Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Ex vivo-behandling Reaktion fra primære tumorer og / eller associerede Metastaser til præklinisk og klinisk udvikling af Therapeutics

doi: 10.3791/52157 Published: October 2, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Etablerede cancer cellelinjer og xenografter har været grundpillen i kræftforskning i de sidste mange årtier. Seneste oplysninger tyder dog på, at terapeutiske reaktion i høj grad er påvirket af tumorcellens mikromiljø. Derfor har vi udviklet en ex vivo analyse af primær tumor prøver for lægemiddeludvikling formål.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Udvikling af effektive kræftlægemidler har vist sig at være ekstremt udfordrende. Cancercellelinjer og tumor eksplantater - samt xenotransplantater er blevet anvendt i kræftforskning i over et halvt 1,2,3 århundrede. Til dato er uundværlig den molekylære analyse af narkotika følsomhed og modstand i både etablerede cancer cellelinjer og patient-afledte xenografter (PDX). Men afprøvning af forbindelser i etablerede cancercellelinier er ikke ofte prædiktive for effektivitet in vivo, og den tilsvarende in vivo undersøgelser i dyr, især i PDX modeller er meget dyrt og tidskrævende. Begrænsningerne af disse modelsystemer, nemlig manglende evne til at informere om indflydelsen af ​​det native mikromiljø i tumorudvikling og respons på terapeutiske strategier har ført forskningsområde at udvikle yderligere metoder til at komplementere disse analyser. Af de seneste, forstærkes opmærksomhed mod ex vivo analyse af patientens tumeller eksplantater 4, 5 som følge af større forståelse for, at kræft terapeutisk respons er ikke eksklusivt til iboende molekylære sammensætning af cancerceller, men snarere er stærkt præget af tumorcellens mikromiljø 6, 7 en funktion, der ikke kan blive gentaget ved traditionelle dyrkningsmetoder og / eller PDX. Ex vivo analyse i ovennævnte sammenhæng (dvs.., påvirkning af tilstødende omgivende tumor celle mikromiljø) indebærer vurdering af levedygtige primære tumor / metastase sektioner, snarere end ex vivo analyse af cellulære isolater 8, 9.

Vi rapporterer her om en ex vivo teknik (dvs.., Præcision-skiver friske vævssnit) af både patientens primære tumorer og tilhørende metastaser (dvs. lymfeknuder), der trofast informerer om respons (IC50), off-target effekter og muliggør molekylær Analyse af resistens og feedbackmekanismer. Derudover en korrelativ analyse af therapeutic følsomhed / resistens mod biomarkør og genekspression profil kan udføres i et forsøg på at identificere patienter mere tilbøjelige til at reagere på det eksperimentelle stof af interesse (dvs.. høj lægemiddelrespons matcher patient med særlige biologiske profil). Anvendelse af ex vivo teknik og vurdering i en multi-parameter mode er bevægelse i retning af patientens valg og en generel forbedring af de kliniske resultater.

Ex vivo-behandling respons analyse kunne blive et standard værktøj i præklinisk og klinisk udvikling af kræftmedicin og er planlagt som et skridt i retning af en skræddersyet medicin tilgang i terapeutiske udviklingsstrategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

BEMÆRK: Patient vævsudtagning blev godkendt gennem institutionelt review board (IRB) -godkendte Biospecimen og kliniske protokoller (protokol numrene 09-121 og 11-041, henholdsvis) på Memorial Sloan Kettering Cancer Center.

1. vævsudtagning

  1. Indkøb af patient primær tumor / metastaser
    BEMÆRK: Til dato er denne protokol blevet udført på kirurgisk fjernet pancreas, mave og bryst tumortyper, samt, lymfom metastaser.
    1. Ret det kirurgiske team til at levere de prøvemateriale ved kurer eller pneumatisk rørsystem til Patologi afdelingen i tæt lukket og sterilt lækagetætte plast eksemplar taske inden steril spill-bevis beholder. Ret det kirurgiske team til at transportere prøven i frisk tilstand uden formalin eller fiksativ.
    2. Ret patolog eller patolog assistent til at høste de friske prøvemateriale ved hjælp af steril teknik, som incLudes brug af sterile handsker og instrumenter under en laminar flow hætte.
    3. Optag høst tid af de indkøbte modellen, som holdes strengt under 30 minutter fra afslutningen af ​​den kirurgiske procedure. Under hensyntagen til virkninger af kold iskæmi, ikke tage prøver fra resektion prøver med en kold iskæmisk tid på> 30 min 18.
    4. Lede Patologi Department personale til at fjerne en primær tumor eksemplar af cirka 0,5 cm 3-1,0 cm 3 i en laminar flow hætte til at opretholde et sterilt miljø. Når det er muligt, skal du vælge tumorvæv fra periferien af ​​indekset læsion for at undgå potentielle frank central nekrose (celledød).
      BEMÆRK: nekrotisk væv kan være groft genkendes af et af følgende kriterier: tab af farve eller bleghed af vævet; tab af styrke, hvor nekrotisk væv er blødt og sprødt; en klar afgrænsning mellem det nekrotiske og levedygtigt væv.
    5. Ret pathologist eller patolog assistent til at give perifere væv, der er i overskud (kirurgisk udsmid) efter øjeblikkelig udtagning af tumoren til diagnostisk evaluering. Anbring prøven i en 15 ml sterilt konisk centrifugerør indeholdende cirka 5 ml minimum essentielt medium (MEM) indeholdende 1% antibiotika (penicillin og streptomycin).
    6. Hvis det er tilgængeligt (f.eks lymfeknude af aksillær hale af mastektomi prøve), skaffe en groft positivt associeret lymfeknude eksemplar af samme størrelse (0,5 cm 3-1,0 cm 3) og sammenlign lægemiddelrespons af primær tumor. Ligesom de primære tumorprøver placere de tilhørende lymfeknude modellen i et 15 ml sterilt konisk centrifugerør indeholdende cirka 5 ml minimum essentielt medium (MEM) indeholdende 1% antibiotika (penicillin og streptomycin).
    7. Hvis størrelsen af kirurgiske aftryk tilladelser (f.eks mastektomi prøve), fjern (fjernt fra primær tumor) en prøve af normalt væv (dvs.normal tætte / fibrøst bryst parenkym) og anbringes i en 15 ml sterilt konisk centrifugerør, der indeholder cirka 5 ml minimum essentielle medier (MEM) indeholdende 1% antibiotika kun til overførsel. Efter overførsel til laboratoriefaciliteter, overføre den 'normale' prøve til en cryovialet, 'snap' fryse og opbevares i en -80 ° C fryser for fremtidige molekylære analyser.
    8. Læg alle prøver på våd is og straks transporten til laboratoriet plads til ex vivo frisk væv sektionering. Gør ikke afsnittet normale prøve, men snarere gemme i et -80 ° C fryser for fremtidige molekylære analyser. Overfør en del af den primære tumor og tilhørende metastase til en cryovialet, 'snap' fryse og opbevares i en -80 ° C fryser for fremtidige molekylære analyser.
  2. Indkøb af væv fra kliniske studier (f.eks valgfri core nålebiopsier (CNB))
    BEMÆRK: Vi får tumorvæv fra patienterindskrevet på kliniske protokoller, der giver deres samtykke til at undergå en CNB af en tilgængelig tumormetastase før starten af ​​behandlingen. CNBs hidtil er blevet udført på patienter med brystkræft, randzone lymfom, mantle celle lymfom, metastatisk paraganglioma, livmoderhals (planocellulært) og ovariecancer.
    1. Har kliniske personale fra interventionel radiologi eller relevante afdeling udføre en forbehandling kerne nål biopsi og placere prøven i et 15 ml sterilt konisk centrifugerør, der indeholder cirka 5 ml minimum essentielt medier (MEM) indeholdende 1% antibiotika (penicillin og streptomycin).
    2. Placer biopsiprøve på våd is og straks transporten til laboratoriet plads til ex vivo frisk væv sektionering.

2. Udarbejdelse af materialer til sektionering og vibratome Indstillinger

  1. Forberedelse af materialer til Skæring
    1. Lav en 4% agaroseopløsning ved at tilsætte 4 g AGAsteg til 100 ml PBS. Autoklave (cyklus indstillinger: Væske, 121 ° C, 30 min 15 pounds per square inch) opløsningen inden brug første gang. For efterfølgende anvendelser, placere 4% agarose i en mikrobølgeovn til at flydende (Høj varme i 30 sek intervaller) før hver brug og afkøles på passende til ~ 25 ° C (dvs. varm at røre) opmærksom på, at agarose størkner ved stuetemperatur.
    2. Brug 4% agarose som en ikke-permanent væv indstøbningsmedier. Når 4% agarose er afkølet tilstrækkeligt, og er stadig i en flydende tilstand, med en steril tang placere vævsprøve i en indlejring mug og hæld i 4% agarose.
    3. Placer vævsprøven tæt (~ 2 mm afstand), men ikke direkte på skærefladen væg indlejring formen. Den 4% agarose vil begynde at størkne hurtigt, derfor passende placere vævsprøven hurtigt. Under sektionering, holde 4% agarose i et 55 ° C vandbad for at holde i opløsning.
    4. Til en 24-brønds plade til afsnittet analyse, der tilsættes 1 ml of komplette medier (dvs. a-MEM + 10% kalvefosterserum + 1% antibiotika) til hver brønd. Hold 24-brønds plade ved stuetemperatur (~ 25 ° C) under hele varigheden af ​​sektionering.
  2. Fremstilling af vibratome indstillinger
    1. Ved hjælp af vibrerende mikrotom, indstille den hastighed, hvormed klingen nærmer modellen [0 (0.00 mm / sek) til 10 (2,5 mm / sek)] og hyppigheden af ​​klinge [0 (0 Hz) til 10 (100 Hz) ]. Juster indstillingerne efter teksturen af vævet (dvs. tæthed / fasthed).
    2. For en primær bryst tumor af invasiv duktalt karcinom, justere indstillingerne til 6 og 3, hurtighed og hyppighed hhv. For mindre tæt / fast tumorvæv, mindske hastigheden og øge frekvensen i overensstemmelse hermed.
    3. Indstil sektion tykkelse inden for de grænser, instrument (1-999 um). For disse analyser, indstilles sektion tykkelse på 200 um.
    4. Monter agarose-embedded prøvemateriale ved hjælp af et tyndt lag af flydende lim på objektpladen that nedsænket i et reservoir af medier, der er indkapslet i våd is.

3. Tissue Sektionsinddeling, Behandling & Analyser

  1. Fjern præcisions-skåret sektioner umiddelbart efter sektionering med sterile pincetter og sted i en multi-brønds plade med 1 ml komplet medier. Når der er tilstrækkelig sektioner erhverves for respons og korrelationsmaalinger analyser placere multi-brønds plade til behandling respons i en vævsdyrkningsinkubator indstillet på standard væv dyrkningsbetingelser.
  2. Tag flere styreledninger sektioner, bogstøtten de behandlede sektioner i et forsøg på at bekræfte dosisafhængig respons i modsætning til dyrkede artefakter. Udfør væv sektionering hurtigt (~ 30-40 min), godt inden for eventuelle skadelige virkninger af kulde iskæmisk tid (~ 2 - 4 timer) 18. Udfør behandling af sektioner først efter en 1 hr akklimatisering periode.
  3. Efter 1 time akklimatiseringsperiode tilføje stigende doser (terapeutisk relevant;
  4. Efter behandling, fjerne alle sektioner under sterile forhold og formalin-fix ved at placere vævssnittet i et rør indeholdende enten 10% bufferet formalin og sted ved RT O / N eller i et rør indeholdende 4% paraformaldehyd (fortynde 16% paraformaldehyd fra et hætteglas med PBS til en slutkoncentration på 4%) og sted ved stuetemperatur i 2 timer.
    1. Fix større vævssnit (f.eks. ~ 6 mm x 4 mm) 200 um tyk i 10% pufret formalin O / N-ved stuetemperatur. Fix mindre sektioner (f.eks. 1 mm x 1 mm) 200 um tyk i 4% paraformaldehyd i to timer ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Til effektiv penetration af fiksativ mængden af ​​fixative bør 20x volumen af ​​væv. Eftersom at denne protokol resulterer i ekstremt små væv størrelser (fx 6 mm 3 væv = 6 pi volumen) til sikring af korrekt fiksering brug 1 ml fixativ for alle væv størrelser.
    2. Efter fiksering har vævsprøverne paraffin indlejret ved Patologisk Institut personale. Sektion eksemplar paraffinblokke på ladede dias at være hematoxylin og eosin farves og vurderet immunhistokemisk (f.eks apoptose).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Til denne undersøgelse blev ex vivo teknik, der anvendes i en korrelativ analyse af terapeutisk følsomhed / resistens hos en varmechokprotein 90 inhibitor (Hsp90i). I en præklinisk vurdering af denne Hsp90i, brystkræft primær tumor, en ER + invasiv duktalt carcinom (IDC) og tilhørende lymfeknudemetastaser blev analyseret ex vivo til behandling respons   (Figur 1). Multiple 200 um serielle sektioner blev behandlet med vehikel og stigende doser (0,25, 0,50, 1,0 og 2,5 uM) i Hsp90i. Dataene i figur 1 repræsenterer formalin-fikseret, paraffinindlejrede (FFPE) og hematoxylin- & eosin (H & E) farvede snit efter en 48 timers behandlingsperiode. Styringen (køretøj alene) behandlede afsnit viser levedygtige IDC reder mens 2,5 uM behandlede væv sektion resulterede i en 40% induktion af apoptose som set ved nukleare morfologiske ændringer (dvs. pyknotiske kerner / APOPtotic snavs) (figur 1A). Apoptose blev yderligere bekræftet i den primære tumor ved terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick endemærkning (TUNEL) analyse (data ikke vist). IC50 beregnes ud fra reaktioner efter grafer procent apoptose versus koncentration af lægemidlet. Betydeligt, chaperone, Hsp90 spiller en central rolle i protein stabilisering og homeostase af kritiske signalveje på både normale og kræftceller 10. Evnen til at målrette Hsp90 i kræft er afhængig af den konstatering, at maligne celler er stærkt afhængige af chaperoning funktion Hsp90, især i et forsøg på at overvinde stressede tilstande af ugæstfrie miljøer opstå under metastaserende progression. I det væsentlige, cancerceller bliver meget afhængig af Hsp90-funktionen resulterer i en målrettes selektivt pulje af 'onkogene' Hsp90 11. I indsatsen, figur 1A, tilstødende godartet lille lap med tilhørende acini og kanalen forbliver uændret in samme 2,5 uM Hsp90i-behandlede afsnit. Til vores viden, det er første gang denne Hsp90 kræft-specificitet visuelt fanget i Hsp90i respons vurdering af primære tumorer og tilhørende metastaser. Denne konstatering af uændrede godartede / normale celler som set i tilstødende godartede lobuliene IDC (figur 1A) samt fartøjer inden for omgivende godartet bryst parenkym af den primære tumor og tilhørende lymfeknudemetastaser (data ikke vist) er blevet gentaget i flere forskellige tumortyper (f.eks bryst, mave og lymfom metastaser).

En ledsagende lymfeknude metastase af denne primære tumor viste en komplet respons kun i IDC reder, der blev løst i forbindelse hermed (figur 1b). IDC reder, som dannede stramme sphæroider forblev imidlertid levedygtig som bekræftet af TUNEL (figur 1C). Yderligere analyse af de levedygtige IDC spheroids ved immunfluorescens afsløreten vedvarende eller re-ekspression af celle-celle-adhæsionsmolekyle, E-cadherin (figur 1C). Dette resultat er i overensstemmelse med vedvarende, overekspression af E-cadherin tilføjelse til den metastatiske potentiale eller metastatisk effektivitet som afspejlet i den stærkt malign, dødelig inflammatorisk brystkræft 12, 13. Selv interessant, dette fund er uden for rammerne af dette dokument. Det er dog væsentligt at bemærke, at disse lymfeknude (LN) IDC spheroids blev opretholdt i kultur i en periode på 2 uger, og dermed giver tiltro til styrken af at bruge ex vivo teknik til at studere både følsomhed / resistens i præklinisk lægemiddeludvikling.

Den ex vivo teknik er også blevet ansat i en klinisk undersøgelse af kerne nålebiopsier (CNBs) til dokumentation af mål-hæmning i tumorer 16,17. Patienter, som samtykke, har en forbehandling kerne nål biopsi (CNB) procedure udført (figur 2). Sammenligneligetil den prækliniske vurdering af primære tumorer, er ex vivo-teknik, der anvendes til at bestemme følsomhed eller reaktion CNB af tilgængelige metastaser. Flere 200 um serielle sektioner af CNB blev behandlet med kun og stigende doser (0,25, 0,50, 1,0 og 2,5 uM) i Hsp90i køretøjet. Antallet af Hsp90i anvendte doser i ex vivo vurdering er dikteret af størrelsen af CNB. Dog er alt tilrettelagt til at bruge spektret af doser foreslået ovenfor. Ligesom den prækliniske ex vivo vurdering kan respons evalueres og senere i forhold til den faktiske i patientens respons (dvs. korrelative analyser, figur 2), bestemt ved efterbehandling CNB farmakokinetisk (PK), dvs, fastholdelse lægemiddel som måles via væskekromatografi tandem-massespektrometri (LC-MS / MS) analyser samt patient PET-billeddannelse (figur 2) 16,17. Til dato analyser ved hjælp af ex vivo-teknik i denne CKLINISKE undersøgelse er blevet udført på flere forskellige tumortyper (f.eks bryst, randzone lymfom, mantelcellelymfom metastatisk paraganglioma, livmoderhalsen og ovariecancer) 16, 17. Fuld korrelativ analyse gennemførelse af ex vivo teknik yderligere eksemplificerer anvendeligheden af denne teknik i klinisk lægemiddeludvikling.

Figur 1
Figur 1. Ex vivo-respons analyse af en ER + brystkræft. (A, venstre panel) viser levedygtige reder af invasiv duktalt karcinom (IDC) (Hæmatoxylin og eosin farves, skala bar 100 um). Ved behandling (A, højre panel) med 2,5 uM af Hsp90i der er en induktion af ~ 40% apoptotisk respons (pyknotiske kerner / apoptotisk vragrester pile) (Hæmatoxylin og eosin farves, Målestokken 100 um). Godartede lobules g> (A, indsæt) forbliver uændret efter behandling (hæmatoxylin- og eosinfarvede, Målestokken 200 um). Styringen af en associeret lymfeknude (LN) (B, venstre panel) viser et lille niveau af apoptose (Hæmatoxylin og eosin farves, Målestokken 100 um), mens den behandlede sektion (B, højre paneler) viser et område af metastatisk IDC reder med komplet respons (Hæmatoxylin og eosin farves, Målestokken, uret 2 mm, 300 um, 200 um og 200 um). Men stramme IDC sfæroider (Sfæroider, Sp) fra det samme afsnit (C, venstre panel) viser ringe, hvis nogen, apoptose som vist ved TUNEL-analyse resterende levedygtige med en samtidig (Målestokken 200 um) (C, højre panel) i løbet -expression af E-cadherin (forstørrelse 100X).> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Skematisk af gennemførelsen af ex vivo teknik i en klinisk undersøgelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kræft biologer står over for betydelige udfordringer, når de forsøger at udvikle effektive terapeutiske strategier. Test narkotika i udviklingen på etablerede cancercellelinjer kan ikke præcist afspejler in vivo respons og in vivo forsøg på PDX modeller er arbejdskrævende og meget dyrt. I betragtning af ovenstående, er anvendelsen af ex vivo-teknikker til primær patient tumorer 14, 15 er nu placeret ved siden af den molekylære analyse af etablerede kræft cellelinjer og patient-deriverede xenografter (PDX).

Dette papir tager anvendelsen af ex vivo teknik til en ny højde i at teknikken trofast informerer om respons (IC50), off-target effekter og muliggør molekylær analyse af modstand og feedback-mekanismer. Når svar-data er korreleret til tumoren molekylære profil (dvs. protein ekspression af tumor biomarkører mutationer) den korrelative undersøgelse (respons versus tumor molecular profil) kan bruges til at udvælge patienter mere tilbøjelige til at reagere på et bestemt lægemiddel, i et forsøg på at forbedre patienternes resultater. Mest markant i klinisk lægemiddeludvikling (dvs.., Valgfri biopsier), ex vivo respons forbehandling CNB kan relateres til (og valideret) i patientens respons (dvs. efterbehandling CNB) og fastholdelse lægemiddel (farmakokinetisk (PK) evaluering) 16,17. Brugen af ex vivo-teknik i denne kliniske undersøgelse var i stand til at bestemme tumorrespons samt bekræfte målspecificitet (dvs. PD; Hsp70-induktion) og informere om dosis og planlægning 16,17.

Den ex vivo teknik er modtagelig for de fleste solide tumorer samt kræft metastaser blodbårne (f.eks lymfeknudemetastaser lymfom) med mindre justeringer i protokollen for visse tumortyper, som præsenterer mindre udfordringer. For eksempel tumorer i bugspytkirtlen tendens til at have en høj sTroma tumorcelle forhold, som kan resultere i sektioner, der har dårlig kræftcelle repræsentation. Indkøb af kræft celle rige områder af tumoren ikke kan ske ved grov analyse. Derfor for at overvinde dette potentiel mangel flere mindre kubiske områder fra tumorprøver kan indlejres (4 / agarose-indlejring mug) og snit samtidigt øge sandsynligheden for en tumorcelle-rige ex vivo sektion.

Vores data støtter kraftigt brugen af ex vivo teknik i præklinisk udvikling af lægemidler (figur 1). Sammen med respons (IC50), replikere sektioner kan analyseres for alternative levedygtighed assays, metabolomik, kombinatoriske terapeutiske strategier, effekt narkotika eksponering har på udskilte faktorer (f.eks, cytokiner, exosomer), modstand og feedback-mekanismer og vigtigere, informere om off-mål effekter (dvs. normale og benigne celler). I denne særlige undersøgelse, der brugte en Hsp90i, målrette specificity og identifikation af 'off-target effekter «er nøglen baseret på den forudsætning, at der er en karakteristisk pulje af' onkogene Hsp90« kun findes i kræftceller ved malign transformation 10. Dette præsenteres i afsnittet om resultater (indsæt, figur 1A), hvor godartede lobules af en ex vivo Hsp90i behandlet sektion forblev uændret. Af lige så stor betydning, som findes i en anden del af samme primære tumor afspejlet i figur 1, en ​​10 uM (terapeutisk irrelevante dosis) behandlet sektion viste fuldstændig reaktion IDC reder henviser forbundet duktalt carcinom in situ (DCIS) forblev uændret (data ikke vist) . Fremtidige undersøgelser i denne linje af forskning er uden for rammerne af dette dokument. Men denne konstatering informerer om status for "malign transformation" eller sygdomsprogression af associerede DCIS i IDC prøver med hensyn til den onkogeneHsp90 chaperoning velfungerende og støtter nytten af at bruge ex vivo teknik i lægemiddeludvikling.

En yderligere anvendelse af ex vivo teknik er brug i pre-effektanalyse i tumor xenograftmodeller (dvs.., Ex vivo sektionering af PDX) i lægemiddeludvikling at bestemme den farmakokinetiske / farmakodynamiske (PK / PD) data før udførelse involveret, dyre in vivo-undersøgelser - giver mulighed for en mere oplyst, omkostningseffektiv in vivo lægemiddeleffektivitet undersøgelse.

De vigtigste trin og potentielle begrænsende faktorer i ex vivo teknik er indkøb og skæring. Indkøb af tumoren prøven (dvs.., Primær tumor / metastaser) skal udføres hurtigt med stor opmærksomhed på at identificere et område af tumoren med den højeste grad af levedygtighed. Store tumorer tendens til at have nekrotiske centrale områder, som ikke er klart synlige. Derfor skaffe væv fra ydre mest rand øger sandsynligheden for at opnå en levedygtig prøve. Med hensyn til sektionering, indsamling præcision skiver i den ønskede tykkelse (f.eks. 200 um) er stærkt præget af tumor tæthed / fasthed (undtagen CNBs grund af den ekstremt lille størrelse). For eksempel invasiv duktalt carcinom er typisk meget tættere i modsætning til invasive luftrør carcinom. Tætte tumorvæv giver passende modstand - i mangel af permanent indlejring medier - til bladet, hvorimod mindre tæt tumorvæv ikke. Eksempler på mindre tætte tumor vævstyper indbefatter, men er ikke begrænset til invasiv luftrør carcinoma, mucinous carcinomer og gastriske tumortyper. For at overvinde dette potentiel begrænsning er fejlfinding med passende klinge hastighed og hyppighed, der kræves. Konsekvent præcision-skiver sektion tykkelse, hele sektionering processen er afgørende for præcis vurdering af narkotika respons.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000s Leica 14047235613
UltraPure agarose Invitrogen 16500500 Prepare 4% and 6% before use
Injector blade Ted Pella 121-4
MEM with Penicillin  + Streptomycin Media Core Facilities (MSKCC) The media is prepared at Memorial Sloan Kettering Cancer Center 
Scalpel no. 10 Thermo Scientific 31-200-32
Disposable forceps Cole-Parmer 84011182
Embedding mold Electron Microscopy Science 70181
FBS (heat inactivated) Gemini 100106
24 well plates Corning 3524
Formalin (10%) Sigma Diagnostics SDHT501128 
16% Formaldehyde solution Thermo Scientific 28908
Embedding microsettes Simport M503-2
Ethanol (70%) Fisher Scientific A405P-4
Waterbath Fisher Scientific 15-462-2SQ
Microwave General Electric ModelJES2051DNBB
Adhesive (Ethyl Cyanoacrylate) Sigma-Aldrich E1505-5G
10 mm dishes BD Falcon 353003
15 ml tubes BD Falcon 352096

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abercrombie, M., Ambrose, E. J. Interference Microscope Studies of Cell Contacts in Tissue Culture. Experimental Cell Research. 15, (58), 332-345 (1958).
  2. Coriell, L. L., McAllister, R. M., Wagner, B. M. Criteria for Determining Malignancy in Tissue-Culture Cell Lines in the Albino Rat. New York Academy of Science. 5, 351-355 (1957).
  3. Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
  4. Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analysis of human tumors. Cell Cycle. 11, (14), 2756-2761 (2012).
  5. Bray, K., et al. Bcl-2 Modulation to Activate Apoptosis in Prostate Cancer. Molecular Cancer Research. 7, (9), 1487-1496 (2009).
  6. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19, (11), 1423-1437 (2013).
  7. Nakasone, E. S., et al. Imaging Tumor-Stroma Interactions during Chemotherapy Reveals Contributions of the Microenvironment to Resistance. Cancer Cell. 21, 488-503 (1016).
  8. Shi, Y., Hogue, J., Dixit, D., Koh, J., Olson, J. A. Functional and genetic studies of isolated cells from parathyroid tumors reveal the complex pathogenesis of parathyroid neoplasia. PNAS. 111, (8), 3092-3097 (2014).
  9. Vidal, S. J., et al. Isolation of cancer stem cells from human prostate cancer samples. J. Vis. Exp. (85), e51332 (2014).
  10. Wanping, X., Neckers, L. Targeting the Molecular Chaperone Heat Shock Protein 90 Provides a Multifaceted Effect on Diverse Cell Signaling of Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 13, 1625-1629 (2007).
  11. Moulick, K., et al. Affinity-based proteomics reveal cancer-specific networks coordinated by Hsp90. Nature Chemical Biology. 7, (11), 818-826 (1038).
  12. Alpaugh, M. L., Tomlinson, J. S., Ye, Y., Barsky, S. H. Relationship of sialyl-Lewis(x/a) underexpression and E-cadherin overexpression in the lymphovascular embolus of inflammatory breast cancer. American Journal of Pathology. 161, (2), 619-628 (2002).
  13. Chu, K., Boley, K. M., Moraes, R., Barsky, S. H., Robertson, F. M. The paradox of E-cadherin: role in response to hypoxia in the tumor microenvironment and regulation of energy metabolism. Oncotarget. 4, (3), 446-462 (2013).
  14. Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. PNAS. 107, (18), 8352-8356 (2010).
  15. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10, 483-487 (2013).
  16. Jhaveri, K., et al. Heat shock protein 90 inhibitors in the treatment of cancer: current status and future directions. Expert Opinion on Investigational Drugs. 5, 611-628 (2014).
  17. Gerecitano, J. F., et al. Using 124-PU-H71PET imaging to predict intratumoral concentration in patients on a phase I trial of PU-H71. Journal of Clinical Oncology. 31, Suppl . 11076-11 (2013).
  18. Yildiz-Aktas, I., Dabbs, D. J., Bhargava, R. The effect of cold ischemic time on the immunohistochemical evaluation of estrogen receptor, progesterone receptor, and HER2 expression in invasive breast carcinoma. Modern Pathology. 25, 1098-1105 (2012).
<em>Ex vivo-behandling</em> Reaktion fra primære tumorer og / eller associerede Metastaser til præklinisk og klinisk udvikling af Therapeutics
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).More

Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter