjäna som ett substrat för recombineering, är de begränsningar av tillgängligheten av restriktionsställen avlägsnas. Stora DNA-sekvenser kan smidigt modifieras direkt in vivo, således även bevarar sin strukturella integritet 13. Recombineering är mycket effektivt med korta homologier (50 bp) 14 och därför homologiarmar (HA) kan lämpligen införlivas i syntetiska oligo sekvenser. I ett typiskt recombineering experiment, en oligo eller en dubbelsträngad DNA (dsDNA) fragment innehållande HA elektroporation till recombineering kompetenta E. coli-celler innehållande målet belägen antingen på kromosomen eller på en plasmid 15. Den rekombination potentialen förlänas genom inducerbart uttryck av röda recombination proteiner av fag 16,17 eller recET proteiner av rac profag 18. Den röda / RecE exonukleas omvandlar linjära dsDNA till en enda DNA (ssDNA) mellan, som sedan är bunden av sin partner, Röd / RecT, ett enkelsträngat glödgning protein (RR) 19. Glödgningen av en lång ssDNA eller en kort oligo till dess komplementära målsekvens inträffar på den släpande strängen av replikationsgaffeln och leder till införlivandet av sekvensen vid målstället. Släpande sträng ssDNA rekombination är grunden för den höga effektiviteten i recombineering och kan beskrivas med den "beta" rekombination modell 20,21.
Ett typiskt recombineering arbetsflöde för att bygga en riktad genmodifiering vektor involverar någon av de två följande vägar. En rutt innebär subkloning önskad iska regionen från en mus BAC-klon i en plasmid följt av sekventiell insättning av loxP rekombineringsställen, en selektionsmarkör <supp> 22 mm, eller den alternativa vägen involverar inriktning BAC iska locus med olika inriktning vektorelement genom flera omgångar av recombineering 10,23 och sedan subkloning den modifierade locus i en plasmid med gap reparation kloning 24,25. Variationer på detta tema har använts i olika hög genomströmning recombineering rörledningar som en del av stora mus produktionsprogram 26,27. Men dessa förfaranden involverar komplicerade och utdragna scener, kräver användning av specialiserade vektorer och E. coli-stammar (t.ex. Cre-uttryckande celler) och utnyttja ett eller flera mellanliggande steg av vektor DNA-rening och återtransformationen (tabell 1). Subkloning plus insättning (SPI) är en ny recombineering teknik som kombinerar beta rekombination och gapet reparation kloning i en enda process (Figur 1). SPI vektorenhet är enkel, snabb och flexibel och erbjuder betydande förbättringar på standard recombineering närmar (tabell 1). Här visar vi hur lätt och nyttan av att använda SPI för olika vektorbyggapplikationer med särskild tonvikt på att bygga icke-standardiserade och utmanande vektordesigner. Testfall inkluderade konstruktionen av en fluorescerande reporter knockin vektor, en dubbel märkt protein uttryck knockin vektor, en BAC fluorescerande reportervektor och en villkorlig knockout-vektor. Dessa undersöktes omväxlande kravet att lokalisera en cellytereceptor, rena ett nukleärt protein-komplex eller villkor abiadera uttrycket av en gen.
Konstruktion av ES cellinjer och musmodeller har historiskt involverade genmålinriktning använder plasmidkonstruktioner som innehöll den modifierade allelen 4. Däremot har byggandet av dessa komplexa gen målstyrningsvektorer visat sig vara en betydande flaskhals i tid produktion av sådana modeller. Utvecklingen av recombineering baserad vektor byggstrategier har tillåtit förbättrade vektor mönster och effektivare vektorenhet. Trots nuvarande recombineering protokoll som fortfarande involverar flera steg, kräver mellanliggande plasmidrening och använder olika bakteriestammar. Subkloning plus insättning erbjuder ett nytt sätt att vektorkonstruktion som kan utföras i en elektro händelse i den bofasta BAC värdstam. Användbarheten av SPI i genmålinriktning testades här i en mängd olika vektorkonstruktionstillämpningar. I samtliga fall som undersöktes här visade SPI att vara effektiv och den korrekta rekombinanta plasmiden producerades.I majoriteten av fallen, var de multipla olika kassetter korrekt insatt i målsökningsvektom. Stora DNA-kassetter och vektorer var lätt rymmas i SPI-protokollet och demonstrerade flexibiliteten i detta system.
SPI bygger på användning av långa homologisekvenser och fosfortioat (PTO) skydd av linjära DNA-kassetter. PTO modifiering ger skydd mot exonukleaser till linjära DNA 20,21 och den långa HA ökar rekombinationseffektivitet att tillåta multiplexering. Dock ökar syntes av längre oligo sekvenser chanserna att ackumulera fel speciellt strykningar. Mutationer i oligo kan vara särskilt skadligt om de täcker protein kodande regioner. DNA-sekvensering över HA och täcker fullängds av den insatta kassetten rekommenderas att eliminera kloner med eventuella sekvensförändringar. Användning av en high-fidelity DNA-polymeras systemet föreslås också för att undvika införandet av eny PCR fel. Längden och sammansättningen av HA av subkloning plasmiden är mer kritisk i förhållande till den hos insättningskassetten (data ej visade). För särskilt känsliga applikationer som byggandet av Knockin vektorer, där eventuella mutationer i exonregioner inte tolereras, kan HA av insättningskassetten kortas (50-120 bp) för att undvika problem i samband med långa oligonukleotider. Införings kassetten kan också lämnas omodifierade eller dubbel phosphorothioated (där kunskap om riktningen för replikering är inte tillgänglig). Men multiplexering i dessa fall fortfarande kräver långa skyddade HA subkloning plasmider. En varning för denna strategi är en sänkning av multiplexering effektivitet som potentiellt kan påverka SPI kloning vid olika loci.
Längden av införings kassetten och subkloning plasmiden är en annan viktig parameter i SPI kloning. Större DNA-molekyler electroporate mindre effektivt och effekten är kumulativ, med tanke på den reBehovet att införa alla kassetter i samma cell (data ej visade). Multiplexing är mest effektiva med mindre insättnings kassetter. DNA fragment större än 3 kb placera också en gräns för Red medierad ssDNA bearbetning, vilket är mest effektiva upp till 3 kb 30. Inser kassetter överstigande 3 kb är dubbelt resekterade och kombinera mindre effektivt via en beta oberoende väg 20. Därför blir screening av tillräckliga kolonier för att identifiera den rätta klonen viktigt i dessa fall. En längre duration av rekombination efter elektroporering ökar också chanserna för återhämtning av den korrekta klonen i svåra SPI övningar. Upp till fyra små kassetter (<1,5 kb) kan sättas in samtidigt med SPI processen, även om multiplexering effektiviteten minskar med varje ytterligare kassett (data ej visade). Detta återspeglar dock resultatet av en optimal SPI experiment och det är lämpligt att överväga gränserna för multiplexering när många stora kassetter. </p>
Utvecklingen av genomredigeringsverktyg som klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (CRISPR) -cas9 endonukleas systemet har möjliggjort skapandet av nya genom modifieringar och har lett till effektivare genom engineering 36. Emellertid har dessa nyare teknik kompletteras genmålinriktning vektorer stället ersatt dem. Det är tänkt att den CRISPR-cas systemet kunde ersätta antibiotikaselektion och ytterligare förfina multiplex recombineering protokollet.
The authors have nothing to disclose.
T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
|
Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |