Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Ex vivo behandeling Reactie van primaire tumoren en / of geassocieerde Metastasen voor preklinische en klinische ontwikkeling van Therapeutics

doi: 10.3791/52157 Published: October 2, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Opgericht kanker cellijnen en xenograften hebben de steunpilaar van het onderzoek naar kanker in de afgelopen paar decennia. Echter, recente gegevens blijkt dat de therapeutische respons sterk wordt beïnvloed door de tumorcel micromilieu. Daarom hebben wij een ex vivo analyse van de primaire tumor specimens geneesmiddelontwikkeling doeleinden ontwikkeld.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het ontwikkelen van effectieve kanker geneeswijze heeft bewezen zeer uitdagend te zijn. Kanker cellijnen en tumor explantaten - evenals xenotransplantaties zijn gebruikt in het onderzoek naar kanker meer dan een halve eeuw 1,2,3. Tot op heden, de moleculaire analyse van drug gevoeligheid en weerstand in zowel gevestigde kanker cellijnen en-patiënt afgeleid xenograften (PDX) onontbeerlijk. Echter, testen van verbindingen gevestigde kankercellijnen niet vaak voorspellend in vivo werkzaamheid en overeenkomstige in vivo studies bij dieren, vooral in PDX modellen, is zeer duur en tijdrovend. De beperkingen van deze modelsystemen, namelijk het onvermogen te informeren over de invloed van de natieve micro bij tumorprogressie en reactie op therapeutische strategieën, heeft het veldonderzoek aanvullende methoden om deze analyses complimenteren ontwikkelen geleid. Recente, wordt versterkt aandacht naar ex vivo analyse van patiëntengegevens tumof explantaten 4, 5 door de grotere verstande dat kanker therapeutische respons is niet exclusief de inherente moleculaire samenstelling van kankercellen maar wordt sterk beïnvloed door de tumorcel micro 6, 7, een eigenschap die niet kan worden samengevat door traditionele kweekmethoden en / of PDX. Ex vivo analyse in deze context (dwz., invloed van aangrenzende omringende tumorcellen micro) houdt beoordeling van levensvatbare primaire tumor / metastase secties, in plaats van ex vivo analyse van de cellulaire isolaten 8, 9.

Wij rapporteren hier over een ex vivo techniek (dwz., Precisie gesneden coupes vers) van zowel de patiënt als primaire tumoren en metastasen geassocieerd (dwz, lymfeklieren) dat trouw informeert over respons (IC50), off-target effecten en maakt het mogelijk voor de moleculaire analyse van de weerstand en feedback mechanismen. Daarnaast werd een correlatieve analyse van therapeTherapeutische gevoeligheid / weerstand versus biomarker en genexpressie-profiel kan worden uitgevoerd in een poging om patiënten meer kans om te reageren op de experimentele drug van belang vast te stellen (dwz., hoge drug respons overeenkomt patiënt met bepaalde biologische profiel). Toepassing van de ex vivo techniek en beoordeling in een multi-parameter mode is beweging naar selectie van patiënten en algehele verbetering van de klinische resultaten.

Ex vivo behandeling respons analyse kan een standaard instrument in de preklinische en klinische ontwikkeling van geneesmiddelen tegen kanker worden en wordt voorgesteld als een stap naar een gepersonaliseerde geneeskunde aanpak in therapeutische strategieën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

OPMERKING: Patiënt weefselverkrijging werd geautoriseerd door institutioneel Review Board (IRB) -goedgekeurd Biospecimen en Klinische protocollen (protocol nummers 09-121 en 11-041, respectievelijk) in het Memorial Sloan Kettering Cancer Center.

1 Tissue Procurement

  1. Bij de aanschaf van de patiënt primaire tumor / metastasen
    LET OP: Tot op heden heeft dit protocol zijn uitgevoerd op operatief verwijderd alvleesklier, maag-en borstkanker tumor types, evenals, lymfoom metastasen.
    1. Richt de Chirurgisch team met het model per koerier of buispostsysteem te leveren aan de afdeling Pathologie in goed afgesloten en steriele lekvrije plastic exemplaar zak binnen steriel spill-proof container. Richt de Chirurgisch team met het model te vervoeren in de verse toestand zonder formaline of fixatief.
    2. Richt de patholoog of patholoog assistent van de verse exemplaren te oogsten met behulp van steriele techniek, die meerderludes gebruik van steriele handschoenen en instrumenten in het kader van een laminaire stroming kap.
    3. Noteer de oogsttijd van het verkregen specimen, die strikt wordt gehouden onder 30 min na voltooiing van de chirurgische procedure. Rekening houdend met effecten van koude ischemie, geen monsters van resectiepreparaten met een koude ischemische tijd van> 30 min 18.
    4. Richt de afdeling Pathologie personeel naar een primaire tumor specimen van ongeveer 0,5 cm 3 te verwijderen tot 1,0 cm 3 in een laminaire stroming kap om een steriele omgeving te behouden. Indien mogelijk, kies tumorweefsel van de omtrek van de index laesie potentiële frank centrale necrose (celdood) te voorkomen.
      OPMERKING: Het necrotische weefsel kan schromelijk herkenbaar aan een van de volgende criteria zijn: verlies van kleur of bleekheid van het weefsel; verlies van kracht in die necrotisch weefsel is zacht en bros; een duidelijke afbakening tussen de necrotische en levensvatbaar weefsel.
    5. Richt de pathologist of patholoog assistent na directe bemonstering van de tumor voor diagnostische evaluatie perifere weefsel dat is dan (chirurgische discard) bieden. Plaats het monster in een 15 ml steriele conische centrifugebuis die ongeveer 5 ml minimaal essentieel medium (MEM) dat 1% antibiotica (penicilline en streptomycine).
    6. Indien beschikbaar (bijvoorbeeld lymfeklieren van de oksel staart van mastectomie specimen), kopen een grove positief geassocieerd lymfklier monster van dezelfde grootte (0,5 cm 3-1,0 cm 3) en te vergelijken met drugs respons van de primaire tumor. Vind de primaire tumor specimen, plaatst de bijbehorende lymfeklier monster in een 15 ml steriele conische centrifugebuis die ongeveer 5 ml minimaal essentieel medium (MEM) dat 1% antibiotica (penicilline en streptomycine).
    7. Als maat van chirurgische specimen toelaat (bijvoorbeeld mastectomie specimen), verwijderen (afstand van primaire tumor) een monster van normaal weefsel (dwznormaal dichte / vezelig borst parenchym) en in een 15 ml steriele conische centrifugebuis die ongeveer 5 ml minimaal essentieel medium (MEM) met 1% antibiotica alleen ter overdracht. Na de overdracht aan het laboratorium faciliteiten, de overdracht van de 'normale' specimen een cryovial, 'snap' bevriezen en op te slaan in een -80 ° C vriezer voor toekomstige moleculaire analyses.
    8. Plaats alle exemplaren op nat ijs en direct vervoer naar het laboratorium ruimte voor ex vivo verse weefsel snijden. Niet deel de normale specimen maar eerder op te slaan in een -80 ° C vriezer voor toekomstige moleculaire analyses. De overdracht van een deel van de primaire tumor en de bijbehorende metastase een cryovial, 'snap' bevriezen en op te slaan in een -80 ° C vriezer voor toekomstige moleculaire analyses.
  2. Bij de aanschaf van weefsel uit klinische studies (bijvoorbeeld, optioneel kern naald biopsie (CNB))
    OPMERKING: We krijgen tumor weefsel van patiënteningeschreven op de klinische protocollen die hun toestemming voor een CNB ondergaan van een toegankelijke tumor metastase voorafgaand aan de start van de therapie te geven. CNBS, tot op heden zijn uitgevoerd bij patiënten met borst-, marginale zone lymfoom, mantelcellymfoom, metastatische paraganglioma, baarmoederhals (plaveiselcelcarcinoom) en eierstokkanker.
    1. Hebben klinische personeel uit interventie Radiologie of relevante afdeling uitvoeren van een pre-behandeling kern naald biopsie en plaats het monster in een 15 ml steriele conische centrifugebuis met ongeveer 5 ml minimaal essentieel medium (MEM) met 1% antibiotica (penicilline en streptomycine).
    2. Plaats het biopt op nat ijs en direct vervoer naar het laboratorium ruimte voor ex vivo verse weefsel snijden.

2 Voorbereiding van Materialen voor Sectioning en Vibratome Instellingen

  1. Voorbereiding van Materialen voor Snijden
    1. Maak een 4% agarose-oplossing door het toevoegen van 4 g agastijgen tot 100 ml PBS. Autoclaaf (cycle instellingen: vloeibaar, 121 ° C, 30 min, op 15 pond per vierkante inch) de oplossing voor het eerste gebruik. Voor latere toepassingen, plaatst de 4% agarose in een magnetron te vloeibaar (hoge temperatuur 30 sec interval) voor elk gebruik en koel adequaat op ~ 25 ° C (dat wil zeggen warm aanvoelen) bewust dat agarose stolt bij kamertemperatuur.
    2. Gebruik de 4% agarose als een niet-permanente weefselverwerkingsproces media. Als de 4% agarose voldoende is afgekoeld en nog in vloeibare toestand, met een steriel pincet plaats het weefselmonster in een inbedding schimmel en giet de 4% agarose.
    3. Plaats het weefselmonster dicht (~ 2 mm afstand), maar niet rechtstreeks op de snijvlak wand van de inbedding mal. De 4% agarose zal beginnen om snel stollen, daarom adequaat snel positioneren het weefselmonster. Tijdens het snijden, houd de 4% agarose in een 55 ° C waterbad om in te houden oplossing.
    4. Naar een 24-wells plaat voor sectie analyse, voeg 1 ml of complete media (bijvoorbeeld MEM + 10% foetaal runderserum + 1% antibiotica) aan elk putje. Houd de 24-well plaat bij kamertemperatuur (~ 25 ° C) gedurende de looptijd van het snijden.
  2. Bereiding van Vibratome instellingen
    1. De trillende microtoom, de snelheid waarmee het blad nadert het monster [0 (0,00 mm / seconde) tot 10 (2.5 mm / sec)] en de frequentie van het mes [0 (0 Hz) tot 10 (100 Hz) ]. Pas de instellingen op basis van de structuur van het weefsel (dat wil zeggen, de dichtheid / stevigheid).
    2. Voor een primaire borsttumor van invasief ductaal carcinoom, instellingen 6 en 3 respectievelijk snelheid en frequentie aan te passen. Voor minder dicht / vast tumorweefsel, verlagen de snelheid en dienovereenkomstig te verhogen frequentie.
    3. Stel de sectie dikte binnen de grenzen instrument (1-999 micrometer). Voor deze analyses, stellen de sectie dikte bij 200 micrometer.
    4. Monteer de agarose ingebedde monster met behulp van een dunne laag vloeibare lijm op het objectplaatje that wordt ondergedompeld in een reservoir van media die is ingekapseld in nat ijs.

3 Tissue Sectioning, Behandeling & Analyses

  1. Verwijder de precisie gesneden secties onmiddellijk na het snijden met steriele pincet en plaats in een multi-well plaat met 1 ml van compleet medium. Wanneer voldoende secties worden verkregen voor reactie en correlatieve analyses, plaatst de multi-well plaat voor geneesmiddelen in een weefselkweek incubator ingesteld op standaard weefselkweek condities.
  2. Neem multiple control gedeelten die de behandelde gedeelten bookend in een poging om dosisafhankelijke respons bevestigen tegenover gekweekte artefacten. Voeren weefsel snel snijden (~ 30 - 40 min), ruim binnen nadelige effecten van koude ischemie tijd (~ 2-4 uur) 18. Voeren behandeling van secties slechts na een 1 uur acclimatisatie periode.
  3. Na de 1 hr acclimatiseringsperiode, voeg toenemende doses (therapeutisch relevant;
  4. Na de behandeling verwijdert alle afdelingen onder steriele omstandigheden en formaline-oplossing door het plaatsen van de weefselsectie in een buis met hetzij 10% gebufferde formaline en plaats bij kamertemperatuur O / N of in een buis met 4% paraformaldehyde (verdund 16% paraformaldehyde uit een flacon met PBS om een ​​uiteindelijke concentratie van 4%) en plaats bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
    1. Fix grotere weefselcoupes (bv., ~ 6 mm x 4 mm) 200 pm dik in 10% gebufferde formaline O / N bij kamertemperatuur. Fix kleinere delen (bv., 1 mm x 1 mm) 200 pm dik in 4% paraformaldehyde gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Voor een efficiënte penetratie van fixatief het volume van fixative worden 20X het volume weefsel. Gezien het feit dat dit protocol resulteert in extreem kleine weefsel maten (bv 6 mm 3 weefsel = 6 pi volume), voor de zekerheid van een goede fixatie gebruik 1 ml fixeermiddel voor alle weefsels maten.
    2. Na fixatie hebben de weefselmonsters in paraffine ingebed door de afdeling Pathologie personeel. Sectie specimen paraffine blokken op laste dia's hematoxyline en eosine gekleurde en beoordeeld immunohistochemisch (bijvoorbeeld apoptose) zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Voor dit onderzoek werd de ex vivo techniek in een correlatieve analyse van therapeutische gevoeligheid / weerstand van een heat shock eiwit 90 inhibitor (Hsp90i). In een preklinische beoordeling van deze Hsp90i, borstkanker primaire tumor, een ER + invasief ductaal carcinoom (IDC) en bijbehorende lymfeklier werden ex vivo geanalyseerd op behandelingsrespons   (Figuur 1). Multiple 200 urn serial secties werden behandeld met vehikel alleen en toenemende doses (0,25, 0,50, 1,0 en 2,5 uM) van de Hsp90i. De gegevens in figuur 1 is in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) en hematoxyline en eosine (H & E) gekleurde coupes na een 48 uur behandelingsperiode. De besturing (voertuig alleen) behandeld sectie toont levensvatbaar IDC nesten, terwijl de 2,5 uM behandeld weefsel deel resulteerde in een 40% inductie van apoptose zoals gezien door nucleaire morfologische veranderingen (dwz pyknotische kernen / APOPTotic puin) (Figuur 1A). Apoptose werd verder bevestigd in de primaire tumor met eindstandige deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) analyse (gegevens niet getoond). IC50 wordt berekend uit de gegevens met grafieken procent apoptose tegen de concentratie van het geneesmiddel. Aanzienlijk, de chaperonne Hsp90 speelt een sleutelrol bij eiwit stabilisatie en homeostase kritische signaalwegen van normale en kankercellen 10. Het vermogen om Hsp90 richten kanker berust op de vaststelling dat kwaadaardige cellen sterk afhankelijk van de chaperoning functie van Hsp90, vooral in een poging om gewezen toestanden van onherbergzame omgevingen die tijdens metastatische progressie overwinnen. In wezen kanker cellen sterk afhankelijk Hsp90 functie resulteert in een selectief targeten pool van 'oncogene' Hsp90 11. In de insert, figuur 1A, aangrenzende goedaardige lobule met bijbehorende acini en duct blijft ongewijzigd in dezelfde 2,5 uM Hsp90i behandelde gedeelte. Voor zover ons bekend, is dit de eerste keer dat dit Hsp90 kanker-specificiteit wordt visueel vastgelegd in Hsp90i respons-evaluatie van primaire tumoren en metastasen geassocieerd. Deze bevinding van onveranderde goedaardige / normale cellen gezien in aangrenzende goedaardige melkklieren van IDC (figuur 1A) en vaartuigen in het omringende parenchym goedaardige borst van de primaire tumor en geassocieerde lymfeknoop metastasen (gegevens niet getoond) is samengevat in verschillende soorten tumoren (bijvoorbeeld borst, maag en lymfoom metastasen).

Een begeleidende lymfekliermetastase van deze primaire tumor toonde een volledige respons alleen in de IDC nesten die losjes verbonden waren (Figuur 1B). IDC nesten die gevormd strak sferoiden bleef echter levensvatbaar zoals bevestigd door TUNEL (figuur 1C). Bijkomende analyse van de levensvatbare IDC sferoiden door immunofluorescentie onthuldeen aanhoudende of re-expressie van de cel-cel adhesie molecule, E-cadherine (figuur 1C). Deze bevinding is consistent met aanhoudende, over-expressie van E-cadherine toevoegen aan het metastatisch potentieel of gemetastaseerde efficiëntie blijkt uit de zeer kwaadaardige, dodelijke inflammatoire borstkanker 12, 13. Hoewel interessant, deze bevinding is buiten het bestek van dit document. Het is echter belangrijk op te merken dat deze lymfeklieren (LN) IDC sferoïden in kweek werden gedurende een periode van 2 weken en geeft daarmee geloof aan de sterkte van het gebruik van ex vivo techniek zowel gevoeligheid / resistentie in preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen te bestuderen.

De ex vivo techniek werd ook gebruikt in een klinische studie over de kern naald biopten (CNBS) voor het bewijs van remming doel in tumoren 16,17. Patiënten die toestemming voorbehandeling kernnaaldbiopsie (CNB) procedure uitgevoerd (figuur 2) hebben. Vergelijkbaarnaar de preklinische evaluatie van primaire tumoren, wordt de ex vivo techniek gebruikt om de gevoeligheid of de reactie in de CNB van toegankelijke uitzaaiingen te bepalen. Multiple 200 urn seriecoupes van CNB werden behandeld met alleen en toenemende doses (0,25, 0,50, 1,0 en 2,5 uM) van de Hsp90i voertuig. Het aantal Hsp90i doseringen gebruikt voor ex vivo bepaling wordt bepaald door de grootte van CNB. Echter, wordt alles in het werk gesteld om het spectrum van doseringen boven gesuggereerd gebruiken. Zoals de preklinische ex vivo bepaling kan respons geëvalueerd en later vergeleken met de werkelijke patiënt respons (dwz correlatieve analyses Figuur 2) zoals bepaald door nabehandeling CNB farmacokinetische (PK), dwz geneesmiddelretentie gemeten via vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS) analyse en in patiënten PET imaging (figuur 2) 16,17. Tot op heden analyses met de ex vivo techniek in deze cKLINISCHE GEGEVENS studie is uitgevoerd op meerdere typen tumoren (bijvoorbeeld borstkanker, marginale zone lymfoom, mantelcellymfoom, metastatische paraganglioma, baarmoederhals en eierstokkanker) 16, 17. Volledige correlatieve analyse uitvoering van de ex vivo techniek verder een voorbeeld van het nut van deze techniek in klinische ontwikkeling van geneesmiddelen.

Figuur 1
Figuur 1 Ex vivo respons-analyse van een ER + borstkanker. (A, linker paneel) toont levensvatbare nesten van invasief ductaal carcinoom (IDC) (Hematoxyline en eosine gekleurd; schaal bar 100 micrometer). Na behandeling (A, rechter paneel) met 2,5 uM van Hsp90i er een inductie van ~ 40% apoptotische respons (pyknotische kernen / apoptotische puin; pijlen) (Hematoxyline en eosine gekleurd; schaal bar 100 micrometer). Goedaardige melkklieren g> (A, insert) blijft ongewijzigd na de behandeling (Hematoxylin en eosine gekleurde; schaal bar 200 pm). De besturing van een bijbehorende lymfeklieren (LN) (B, linker paneel) toont een kleine mate van apoptose (Hematoxyline en eosine gekleurd; schaal bar 100 micrometer), terwijl het behandelde gedeelte (B, rechts panelen) geven een oppervlakte van metastatische IDC nesten met complete respons (Hematoxyline en eosine gekleurd; schaal bar, met de klok mee 2 mm, 300 micrometer 200 micrometer en 200 micrometer). Echter, IDC strakke sferoïden (sferoïden; Sp) van dezelfde sectie (C, linkerpaneel) laten weinig of geen apoptose zoals blijkt uit TUNEL analyse vormt een levensvatbare met een gelijktijdige (schaalbalk 200 micrometer) (C, rechter paneel) langer -expressie van E-cadherine (vergroting 100X).> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2 Schematische voorstelling van de uitvoering van ex vivo techniek in een klinische studie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kanker biologen worden geconfronteerd met grote uitdagingen bij een poging om effectieve therapeutische strategieën te ontwikkelen. Het testen van geneesmiddelen in ontwikkeling op gevestigde kanker cellijnen kan niet altijd volledig zijn in vivo respons en in vivo experimenten op PDX modellen zijn arbeidsintensief en zeer duur. Gezien het bovenstaande is de toepassing van ex vivo technieken van primaire tumoren van patiënten 14, 15 bevindt zich nu naast de moleculaire analyse van gevestigde kanker cellijnen en-patiënt afgeleid xenograften (PDX).

Dit document, waarin de toepassing van de ex vivo techniek om een nieuwe hoogte in de techniek getrouw informeert de respons (IC50), off-target effecten en maakt moleculaire analyse van weerstand en feedback mechanismen. Wanneer responsgegevens is gecorreleerd aan de tumor moleculaire profiel (met name, eiwitexpressie tumor biomarkers, mutaties) de correlatieve studie (respons versus tumor molecular profiel) kunnen worden gebruikt om patiënten meer kans om te reageren op een bepaald geneesmiddel selecteert, in een poging de patiënt resultaten te verbeteren. Het meest significant, in klinische ontwikkeling van geneesmiddelen (dwz. Optioneel biopsies), ex vivo respons van voorbehandeling CNB kan worden gecorreleerd met (en gevalideerde) in patiënten respons (dwz nabehandeling CNB) en geneesmiddelretentie (farmacokinetische (PK) evaluatie) 16,17. Het gebruik van ex vivo techniek in deze klinische studie kon tumorrespons en bevestigen doelwit specificiteit (dwz PD; Hsp70 inductie) en stelt de dosering en programmering 16,17.

De ex vivo techniek is ontvankelijk voor de meeste Solid tumoren en bloed-gedragen kanker metastasen (bijvoorbeeld metastasen van lymfoom) met kleine aanpassingen in het protocol voor bepaalde tumor die kleine uitdaging vormen. Bijvoorbeeld, tumoren van de alvleesklier neiging om een ​​hoge s hebbentroma tumorcellen ratio, wat kan resulteren in gedeelten die slecht kankercel vertegenwoordiging. Bij de aanschaf van kankercel rijke gebieden van de tumor kan niet worden gesteld van de bruto-analyse. Daarom dit potentieel tekortkoming meerdere kleinere kubieke gebieden van de tumor specimen kan worden ingebed (4 / agarose-inbedding schimmel) en tegelijkertijd doorgesneden verhogen de kans op een tumorcel-rijke ex vivo sectie overwinnen.

Onze gegevens een groot voorstander van het gebruik van de ex vivo techniek in preklinische geneesmiddelenontwikkeling (figuur 1). Samen met de reactie van (IC50), repliceren secties kunnen worden geanalyseerd voor alternatieve levensvatbaarheid assays, metabolomics, combinatorische therapeutische strategieën, effect drug exposure heeft op uitgescheiden factoren (bijvoorbeeld cytokines, exosomen), weerstand en feedback mechanismen en belangrijker nog, te informeren over off-target effecten (dwz, normale en goedaardige cellen). In dit onderzoek dat een Hsp90i gebruikt, richten specificity en identificatie van "off-target effecten 'is de belangrijkste basis van de veronderstelling dat er een onderscheidende pool van' oncogene Hsp90 'alleen gevonden in kankercellen op maligne transformatie 10. Dit wordt weergegeven in de resultaten sectie (insert, figuur 1A) waar goedaardige melkklieren van een ex vivo Hsp90i-behandelde deel ongewijzigd gebleven. Van even groot belang, in een ander deel van dezelfde primaire tumor weergegeven in figuur 1, een 10 pM (therapeutisch relevant dosis) behandelde gedeelte toonde volledige reactie van IDC nesten dat geassocieerd ductaal carcinoma in situ (DCIS) bleef ongewijzigd (data niet getoond) . Toekomstig onderzoek in deze lijn van onderzoek vallen buiten het bestek van dit artikel. Echter, dit conclusie informeert over de toestand van "maligne transformatie of progressie van geassocieerde DCIS in IDC specimens met betrekking tot het oncogeneHsp90 chaperoning functioneren en ondersteunt het nut van het gebruik van de ex vivo techniek in de ontwikkeling van geneesmiddelen.

Een extra toepassing van de ex vivo techniek is het gebruik in de pre-analyse van de werkzaamheid in de tumor xenotransplantaatmodellen (dwz., Ex vivo snijden van PDX) in de ontwikkeling van geneesmiddelen voor de farmacokinetische / farmacodynamische (PK / PD) van gegevens voorafgaand aan het uitvoeren betrokken, dure bepalen in vivo studies - de mogelijkheid van een meer geïnformeerde, kosten-effectief in vivo werkzaamheid van het geneesmiddel studie.

De belangrijkste stappen en mogelijke beperkende factoren van de ex vivo techniek zijn inkoop en snijden. Bij de aanschaf van de tumor specimen (dwz., Primaire tumor / metastasen) moet snel uitgevoerd met veel aandacht voor het identificeren van een gebied van de tumor met de grootste mate van levensvatbaarheid. Grote tumoren hebben de neiging om necrotische centrale gebieden die niet zijn schromelijk zichtbaar hebben. Daarom is de aanschaf van weefsel from de buitenste meest rand verhoogt kans op het verkrijgen van een levensvatbare exemplaar. Met betrekking tot snijden, verzamelen nauwkeurigheid segmenten op de gewenste dikte (bijvoorbeeld. 200 urn) wordt sterk beïnvloed door tumor dichtheid / hardheid (exclusief CNBS vanwege de extreem kleine afmeting). Bijvoorbeeld, invasief ductaal carcinoom typisch veel dichter in tegenstelling tot invasief lobulair carcinoom. Dichte tumorweefsel biedt voldoende weerstand - in afwezigheid van permanente inbedding media - om het blad, terwijl minder dichte tumorweefsel niet. Voorbeelden van minder dichte tumor weefselsoorten omvatten maar zijn niet beperkt tot invasief lobulair carcinoom, mucineus carcinomen en maag tumortypen. Om dit potentieel beperking te overwinnen, is het oplossen van problemen met de juiste mes snelheid en frequentie vereist. Consistente precisie gesneden sectie dikte, gedurende het snijden proces, is van cruciaal belang voor een nauwkeurige evaluatie van de respons op geneesmiddelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000s Leica 14047235613
UltraPure agarose Invitrogen 16500500 Prepare 4% and 6% before use
Injector blade Ted Pella 121-4
MEM with Penicillin  + Streptomycin Media Core Facilities (MSKCC) The media is prepared at Memorial Sloan Kettering Cancer Center 
Scalpel no. 10 Thermo Scientific 31-200-32
Disposable forceps Cole-Parmer 84011182
Embedding mold Electron Microscopy Science 70181
FBS (heat inactivated) Gemini 100106
24 well plates Corning 3524
Formalin (10%) Sigma Diagnostics SDHT501128 
16% Formaldehyde solution Thermo Scientific 28908
Embedding microsettes Simport M503-2
Ethanol (70%) Fisher Scientific A405P-4
Waterbath Fisher Scientific 15-462-2SQ
Microwave General Electric ModelJES2051DNBB
Adhesive (Ethyl Cyanoacrylate) Sigma-Aldrich E1505-5G
10 mm dishes BD Falcon 353003
15 ml tubes BD Falcon 352096

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abercrombie, M., Ambrose, E. J. Interference Microscope Studies of Cell Contacts in Tissue Culture. Experimental Cell Research. 15, (58), 332-345 (1958).
  2. Coriell, L. L., McAllister, R. M., Wagner, B. M. Criteria for Determining Malignancy in Tissue-Culture Cell Lines in the Albino Rat. New York Academy of Science. 5, 351-355 (1957).
  3. Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
  4. Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analysis of human tumors. Cell Cycle. 11, (14), 2756-2761 (2012).
  5. Bray, K., et al. Bcl-2 Modulation to Activate Apoptosis in Prostate Cancer. Molecular Cancer Research. 7, (9), 1487-1496 (2009).
  6. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19, (11), 1423-1437 (2013).
  7. Nakasone, E. S., et al. Imaging Tumor-Stroma Interactions during Chemotherapy Reveals Contributions of the Microenvironment to Resistance. Cancer Cell. 21, 488-503 (1016).
  8. Shi, Y., Hogue, J., Dixit, D., Koh, J., Olson, J. A. Functional and genetic studies of isolated cells from parathyroid tumors reveal the complex pathogenesis of parathyroid neoplasia. PNAS. 111, (8), 3092-3097 (2014).
  9. Vidal, S. J., et al. Isolation of cancer stem cells from human prostate cancer samples. J. Vis. Exp. (85), e51332 (2014).
  10. Wanping, X., Neckers, L. Targeting the Molecular Chaperone Heat Shock Protein 90 Provides a Multifaceted Effect on Diverse Cell Signaling of Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 13, 1625-1629 (2007).
  11. Moulick, K., et al. Affinity-based proteomics reveal cancer-specific networks coordinated by Hsp90. Nature Chemical Biology. 7, (11), 818-826 (1038).
  12. Alpaugh, M. L., Tomlinson, J. S., Ye, Y., Barsky, S. H. Relationship of sialyl-Lewis(x/a) underexpression and E-cadherin overexpression in the lymphovascular embolus of inflammatory breast cancer. American Journal of Pathology. 161, (2), 619-628 (2002).
  13. Chu, K., Boley, K. M., Moraes, R., Barsky, S. H., Robertson, F. M. The paradox of E-cadherin: role in response to hypoxia in the tumor microenvironment and regulation of energy metabolism. Oncotarget. 4, (3), 446-462 (2013).
  14. Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. PNAS. 107, (18), 8352-8356 (2010).
  15. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10, 483-487 (2013).
  16. Jhaveri, K., et al. Heat shock protein 90 inhibitors in the treatment of cancer: current status and future directions. Expert Opinion on Investigational Drugs. 5, 611-628 (2014).
  17. Gerecitano, J. F., et al. Using 124-PU-H71PET imaging to predict intratumoral concentration in patients on a phase I trial of PU-H71. Journal of Clinical Oncology. 31, Suppl . 11076-11 (2013).
  18. Yildiz-Aktas, I., Dabbs, D. J., Bhargava, R. The effect of cold ischemic time on the immunohistochemical evaluation of estrogen receptor, progesterone receptor, and HER2 expression in invasive breast carcinoma. Modern Pathology. 25, 1098-1105 (2012).
<em>Ex vivo</em> behandeling Reactie van primaire tumoren en / of geassocieerde Metastasen voor preklinische en klinische ontwikkeling van Therapeutics
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).More

Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter