Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.
Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a ‘targeting’ vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.
De ontwikkeling van gen targetingtechnologieën is de constructie van cellijnen en diermodellen nodig om verschillende biologische systemen 1-3 onderzoeken. Een belangrijke eerste stap in de wijziging van een genomische sequentie is het ontwerp en de bouw van een gen-targeting vector 4. Richtende vectoren zijn plasmide constructen die het allel van belang dat de gewenste veranderingen (s) geflankeerd door een selectiemerker (bijvoorbeeld neomycine) dragen, en lange genomische regio's die voor efficiënte homologe recombinatie in zoogdiercellen 5. Precieze genmodifcatie wordt bereikt door de introductie van de targeting vector in embryonale stamcellen (ES cellen) 6 of somatische cellen 7, waarbij homologe recombinatie tussen identieke stukken DNA sequentie op de targeting vector en het genomische locus in de overdracht van de beoogde modificatie het genoom van genconversie 8. Dergelijke wijzigined ES cellen kunnen worden geïnjecteerd in blastocysten van de muis om nageslacht (chimeren) produceren die vervolgens kan doorgeven deze gemodificeerde allelen via de kiemlijn 9. Een alternatieve route om transgene muizen te produceren omvat de micro-injectie van een gen expressievector in eencellige zygoten muizen, wat leidt tot de willekeurige integratie van de vector in het muizengenoom 10. Traditionele methoden van vector bouw hebben vertrouwd op conventionele 'knippen en plakken' klonen met behulp van restrictie-enzymen en DNA ligases om de verschillende selectie marker en genomische fragmenten in een vector backbone klonen. Echter, een inherente beperkende factor traditionele klonen is de positionering en keuze van restrictieplaatsen, vooral bij langere DNA-sequenties. Dit vereist vaak meerdere subklonering stappen en voert ook vreemde DNA sequenties in de vector, wat vaak leidt tot een lagere efficiëntie van gen targeting.
Recombineering (recombinogene engineering) is een DNA-techniek technologie die deze beperkingen overwint door het gebruik van homologe recombinatie (HR) gemedieerd door faag recombinatie eiwitten in E. coli cellen 11,12. Aangezien elk gebied van een homologe sequentie kan dienen als een substraat van recombineering, worden de beperkingen van de beschikbaarheid van restrictieplaatsen verwijderd. Grote DNA-sequenties kunnen naadloos direct worden gemodificeerd in vivo, dus ook behouden hun structurele integriteit 13. Recombineering is zeer efficiënt met korte homologieën (50 bp) 14 en derhalve homologie-armen (HA) kan gemakkelijk worden opgenomen in synthetische oligo sequenties. In een typisch experiment recombineering, een oligo of dubbelstrengs DNA (dsDNA) fragment met HA wordt geëlektroporeerd in competente E. recombineering coli-cellen met het doel zich ofwel op het chromosoom of op een plasmide 15. De recombinatie mogelijk wordt door induceerbare expressie van het Red rec toegekendombination eiwitten van de faag 16,17 of recET eiwitten van de rac profaag 18. De rode / exonuclease RecE zet lineair dsDNA een enkelstrengs DNA (ssDNA) tussenproduct, dat vervolgens door zijn partner, Rood / RecT, een enkelstrengs annealing eiwit (SSAP) 19 gebonden. Hybridisatie van een ssDNA lange of korte oligo met zijn complementaire doelsequentie plaatsvindt op de achterblijvende streng van de replicatie vork en leidt tot de integratie van de sequentie op de doelplaats. Achterblijvende streng ssDNA recombinatie is de basis van het hoge rendement van recombineering en kan worden beschreven door de 'beta' recombinatie model 20,21.
Een typische recombineering werkstroom bouwen een gen richtende vector omvat een van de volgende twee routes. Een route omvat subkloneren het gewenste genomisch gebied van een muis BAC-kloon in een plasmide, gevolgd door de opeenvolgende inbrengen van LoxP recombinatie locaties, een selectiemerker <sup> 22 enz., of de alternatieve route gaat richten op de BAC genoomplaats met de verschillende targeting vector elementen door meerdere rondes van recombineering 10,23 en vervolgens subkloning de gemodificeerde locus in een plasmide door kloof reparatie klonen 24,25. Variaties op dit thema zijn gebruikt in diverse high-throughput recombineering pijpleidingen als onderdeel van grote muis productieprogramma's 26,27. Echter, deze procedures te betrekken ingewikkelde en langdurige stages, vereisen het gebruik van gespecialiseerde vectoren en E. coli stammen (bijvoorbeeld Cre tot expressie brengende cellen) en gebruiken een of meer tussenstappen van vector DNA zuivering en opnieuw verwerkt (tabel 1). Subkloneren plus insertie (SPI) is een nieuwe techniek die recombineering beta recombinatie en gap reparatie klonering in één proces (Figuur 1) combineert. SPI vector montage is eenvoudig, snel en flexibel en biedt een aanzienlijke verbetering ten opzichte van standaard recombieerd benadert (tabel 1). Hier tonen we het gemak en het nut van het gebruik van SPI voor verschillende vector bouwtoepassingen met een bijzondere nadruk op de bouw van niet-standaard en uitdagende vector ontwerpen. Test gevallen omvatte de constructie van een fluorescerende reporter knockin vector, een dubbel gemerkt eiwit expressie knockin vector, een BAC fluorescente reporter vector en een conditionele knockout vector. Daarin worden afwisselend de verplichting een celoppervlak receptor lokaliseren, zuiveren een nucleair eiwit complex of voorwaardelijk ablateren de expressie van een gen.
Bouw van ES cellijnen en muismodellen is historisch betrokken gentargeting behulp plasmideconstructen dat de gewijzigde allel 4 bevatte. De constructie van deze complexe gen richtende vectoren blijkt een belangrijk knelpunt bij de tijdige productie van dergelijke modellen. De ontwikkeling van recombineering gebaseerd vectorconstructie strategieën heeft toegestaan verbeterde vector ontwerpen en efficiënter vector montage. Toch huidige recombineering protocollen nog steeds te betrekken meerdere stappen, vereisen tussenliggende plasmidezuivering en maken gebruik van verschillende bacteriestammen. Subkloneren plus insertie biedt een nieuwe benadering vector constructie die kan worden uitgevoerd in één elektroporatie gebeurtenis in de resident BAC gastheerstam. Het nut van SPI gen targeting werd hier getest in verschillende vector bouwtoepassingen. In alle gevallen hier onderzocht, SPI blijkt efficiënt te werken en de juiste recombinante plasmide werd geproduceerd.In de meeste gevallen werden de meerdere verschillende cassettes correct in de targeting vector. Grote DNA cassettes en vectoren werden gemakkelijk ondergebracht in de SPI protocol en toonde de flexibiliteit van het systeem.
SPI gebaseerd op het gebruik van lange homologie sequenties en fosforothioaat (PTO) bescherming van het lineaire DNA-cassettes. PTO modificatie bescherming biedt tegen exonucleases de lineaire DNA 20,21 en de lange HA verhoogt recombinatie efficiëntie multiplexing mogelijk. Echter, de synthese van langere oligo sequenties verhoogt de kans op fouten accumuleren bijzonder deleties. Mutaties in de oligo kan bijzonder schadelijk zijn wanneer zij de voor eiwit coderende gebieden. DNA sequentiebepaling over de HA en over de volledige lengte van het ingebrachte cassette wordt sterk aanbevolen om klonen met alle sequentieveranderingen elimineren. Het gebruik van een high-fidelity DNA polymerase systeem wordt ook voorgesteld om invoering van een te vermijdeny PCR fouten. De lengte en samenstelling van de HA van de subklonering plasmide kritischer ten opzichte van die van de insertie cassette (gegevens niet getoond). Voor bijzonder gevoelige toepassingen zoals de bouw van Knockin vectoren, waarbij elke mutatie in exon regio's niet worden getolereerd, kan de HA van het inbrengen cassette worden ingekort (50-120 bp) tot problemen in verband met de lange oligo's te vermijden. De insertie cassette kan ook worden overgelaten ongemodificeerd of dubbele phosphorothioated (waarbij kennis van de richting van replicatie niet beschikbaar). Maar multiplexen in deze gevallen nog steeds vereist lang beschermd HA subkloning plasmiden. Een nadeel van deze specifieke strategie is de verlaging van multiplexing efficiëntie die mogelijk invloed SPI klonen op verschillende loci.
De lengte van de insertie cassette en subklonering plasmide is een andere belangrijke parameter in SPI klonen. Grotere DNA-moleculen electroporate minder efficiënt en het effect is cumulatief, gezien de requirement alle cassettes in dezelfde cel voeren (data niet getoond). Multiplexing het meest efficiënt met kleinere inbrengen cassettes. DNA fragmenten groter dan 3 kb een beperking Red gemedieerde ssDNA verwerking, die het meest efficiënt tot 3 kb 30 ook plaats. Inbrengen cassettes van meer dan 3 kb zijn dual gereseceerde en minder efficiënt recombineren via een beta onafhankelijke route 20. Daarom screening voldoende kolonies het correcte kloon te identificeren wordt belangrijk in deze gevallen. Een langere duur van de recombinatie na elektroporatie verhoogt ook de kans op herstel van de juiste kloon in moeilijke SPI oefeningen. Tot vier kleine cassettes (<1,5 kb) tegelijkertijd worden ingebracht met het SPI proces, hoewel het multiplexen efficiëntie afneemt met elke extra cassette (gegevens niet getoond). Echter, dit weerspiegelt het resultaat van een optimale SPI experiment is het raadzaam om de grenzen van multiplexing overwegen bij gebruik veel grote cassettes. </p>
De ontwikkeling van genoom editing tools zoals geclusterd regelmatig afgewisseld korte palindroom herhalingen (CRISPR) -cas9 endonuclease systeem is de creatie van nieuwe genoom aanpassingen mogelijk gemaakt en heeft geleid tot een efficiëntere genoom techniek 36. Echter, deze nieuwere technologieën gentargeting vectoren aangevuld plaats verdrongen hen. Het is de bedoeling dat de CRISPR-cas systeem antibiotische selectie zou kunnen vervangen en verder verfijnen van de multiplex recombineering protocol.
The authors have nothing to disclose.
T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
|
Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |