Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.
Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a ‘targeting’ vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.
유전자 타겟팅 기술들의 개발은 다른 생물학적 시스템 1-3 조사 세포주 및 마우스 모델의 구성을 가능하게했다. 게놈 서열의 변형 키를 제 4 단계는 벡터를 표적 유전자의 설계 및 시공된다. 타겟팅 벡터는 선별 마커 (예를 들면, 네오 마이신)에 의해 측면 원하는 변형 (들)을 포함하는 관심있는 대립 유전자를 운반하는 플라스미드 구조체, 및 포유 동물 세포에서 5 효율적인 상동 재조합에 필요한 긴 게놈 영역이다. 정확한 유전자 변형은 배아 줄기로 타겟팅 벡터의 도입 (ES) 세포를 6 또는 체세포 7에 의해 달성된다 타겟팅 벡터의 DNA 서열과 동일 뻗어 간의 상동 재조합과 의도 변형 예의 전사의 유전자좌 결과 유전자 변환 (8)에 의해 게놈. 그런 후 변형ED ES 세포는 배아 9 통해 이러한 대립 유전자 변형을 전송할 수있는 자손 (키메라)를 생성하기 위하여 마우스 포배 내로 주입 될 수있다. 트랜스 제닉 마우스를 제조하는 다른 경로는 마우스 게놈에서의 열 벡터의 임의의 통합에 이르게 단세포 마우스 접합체로 유전자 발현 벡터의 마이크로 인젝션을 포함한다. 벡터 건설의 전통적인 방법은 기존에 의존 한 벡터 백본에 다른 선택 마커 및 유전자 조각을 복제하는 제한 효소와 DNA 리가 제를 사용하여 복제 '잘라 내기 및 붙여 넣기'. 그러나, 기존의 복제 제한 요소는 고유 포지셔닝 및 제한 부위의 선택은 특히 긴 DNA 서열로이다. 이것은 종종 다수의 서브 클로닝 단계를 필요로하고 또한 종종 표적 유전자의 낮은 효율에 이르게 벡터 내로 외래 DNA 서열을 도입한다.
Recombineering (재조합 성 ENGineering) E. 파아지 재조합 단백질에 의해 매개 된 상 동성 재조합 (HR)를 사용하여 이러한 한계를 극복 DNA 공학적이며 대장균 세포 (11, 12). 상동 서열의 어느 지역이 recombineering의 기판 역할을 할 수 있기 때문에, 제한 사이트의 가용성의 제약이 제거됩니다. 큰 DNA 서열은 따라서 원활 또한 구조적 일체 (13)을 보존, 생체 내에서 직접 변형 될 수있다. Recombineering 짧은 동성 (50 BP) (14), 따라서 동성 암 (HA)을 편리하게 합성 올리고 시퀀스에 통합 할 수 있습니다 매우 효율적입니다. 전형적인 recombineering 실험, 올리고 또는 HA를 포함하는 이중 가닥 DNA (dsDNA) 조각에서 recombineering 관할 E.에 electroporation됩니다 염색체 나 플라스미드 (15)에 하나있는 대상을 포함하는 대장균 세포. 재결합 가능성은 레드 녹화의 유도 식으로 수여ombination 파지 16, 17의 단백질 또는 RAC의 프로 파지 (18)의 RecET 단백질. 레드 / RECE의 엑소 뉴 클레아 제는 파트너, 레드 / RECT, 단일 가닥 어닐링 단백질 (SSAP) (19)에 의해 결합되어 중간 단일 가닥 DNA (ssDNA를), 선형의 dsDNA를 변환합니다. ssDNA를 길게하거나 상보 표적 서열에 짧은 올리고의 어닐링 복제 포크의 보온 가닥 발생 및 표적 부위에서 서열의 혼입에 이르게. 스트랜드 ssDNA를 재결합하는 래깅 recombineering의 높은 효율의 기초와 '베타'재결합 모델 (20, 21)에 의해 설명 될 수있다.
일반적인 recombineering 워크 플로우는 유전자 표적 벡터는 다음과 같은 두 가지 경로 중 하나를 포함 빌드합니다. 하나의 경로에 loxP 재조합 사이트 순차 삽입, 선택 마커이어서 플라스미드로 마우스 BAC 클론에서 원하는 게놈 영역을 서브 클로닝 포함 <s업> (22) 등, 또는 대체 경로가 10,23을 recombineering 후 24, 25 복제 갭 수리하여 플라스미드로 수정 된 궤적을 서브 클로닝의 여러 라운드로 다른 타겟팅 벡터 요소 BAC 유전자좌를 대상으로 포함한다. 이 테마에 큰 변형 마우스 제작 프로그램 (26, 27)의 일부로서 다른 높은 처리량 recombineering 파이프 라인에서 사용되어왔다. 그러나, 이들 절차가 복잡하고 긴 스테이지들을 포함 특수 벡터와 E.의 사용을 필요 대장균 균주 (예, Cre 호텔은 발현 세포) 및 벡터 DNA를 정제하고 다시 변환 (표 1)의 하나 이상의 중간 단계를 이용한다. 플러스 삽입 (SPI)를 서브 클로닝하는 베타 재조합 단일 프로세스로 복제 갭 수리 (그림 1)를 결합하는 새로운 recombineering 기술이다. SPI 벡터 조립, 단순 신속하고 유연하며 표준 recombi에 상당한 개선을 제공합니다어링 (표 1)에 접근한다. 여기서는 용이성 및 비표준와 도전 벡터 디자인 구성에 특정 중점을 다른 벡터 건설 애플리케이션에 SPI를 사용하는 유틸리티를 보여준다. 테스트 케이스는 형광 리포터 올림피아 벡터의 구조, 듀얼 태그 올림피아 단백질 발현 벡터, BAC 형광 리포터 벡터 및 조건부 녹아웃 벡터를 포함. 이들은 각종 핵 단백질 복합체를 세포 표면 수용체 지역화 정화 요구 조건을 조사하거나 유전자의 발현을 브레이션.
ES 세포주 및 마우스 모델의 제작은 역사적 변성 대립 유전자를 포함하는 플라스미드 (4) 구조를 이용하여 표적 유전자를 포함하고있다. 그러나, 이러한 복잡한 유전자 타겟팅 벡터의 구성은 이러한 모델 적시 생산 상당한 병목 것으로 입증되었다. recombineering 기반 벡터 건설 전략의 개발은 개선 된 벡터 설계 및보다 효율적인 벡터 조립체를 허용했다. 그럼에도 불구하고, 현재의 recombineering 프로토콜은 여전히 여러 단계를 포함하는 중간 플라스미드 정화를 필요로 다른 균주를 사용합니다. 플러스 삽입을 서브 클로닝하면 상주 BAC 호스트 변형 한 전기 이벤트에서 수행 할 수 벡터 건설에 대한 새로운 접근 방식을 제공합니다. 유전자 타겟팅에서 SPI의 유틸리티는 벡터 건설 다양한 응용 프로그램을 여기에 테스트되었습니다. 여기에 검사를 모든 경우에, SPI 효율적인 것으로 입증하고 올바른 재조합 플라스미드를 제조 하였다.대부분의 경우, 다른 복수의 카세트가 제대로 타겟팅 벡터에 삽입 하였다. 큰 DNA 카세트 및 벡터에 용이 SPI 프로토콜에 수용하고이 시스템의 융통성을 증명 하였다.
SPI는 긴 상 동성 서열과 선형 DNA 카세트 포스 (PTO) 보호의 사용에 의존한다. PTO 수정은 선형 DNA (20, 21)에 exonucleases에 대한 보호를 부여하고 긴 HA 다중화를 허용하는 재조합 효율을 증가시킨다. 그러나, 더 긴 서열의 올리고 합성 에러에게 특히 결실 축적 가능성을 증가시킨다. 그들은 단백질 코딩 영역을 포함하는 경우 올리고 돌연변이 특히 유해 할 수 있습니다. DNA의 HA를 통해 시퀀싱 및 삽입 된 카세트의 전체 길이를 커버는 매우 어떤 순서 변경과 클론을 제거하는 것이 좋습니다. 고 충실도 DNA 폴리머 라제 시스템의 사용은 또한 도입을 피하기 위해 제안Y PCR 오류가 발생합니다. 서브 클로닝 플라스미드의 HA의 길이 및 조성이 삽입 카세트의 그것보다 상대적으로 중요하다 (데이터는 보이지 않음). 엑손 영역에 어떤 돌연변이가 용납되지 올림피아 벡터, 건설 등의 특히 중요한 애플리케이션의 경우, 삽입의 카세트 HA 긴 올리고와 연관된 문제를 피하기 위해 (50~120 BP)을 단축 할 수있다. 삽입은 카세트 (복제의 방향에 대한 지식을 사용할 수없는) 변성 또는 이중 phosphorothioated 남게 될 수있다. 그러나이 경우에 다중 여전히 긴 HA 서브 클로닝 플라스미드 보호가 필요합니다. 이 특정 전략의주의 할 점은 잠재적으로 다른 궤적에서 SPI 복제에 영향을 줄 수있는 다중 효율의 저하이다.
카세트 삽입 및 서브 클로닝 플라스미드의 길이는 SPI 클로닝 또 다른 중요한 파라미터이다. 큰 DNA 분자는 덜 효율적 electroporate 및 효과는 다시 주어진 누적동일한 셀의 모든 카세트를 도입하는 조건을 가지 (데이터는 보이지 않음). 다중 작은 삽입 카세트와 가장 효율적입니다. DNA보다 큰 3킬로바이트도 3킬로바이트 30까지 가장 효율적인 레드 매개 ssDNA의 처리에 제한을 두지 파편입니다. 3킬로바이트를 초과 삽입 카세트 절제된 듀얼하고 베타 독립적 인 통로 (20)를 통해 덜 효율적으로 재결합. 따라서, 정확한 복제를 식별 할 수있는 충분한 식민지의 심사는 이러한 경우에 중요합니다. 재조합 포스트 전기의 긴 기간은 어려운 SPI 운동의 올바른 클론의 회복의 가능성이 높아집니다. 4 개의 소형 카세트 (<1.5 KB) 다중화 효율이 각각의 추가적인 카세트와 함께 감소하지만, SPI 프로세스와 동시에 삽입 될 수있는 최대 (데이타 미기재). 그러나 이것은 최적의 SPI 실험의 결과를 반영하며 많은 대형 카세트를 사용하는 경우 다중의 한계를 고려하는 것이 바람직하다. </P>
클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 같은 게놈 편집 도구의 개발은 (CRISPR) -cas9 효소 시스템은 새로운 게놈 수정의 생성을 활성화하고보다 효율적으로 게놈 엔지니어링 (36)하게되었다. 그러나 이러한 새로운 기술은 유전자 대상 벡터를 보완하기보다는 그들을 대신하게했다. 그것은 CRISPR-CAS 시스템은 항생제 선택을 교체하고 추가 멀티 플렉스 recombineering 프로토콜을 구체화 할 수 있다는 예상된다.
The authors have nothing to disclose.
T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
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Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |