Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.
Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a ‘targeting’ vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.
遺伝子ターゲティング技術の開発は、異なる生物学的システム1-3を調査するために、細胞株およびマウスモデルの構築を可能にした。ゲノム配列の修飾において重要第一段階は、ベクトル4遺伝子ターゲティングの設計および構築である。ターゲティングベクターは、選択マーカー( 例えば、ネオマイシン )、および哺乳動物細胞5における効率的な相同組換えのために必要な長いゲノム領域に隣接し、所望の修飾(複数可)を含む関心のある対立遺伝子を担持するプラスミド構築物である。正確な遺伝子改変は、胚性幹(ES)細胞を6または体細胞7、意図された変更の転送におけるターゲティングベクター上のDNA配列の同一ストレッチおよびゲノム遺伝子座の結果とすることにより、相同組換えにターゲティングベクターを導入することにより達成される遺伝子変換8によるゲノムへ。このようなMODIFIES細胞は、その後の生殖細胞9を介してこれらの修飾された対立遺伝子を伝達することができる子孫(キメラ)を生成するために、マウスの胚盤胞に注入することができる編。トランスジェニックマウスを作製するための代替経路は、マウスゲノム10中のベクターのランダムな組込みをもたらす単細胞マウス接合体への遺伝子発現ベクターのマイクロインジェクションを含む。ベクター構築の従来の方法は、ベクターバックボーンに異なる選択マーカーとゲノム断片をクローニングするために制限酵素およびDNAリガーゼを使用してクローニング「カット&ペースト」従来に頼ってきた。しかし、伝統的なクローニングの固有の制限要因は、特に、より長いDNA配列と、制限部位の位置および選択である。これは多くの場合、複数のサブクローニングステップを必要とし、また、多くの場合、遺伝子ターゲティングの低い効率につながるベクターに、外来DNA配列が導入されています。
コンビ(組換えENGineering)E.ファージの組換えタンパク質によって媒介される相同組換え(HR)を使用してこれらの制限を克服するDNA工学技術である大腸菌細胞 11,12。相同配列の任意の領域をリコンビニアリングの基質として働くことができるので、制限部位の利用可能性の制約が取り除かれる。大型DNA配列は、シームレス従って、それらの構造的完全性を維持13、インビボで直接改変することができる。遺伝子改変は、短い相同性(50塩基対)14、したがって相同性ア ーム(HA)との非常に効率的で便利な合成オリゴ配列に組み込むことができる。典型的なコンビ実験、オリゴまたはHAを含む二本鎖DNA(dsDNAの)断片でコンビテントE.にエレクトロポレーションされている染色体上またはプラスミド15のいずれかに位置して標的を含有する大腸菌細胞 。再結合の可能性は、Red RECの誘導発現によって付与されるombinationファージ16,17のタンパク質またはRACプロファージ18のRecETタンパク質。赤/のRecEエキソヌクレアーゼは、そのパートナー、赤/ RECT、一本鎖アニーリングタンパク質(SSAP)19によって結合される一本鎖DNA(ssDNA)の中間に線形のdsDNAに変換する。長い一本鎖DNAまたはその相補的標的配列への短いオリゴのアニーリングは複製フォークのラギング鎖上に発生し、標的部位での配列の組み込みをもたらす。鎖のssDNA換えを遅れはコンビの高効率の基礎であり、「ベータ」再結合モデル20,21によって記述することができる。
遺伝子ターゲッティングベクターを構築するための典型的なコンビニアリングワークフローでは、次の二つの経路のいずれかを伴う。一つの経路は、loxP組換え部位の順次挿入したプラスミドへのマウスBACクローンから目的のゲノム領域、選択マーカーをサブクローニング含ま<s> 22等まで、または代替ルートが10,23のコンビ、その後24,25のクローンを作成するギャップ修復によってプラスミドに変更された軌跡をサブクローニング複数回によって異なるターゲティングベクター要素とBACゲノム遺伝子座を標的にすることを含む。このテーマの変形が大きいマウスの生産プログラム26,27の一部として別の高スループットコンビパイプラインで使用されてきた。しかしながら、これらの手順は、複雑で長い段階を含む特殊なベクターおよびE.を使用する必要が大腸菌株( 例えば、Creを発現する細胞)およびベクターDNAの精製と再変換した( 表1)の一つ以上の中間ステップを利用する。サブクローニングプラス挿入(SPI)は、ベータ再結合し、単一のプロセス( 図1)へのクローニングのギャップ修復を組み合わせた新しいコンビ技術です。 SPIベクトルアセンブリは、簡単、迅速かつ柔軟であり、標準recombiに有意な改善を提供するエンジニアリング( 表1)に近づく。ここでは、使いやすさと非標準と挑戦的なベクトルのデザインの構築に特に重点を置いて異なるベクター構築アプリケーションのためのSPIを使用することの有用性を実証する。テストケースは、蛍光レポーターノックインベクターの構築は、二重タグ付きタンパク質の発現ノックインベクター、BAC蛍光レポーターベクターおよび条件付きノックアウトベクターを含んでいた。これらの要件は、細胞表面受容体を局在化する核タンパク質複合体を精製または条件付きの遺伝子の発現を焼灼するために種々検討した。
ES細胞株およびマウスモデルの構築は、歴史的に修飾された対立遺伝子4を含むプラスミド構築物を用いて標的化遺伝子を含んでいた。しかし、これらの複雑な遺伝子ターゲティングベクターの構築は、このようなモデルのタイムリーな生産の大幅なボトルネックであることが判明した。コンビ基づくベクター構築戦略の開発は、改良されたベクターの設計と、より効率的なベクターの組み立てを可能にした。それにもかかわらず、現在のコンビニアリングプロトコルはまだ、複数のステップを伴う中間プラスミド精製を必要とし、別の細菌の菌株を使用しています。プラスの挿入をサブクローニングすることは常駐BAC宿主株で1エレクトロポレーションイベントで実行することができるベクターの構築への新しいアプローチを提供しています。遺伝子ターゲティングにおけるSPIの有用性は、ベクター構築のさまざまなアプリケーションで、ここで試験した。ここで調べたすべての場合において、SPIは、効率的であることが証明され、正しい組み換えプラスミドを作製した。多くの場合、複数の異なるカセットを正しくターゲティングベクターに挿入した。大きなDNAカセットおよびベクターを容易SPIプロトコルに収容し、このシステムの柔軟性を実証した。
SPIは、直鎖DNAカセットの長い相同性配列、およびホスホロチオエート(PTO)保護の使用に依存している。 PTO修飾は、線形DNA 20,21にエキソヌクレアーゼに対する保護を与え、長いHAの多重化を可能にするために再結合効率を増加させる。しかし、より長いオリゴ配列の合成は、エラーを特に欠失を蓄積する可能性を増大させる。それらはタンパク質コード領域をカバーしている場合、オリゴ中の変異は、特に有害である。 DNAのHA全体のシーケンシングおよび挿入されたカセットの全長をカバーするには非常にすべての配列変化を有するクローンを排除することをお勧めします。高忠実度DNAポリメラーゼシステムの使用はまた、導入を回避することが提案されているY PCRエラー。サブクローニングプラスミドのHAの長さおよび組成は、挿入カセット(データは示していない)のものと比較してより重要である。エクソン領域内の任意の変異が許容されていないノックインベクターの構築などの特に敏感なアプリケーションでは、挿入カセットのHAは、長いオリゴに伴う問題を回避するために、(50〜120 bp)を短縮することができる。 (複製の方向の知識が利用できない場合)、挿入カセットはまた、ホスホロチオエート修飾されていないまたはデュアル残すことができる。しかし、これらの場合の多重化はまだ長いHAサブクローニングプラスミドが保護された必要があります。この特定の戦略の注意点は、潜在的に異なる遺伝子座でのSPIクローニングに影響を与える可能性が多重化効率の低下である。
挿入カセットおよびサブクローニングプラスミドの長さは、SPIクローニングにおける別の重要なパラメータである。より大きなDNA分子が少なく効率的にエレクトロポレーションおよび効果は、再指定された、累積され同じセル内のすべてのカセットを導入するquirement(データは示さず)。多重化は、より小さな挿入カセットと最も効率的です。 DNAは3キロバイト30までの最も効率的であるのssDNA処理を、仲介3キロバイトより大きく、また赤に制限を置く断片化します。 3キロバイトを超える挿入カセットを切除デュアルであり、ベータ独立した経路20を介して、より少ない効率的に再結合する。したがって、正しいクローンを同定するのに十分なコロニーのスクリーニングは、これらの場合に重要になる。組み換えポストエレクトロポレーションの長い持続時間も難しいのSPI演習で正しいクローンの回復の可能性が高くなります。四つの小カセット(<1.5キロバイト)多重化効率は、各追加のカセットと共に減少するものの、SPI処理と同時に挿入することができるまで(データは示さず)。しかしながら、これは最適なSPIの実験の結果を反映し、多くの大規模なカセットを使用する場合には、多重化の限界を考慮することが望ましい。 </P>
クラスタ化された定期的にinterspaced短い回文反復(CRISPR)のようなゲノム編集ツール-cas9エンドヌクレアーゼシステムの開発は、新規ゲノム修飾の作成 を可能にした、より効率的なゲノム工学36につながっている。しかし、これらの新しい技術は、遺伝子ターゲッティングベクターを補完するのではなく、それらに取って代わっている。これは、CRISPR-casのシステムは、抗生物質選択を交換し、さらに多重コンビプロトコルを絞り込むことが想定される。
The authors have nothing to disclose.
T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
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Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |