Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.
Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a ‘targeting’ vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.
El desarrollo de tecnologías de segmentación de genes ha permitido la construcción de líneas celulares y modelos de ratón para investigar diferentes sistemas biológicos 1-3. Una primera etapa clave en la modificación de una secuencia genómica es el diseño y la construcción de un gen vector dirigido 4. Vectores de abordaje son construcciones de plásmidos que llevan el alelo de interés que contiene las modificaciones deseado (s) flanqueados por un marcador de selección (por ejemplo, neomicina), y las regiones genómicas largos requeridos para la recombinación homóloga eficiente en células de mamífero 5. Modificación del gen preciso se consigue mediante la introducción del vector de orientación en células madre embrionarias (ES) 6 o células somáticas 7, con lo cual la recombinación homóloga entre tramos idénticos de secuencia de ADN en el vector de direccionamiento y los resultados locus genómico en la transferencia de la modificación prevista al genoma mediante conversión génica 8. Tal modified células ES pueden ser inyectadas en blastocistos de ratón para producir descendencia (quimeras) que luego pueden transmitir estos alelos modificados a través de la línea germinal 9. Una ruta alternativa para producir ratones transgénicos implica la microinyección de un vector de expresión de genes en cigotos de ratón unicelulares, que conduce a la integración aleatoria del vector en el genoma del ratón 10. Los métodos tradicionales de la construcción del vector se han basado en convencional 'cortar y pegar' clonación usando enzimas de restricción y ligasas de ADN para clonar el marcador de selección diferente y fragmentos genómicos en un esqueleto del vector. Sin embargo, un factor limitante inherente de clonación tradicional es el posicionamiento y la elección de los sitios de restricción, especialmente con secuencias de ADN más largos. Esto a menudo requiere múltiples etapas de subclonación y también introduce las secuencias de ADN extrañas en el vector, que a menudo conduce a una menor eficiencia de la orientación de genes.
Recombinería (eng recombinogenicineering) es una tecnología de la ingeniería de ADN que supera estas limitaciones mediante el uso de recombinación homóloga (HR) mediada por las proteínas de recombinación del fago en E. coli células 11,12. Dado que cualquier región de una secuencia homóloga puede servir como un sustrato de recombineering, se eliminan las limitaciones de disponibilidad de sitios de restricción. Las secuencias de ADN de gran tamaño pueden ser modificados sin problemas directamente in vivo, por tanto, también la preservación de su integridad estructural 13. Recombinería es muy eficiente con homologías cortas (50 pb) 14 y por lo tanto brazos de homología (HA) pueden ser convenientemente incorporados en las secuencias de oligo sintéticos. En un experimento típico recombinería, un oligo o un fragmento de ADN bicatenario (dsDNA) contiene HA se electroporación en recombinería E. competente células de E. coli que contienen el objetivo situado ya sea en el cromosoma o en un plásmido 15. El potencial de recombinación es conferida por la expresión inducible de la rec Redombination proteínas del fago 16,17 o las proteínas RECET del profago rac 18. La exonucleasa Red / RecE convierte dsDNA lineales a un ADN monocatenario (ssDNA) intermedio, que luego se une por su socio, Red / RecT, una proteína de recocido de una sola hebra (SSAP) 19. El recocido de una larga ssDNA o un corto oligo a su secuencia diana complementaria se produce en el capítulo menos del tenedor de replicación y conduce a la incorporación de la secuencia en el sitio diana. Retardamien hebra ssDNA recombinación es la base de la alta eficiencia de recombineering y puede ser descrita por el "beta" modelo de recombinación 20,21.
Un flujo de trabajo típico recombinería para construir un vector de orientación de genes involucra cualquiera de las dos siguientes rutas. Una ruta implica la subclonación de la región genómica deseada de un clon BAC de ratón en un plásmido seguido de la inserción secuencial de sitios de recombinación LoxP, un marcador de selección <shasta> 22 etc., o la ruta alternativa implica la orientación del BAC locus genómico con los diferentes elementos de la orientación del vector de múltiples rondas de recombinería 10,23 y después subclonando el locus modificado en un plásmido mediante reparación brecha clonación 24,25. Variaciones sobre este tema se han utilizado en diferentes tuberías recombinería de alto rendimiento como parte de los programas de producción de gran ratón 26,27. Sin embargo, estos procedimientos implican etapas complicadas y largas, requieren el uso de vectores especializados y E. coli cepas (por ejemplo, células que expresan Cre) y utilizar una o más etapas intermedias de purificación de ADN vector y re-transformación (Tabla 1). Subclonación de inserción más (SPI) es una técnica recombineering novela que combina beta recombinación y reparación brecha de la clonación en un único proceso (Figura 1). Montaje vector SPI es simple, rápida y flexible y ofrece una mejora significativa en recombi estándaringe- se acerca (Tabla 1). Aquí, nos demuestran la facilidad y utilidad de usar SPI para diferentes aplicaciones en la construcción del vector con un énfasis particular en la construcción de diseños de vectores no estándar y desafiantes. Los casos de prueba incluyen la construcción de un vector knockin indicador fluorescente, una expresión de la proteína etiquetada vector knockin dual, un fluorescente reportero vector BAC y un vector knockout condicional. Estos examinaron diversamente el requisito de localizar un receptor de superficie celular, purificar un complejo de proteína nuclear o condicionalmente ablación de la expresión de un gen.
Construcción de líneas de células madre embrionarias y modelos de ratón históricamente ha incluido la orientación de genes utilizando construcciones de plásmidos que contenían el alelo modificado 4. Sin embargo, la construcción de estos vectores complejos orientación de genes ha demostrado ser un cuello de botella significativo en la producción oportuna de tales modelos. El desarrollo de estrategias de construcción vector recombinería basada ha permitido mejorar los diseños vectoriales y montaje vector más eficiente. Sin embargo, los protocolos recombinería actuales todavía implican varios pasos, requieren de purificación de plásmido intermedio y utilizan diferentes cepas bacterianas. Subclonación de inserción plus ofrece un nuevo enfoque para la construcción de vectores que se pueden realizar en un solo evento electroporación en la cepa huésped BAC residente. La utilidad de SPI en la dirección de genes fue probado aquí en una variedad de aplicaciones de construcción del vector. En todos los casos examinados aquí, SPI demostró ser eficiente y se produjo el plásmido recombinante correcta.En la mayoría de los casos, las múltiples cintas de diferentes fueron insertados correctamente en el vector de direccionamiento. Grandes casetes de ADN y vectores fueron alojados fácilmente en el protocolo SPI y demostraron la flexibilidad de este sistema.
SPI se basa en el uso de secuencias de homología largas y fosforotioato (PTO) la protección de los casetes de ADN lineales. Modificación PTO confiere protección contra exonucleasas al ADN lineal 20,21 y la larga HA aumenta la eficiencia de recombinación para permitir la multiplexación. Sin embargo, la síntesis de secuencias de oligo largos aumenta las posibilidades de acumulación de errores especialmente supresiones. Las mutaciones en el oligo pueden ser particularmente perjudicial si cubren regiones codificantes de proteínas. La secuenciación del ADN a través de la HA y cubre la longitud completa de la cinta insertada es muy recomendable para eliminar clones con las alteraciones de la secuencia. También se sugiere el uso de un sistema de ADN polimerasa de alta fidelidad para evitar la introducción de unaerrores y PCR. La longitud y la composición de la HA del plásmido subclonación es más crítica respecto a la de la casete de inserción (datos no mostrados). Para aplicaciones especialmente sensibles como la construcción de vectores knockin, donde no se toleran las mutaciones en las regiones de exón, la HA del casete de inserción se puede acortar (50-120 pb) para evitar problemas asociados con oligos largos. El casete de inserción también se puede dejar phosphorothioated no modificada o dual (donde el conocimiento de la dirección de la replicación no está disponible). Pero multiplexación en estos casos todavía requiere mucho protegidos HA plásmidos subclonación. Una advertencia de esta estrategia particular es la disminución de la eficiencia de multiplexación que potencialmente pueden afectar SPI clonación en diferentes loci.
La longitud de la casete de inserción y el plásmido subclonación es otro parámetro importante en el SPI clonación. Moléculas de ADN más grandes electroporar menos eficiencia y el efecto es acumulativo, dada la rerequisito de introducir todos los casetes en la misma célula (datos no mostrados). La multiplexación es más eficiente con casetes de inserción más pequeños. Fragmentos de ADN mayores de 3 kb también poner un límite en el procesamiento de ssDNA Roja mediada, que es más eficiente hasta 3 kb 30. Casetes Inserción de más de 3 kb son duales resecado y recombinan menos eficiente a través de una vía independiente beta 20. Por lo tanto, la detección de colonias suficientes para identificar el clon correcto se vuelve importante en estos casos. Una mayor duración de la post electroporación recombinación también aumenta las posibilidades de recuperación del clon correcto en ejercicios difíciles SPI. Hasta cuatro cassettes pequeños (<1,5 kb) pueden ser insertados simultáneamente con el proceso de SPI, aunque la eficiencia de multiplexación disminuye con cada casete adicional (datos no mostrados). Sin embargo, esto refleja el resultado de un experimento óptima SPI y es recomendable tener en cuenta los límites de multiplexación cuando se utiliza muchas grandes cassettes. </p>
El desarrollo de herramientas de edición del genoma como agrupados interspaced regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) Sistema endonucleasa -cas9 ha permitido la creación de nuevas modificaciones del genoma y ha llevado a la ingeniería del genoma más eficiente 36. Sin embargo, estas nuevas tecnologías han complementado vectores de genes objetivo en lugar de ellos suplantado. Se prevé que el sistema de CRISPR-cas podría sustituir a la selección de antibióticos y perfeccionar el protocolo recombineering multiplex.
The authors have nothing to disclose.
T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
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Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |