Summary
確立された癌細胞株および異種移植片は、過去数十年の間、癌研究の主流となっている。しかし、最近の証拠は治療応答を大幅に腫瘍細胞の微小環境によって影響されることを示唆している。そこで、薬剤開発目的のために原発腫瘍標本のex vivo分析を開発した。
Introduction
有効な癌治療を開発することが極めて困難であることが証明された。癌細胞株および腫瘍外植-ならびに異種移植片は、半世紀以上の1,2,3のための癌研究に使用されている。現在までに、両方の確立された癌細胞株および患者由来の異種移植片（PDX）における薬剤感受性と耐性の分子分析が不可欠である。しかし、確立された癌細胞株における化合物の試験は、多くの場合、 インビボでの有効性の予測ではなく、特にPDXモデルにおいて、動物においてin vivo研究対応する、非常に高価であり、時間がかかる。これらのモデル系、腫瘍の進行および治療戦略に応じて、ネイティブの微小環境の影響に通知することができない、すなわちの限界は、これらの分析を補完するための追加の方法を開発する研究分野をリードしてきました。最近の中でも、高まり注意が患者TUM のex vivo解析に向けて注目されている癌治療反応は、癌細胞の固有の分子組成に排他的ではなく、むしろ大幅に伝統的な培養法によって再現したことができない腫瘍細胞の微小環境6,7機能によって影響されることにより、より深く理解するか、外植片4、5 /またはPDX。上記の文脈におけるエクスビボ分析が（ すなわち 、隣接する周囲の腫瘍細胞の微小環境の影響が）、むしろ、携帯分離株8,9 のex vivo分析よりも、生存可能な原発腫瘍/転移切片の評価を意味する。
私たちは忠実に、応答（IC 50）に通知するオフターゲット効果と分子を可能にし、患者の原発腫瘍と関連する転移（ すなわち 、リンパ節）の両方のex vivo手法（ すなわち 、精密スライスされた新鮮な組織切片）でここに報告抵抗とフィードバックのメカニズムの解析。さらに、therapeの相関分析バイオマーカーおよび遺伝子発現プロファイルに対するUTIC感受性/抵抗性（ すなわち 、高い薬物応答が特定の生物学的プロフィールを有する患者と一致する）関心のある試験薬に応答する可能性が高い患者を同定するための努力を行うことができる。マルチパラメータ方式でex vivoでの手法や評価の適用は、患者の選択と臨床転帰の全体的な改善に向けた動きである。
エクスビボ治療応答解析は、癌治療薬の前臨床および臨床開発における標準的なツールになる可能性があり、治療上の開発戦略における個別化医療のアプローチに向けたステップとして想定される。
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Protocol
注：患者組織の調達を制度的に審査委員会を通じて認定されました（IRB）は、メモリアル·スローン·ケタリングがんセンターで生体試料と臨床プロトコル（それぞれのプロトコル番号09から121と11から041を）承認の。
1組織調達
- 患者の原発腫瘍/転移の調達
注：現在まで、このプロトコルは外科的に除去膵臓癌、胃癌および乳癌の腫瘍タイプ、ならびに、リンパ腫転移に行われている。- 無菌流出防止の容器内に密閉し、滅菌漏れ防止プラスチック片袋での病理部門に宅配便または気送管システムによって試料を提供するために外科チームを指揮。ホルマリン又は固定剤なしで新鮮な状態で試料を輸送する外科チームを指揮。
- 無菌技術を使用して、新鮮な試料を採取する病理医や病理医のアシスタントに指示し、その株式会社層流フードで無菌手袋や楽器のludes使用。
- 外科処置の完了から30分の下で厳密に維持され、調達検体の収穫時間を記録します。冷たい虚血の考慮の影響を考慮して、> 30分18の冷たい虚血時間とともに切除標本からサ ンプルを取ることはありません。
- 無菌環境を維持するために、層流フード中で約0.5cm 3〜1.0センチメートル3の原発腫瘍標本を除去するために病理部門要員を導く。可能な場合には、潜在的な率直な中心壊死（細胞死）を回避するために、インデックス病変の周囲から腫瘍組織を選択します。
注：壊死組織は、次の基準のいずれかにより肉眼的に認識可能性があります。色や組織の蒼白の喪失;壊死組織が柔らかく、もろいある、強度の低下;壊死性と生存組織との間に明確な境界。 - pathologiを指示STまたは診断評価のための腫瘍の直接のサンプリング後過剰（外科的廃棄）である末梢組織を提供するために、病理学者の助手。約5mlの1％抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を含む最小必須培地（MEM）のを含む15ミリリットルの無菌コニカル遠心管に試料を置きます。
- 利用できる（ 例えば、乳房切除標本の腋窩尾部のリンパ節）は、同じサイズ（0.5 cm 3のセンチ3〜1.0）の著しくポジティブに関連するリンパ節試料を調達し、原発腫瘍の薬物反応と比較した場合。原発腫瘍試料と同様に、約5mlの1％抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を含む最小必須培地（MEM）のを含む15ミリリットルの無菌の円錐遠心管に関連するリンパ節試料を置く。
- 手術標本が許す（ 例えば、乳房切除標本）のサイズならば、 すなわち （（原発腫瘍から離れた）正常組織のサンプルを削除約5mlの転送のみを目的とし、1％の抗生物質を含有する最小必須培地（MEM）のを含む15ミリリットルの無菌コニカル遠心管において正常濃密/繊維状乳房実質）と場所。研究施設に移した後、将来の分子解析用のC冷凍庫-80℃で凍結バイアル、「スナップ」を凍結し、店に「正常な」試料を移す。
- 濡れた氷の上ですべての試料を置き、すぐにex vivoで新鮮な組織切片のための実験室のスペースに輸送する。ていないセクション通常の検体の操作を行いますが、むしろ将来分子解析のためのCの冷凍庫-80℃で保管してください。将来の分子解析のために-80℃の冷凍庫で凍結バイアル、「スナップ」を凍結し、ストアへの原発腫瘍の一部及び関連する転移を転送します。
- 臨床研究からの組織の調達（ 例えば 、オプションのコア針生検（CNB））
注：私たちは、患者から腫瘍組織を得る治療開始前にアクセス可能な腫瘍転移のCNBを受ける彼らの同意が臨床プロトコルに登録した。 CNBSは、今日まで、乳房、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、転移性傍神経節腫、子宮頸部（扁平上皮）及び卵巣癌を有する患者に対して実施されてきた。- インターベンショナルラジオロジー又は関連部門からの臨床担当者は、前処理コア針生検を実行し、約5mlの1％抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を含む最小必須培地（MEM）のを含む15ミリリットルの無菌の円錐遠心管に試料を配置しています。
- 濡れた氷の上の生検標本を置き、すぐにex vivoで新鮮な組織切片のための実験室のスペースに輸送する。
セクショニングとビブラトーム設定のための材料の調製
- セクショニングのための材料の作製
- AGA物4gを添加することにより、4％アガロース溶液を作る100mlのPBSに上昇した。オートクレーブ（サイクルの設定：液体、121℃、30分、平方インチ当たり15ポンド）最初の使用前の溶液。その後の使用のために、アガロースは室温で固化することを心に留め、各使用の前に（30秒間隔の高熱）を液化し、適切〜25℃（ すなわち 、暖かいタッチする）まで冷却し、マイクロ波中、4％アガロースを配置。
- メディアを埋め込む非永久組織として、4％アガロースを使用してください。とき4％アガロースを十分に冷却し、滅菌ピンセット埋め込み型内に組織標本を配置し、4％アガロースに注ぐと、液体状態のままである。
- ポジション埋め込む金型の切削面の壁に直接（〜2mmの距離）の近くではなく、組織標本。 4％のアガロースは、したがって、適切に迅速に組織標本を置き、迅速に固化し始めます。切片の間に、溶液中に保つために55℃の水浴中で4％アガロースを保つ。
- セクション分析のために24ウェルプレートに1mlのO追加各ウェルにfを完全培地（ すなわち 、MEM + 10％ウシ胎児血清+ 1％抗生物質）。切片の期間を通じて、RT（〜25℃）で24ウェルプレートを保管してください。
- ビブラトーム設定の調製
- 0〜10（0ヘルツ）[振動ミクロトームを使用して、[（2.5ミリメートル/秒）0〜10（0.00ミリメートル/秒）]刃が試料に接近する速度を設定し、ブレードの周波数（100ヘルツ） ]。組織（ すなわち、密度/硬さ）の質感に合わせて設定を調整します。
- 浸潤性乳管癌の原発性腫瘍の場合は、それぞれ6および図3に示すように、速度や周波数に設定を調整します。密度の低い/事務所腫瘍組織では、速度を低下させ、それに応じて周波数を上げる。
- （ - 999ミクロン1）計器限界内で切片厚を設定してください。これらの分析のために、200ミクロンで切片厚を設定してください。
- 試料ディスクの股関節に液状の接着剤の薄層を用いてアガロース包埋標本をマウントtが濡れた氷に包まれているメディアのリザーバ内に浸されている。
3組織セクショニング、トリートメント＆分析
- 完全培地1mlでマルチウェルプレートに滅菌ピンセットと場所を使用して切片化後すぐに精密スライスされたセクションを削除します。十分な切片応答と相関分析のために取得されると、標準的な組織培養条件に設定された組織培養インキュベーター中で治療反応のためのマルチウェルプレートに置く。
- 培養された成果物とは対照的に、用量依存性の応答性を確認する目的で処理された部分をブックエンド、複数の制御部を取る。 （ - 4時間〜2）18だけでなく冷たい虚血時間の任意の有害な影響の中、 - （40分〜30）急速に切片組織を実行します。わずか1時間の順応期間を以下のセクションでの治療を行います。
- 治療関連（1時間の順応期間の後、漸増用量を追加します。
- 処置後、RT Oで10％緩衝ホルマリンと場所のいずれかを含有するチューブ中に組織切片を置くことによって、無菌条件下およびホルマリン固定の下のすべてのセクションを削除/ Nまたは4％パラホルムアルデヒドを含むチューブに（バイアルから16％のパラホルムアルデヒドを希釈4％の最終濃度にPBSで）と室温で2時間置く。
- 大きな組織切片を修正しました。（ 例えば 、〜6ミリメートル×4 mm）の10％緩衝ホルマリンOにおける厚さ200μm/ RTでN。小さ なセクションを修正しました。（ 例えば 、1ミリメートル×1 mm）で、室温で2時間、4％パラホルムアルデヒド中で厚さ200μm。
注：固定液Fの容量の効率的な浸透のためにixativeは組織の容積を20Xする必要があります。適切な固定利用の確保すべての組織の大きさのための固定液1ミリリットルのための非常に小さな組織のサイズでこのプロトコルは、結果（ 例えば、6ミリメートル3組織= 650μl容量）ことを考える。 - 固定後の組織標本を病理部門担当者がパラフィン包埋持つ。ヘマトキシリンおよびエオシン染色し、免疫組織化学的に評価した（ 例えば、アポトーシス）に帯電スライド上節検体のパラフィンブロックを。
- 処置後、RT Oで10％緩衝ホルマリンと場所のいずれかを含有するチューブ中に組織切片を置くことによって、無菌条件下およびホルマリン固定の下のすべてのセクションを削除/ Nまたは4％パラホルムアルデヒドを含むチューブに（バイアルから16％のパラホルムアルデヒドを希釈4％の最終濃度にPBSで）と室温で2時間置く。
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Representative Results
この研究のために、ex vivoでの技術は、熱ショックタンパク質90阻害剤（Hsp90i）の治療感受性/耐性の相関分析に用いた。このHsp90i、乳癌の原発腫瘍の前臨床評価において、ER +浸潤性乳管癌（IDC）、および関連するリンパ節転移を分析したex vivoでの治療応答を （ 図1）。複数200μmの連続切片をHsp90iの車両のみと漸増用量（0.25、0.50、1.0および2.5μM）で処理した。 図1のデータは、48時間の処理期間後、ホルマリン固定、パラフィン包埋（FFPE）、ヘマトキシリン＆エオシン（H＆E）染色した切片を表す。核形態学的変化によって見られるように、2.5μM処理した組織部は、アポトーシスの40％の誘導をもたらしたのに対し、処理区対照（媒体のみ）を実行可能なIDCの巣を示し（ すなわち、濃縮核/ APOP漸近破片）（ 図1A）。アポトーシスはさらにターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識（TUNEL）分析によって、原発腫瘍で確認された（データは示さず）。 IC50は、薬物濃度対パーセントアポトーシスをグラフ化することによって応答データから算出される。重要なことに、シャペロンは、Hsp90は、正常細胞と癌細胞10の両方の重要なシグナル伝達経路のタンパク質の安定化および恒常性において重要な役割を果たしている。癌でのHsp90を標的とする能力は、悪性細胞が大きく、特に、転移性の進行中に遭遇した無愛想な環境のストレスを状態を克服するための努力において、Hsp90のシャペロン機能に依存するという知見に依存しています。本質的には、癌細胞は、「発癌性」はHsp90 11のターゲッティング可能な選択的なプールをもたらしHsp90機能に大きく依存するようになる。挿入では、 図1A、関連する腺房とダクトとの隣接良性小葉は変更私のままnは同じ2.5μMHsp90i処理区。私たちの知る限りでは、これがこのHsp90の癌特異性を視覚的に原発腫瘍および関連する転移のHsp90i応答査定に取り込まれているが初めてである。不変の良性/正常IDC（ 図1A）の隣接良性小葉に見られるように、細胞ならびに原発腫瘍の周囲の良性乳房柔組織内の血管と関連するリンパ節転移のこの発見は（データは示していない）、いくつかの異なる中で要約されている腫瘍タイプ（ 例えば、乳癌、胃癌およびリンパ腫転移）。
この原発腫瘍の添付リンパ節転移はゆるく関連していたIDCの巣（ 図1B）での完全な反応を示した。 TUNEL（ 図1C）によって確認されるようにタイトなスフェロイドを形成されたIDCの巣は、しかし、実行可能なままであった。免疫蛍光法により実行可能なIDCのスフェロイドのさらなる分析が明らかにした細胞間接着分子E-カドヘリンの持続性または再発現（ 図1C）。この知見は、過剰発現は悪性度の高い、致死炎症性乳癌12、13に反映されているように、E-カドヘリンが転移能または転移効率への追加の、永続的に一致している。、この知見は、この論文の範囲を超えて面白いですが。しかし、これらのリンパ節（LN）IDCスフェロイドは2週間の期間培養で維持されたことに注目することが重要であるため、前臨床薬剤開発の両方の感受性/耐性を研究するために、エクスビボ技術を使用しての強さに信憑性。
ex vivoでの技術はまた、腫瘍16,17における標的阻害の証拠のためのコア針生検（CNBS）の臨床試験で採用されている。治療前コア針生検（CNB）手続きが行われます（ 図2）を持って同意、患者。匹敵する原発腫瘍の前臨床評価に、 エキソビボ技術がアクセス可能な転移のCNB感度または応答を決定するために使用される。 CNBの複数200μmの連続切片は、車両のみとHsp90iの漸増用量（0.25、0.50、1.0および2.5μM）で処理した。 ex vivoの評価に使用Hsp90i用量の数は、CNBの大きさによって決定される。しかし、すべての努力が上記で提案用量のスペクトルを使用するようになっている。前臨床ex vivoでの評価と同様に、応答を評価することができ、後に患者の反応に実際と比較（ すなわち 、相関分析;図2）、 すなわち、薬物保持は、液体クロマトグラフィーによって測定されるように、後処理CNB薬物動態（PK）によって決定されるタンデム質量分析（LC-MS / MS）は、患者のPET画像化（ 図2）16,17ならびに解析する。現在までに、この（c）にex vivoでの技術を用いて解析し、linical研究では、複数の腫瘍型に対して実施（ 例えば 、乳癌、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、転移性傍神経節腫、子宮頸部および卵巣癌）、16、17。 エキソビボ技術を実施全相関解析されたさらにこの技術の有用性を例示している臨床医薬品開発。
ER +乳癌の図1 エクスビボ応答解析。 （;スケールバーは100μmヘマトキシリンおよびエオシン染色）（A、左のパネル）は、浸潤性乳管癌（IDC）の生巣が表示されます。 （ヘマトキシリンおよびエオシン染色し、スケールバーは100μm）; Hsp90iの2.5μMでの治療（A、右パネル）の際〜40％アポトーシス応答（矢印濃縮核/アポトーシス破片）の誘導があります。良性小葉
臨床試験におけるex vivoの技術の実施の図2の回路図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
有効な治療戦略を開発しようとすると、がんの生物学者は、重要な課題に直面しています。確立された癌細胞に発達中の薬剤のテストラインが正確にPDXモデルでインビボ応答およびin vivo実験に反映しないことができ、労働集約的で極めて高価である。上記の、ex vivoでの適用は、原発性腫瘍患者14の技術は、15は、現在確立された癌細胞株および患者由来の異種移植片（PDX）の分子解析の横に配置されている。
技術は忠実に、応答（IC 50）に通知するオフターゲット効果と抵抗とフィードバックのメカニズムの分子分析を可能にするという点で、本論文では、新しい高さにex vivoで技術の適用を取ります。応答データは、腫瘍の分子プロフィール（ すなわち、腫瘍バイオマーカー、突然変異のタンパク質発現）と相関する相関研究（モル対腫瘍応答ecularプロファイル）は、患者の転帰を改善する目的で、特定の薬物に応答する可能性が高い患者を選択するために使用することができる。最も重要なのは臨床医薬品開発（ すなわち 、オプショナル生検）で、前処理CNB のex vivo応答は患者の反応にと相関（および検証）することができます（ すなわち、処置後CNB）と薬物保持率（薬物動態学（PK）評価） 16,17。 （;のHsp70誘導すなわち、PD）、および投薬量およびスケジューリング16,17に知らせるこの臨床研究ではex vivoで技術の使用は、腫瘍反応だけでなく、確認対象の特異性を決定することができました。
ex vivoでの技術は、大部分の固形腫瘍タイプに適してだけでなく、血液由来の癌転移である（ 例えば、リンパ腫のリンパ節転移）のマイナーな課題を提示し、特定の腫瘍タイプのためのプロトコルに若干の調整を加えたものである。例えば、膵臓の腫瘍は高い秒を有する傾向がある悪い癌細胞表現を持つセクションをもたらすことができる腫瘍細胞の比率にtroma。腫瘍の癌細胞の豊富な分野の調達総額の分析に行うことはできません。したがって、腫瘍試料から複数の小さい立方体領域が（4 /アガロース埋め込 みモールド）を埋め込 み、腫瘍細胞が豊富なエキソビボセクションの確率を高める同時に切片化することができ、この潜在的な欠点を克服する。
私たちのデータは、前臨床薬剤開発におけるex vivoの技術（図1）の使用をサポートします。応答（IC 50）と一緒に、オフターゲット上で知らせる、重要な分泌因子（ 例えば 、サイトカイン、エキソソーム）、抵抗とフィードバックのメカニズムと効果薬物暴露は上があり、セクションが代替生存率アッセイ、メタボロミクス、組み合わせ治療戦略について分析することができる複製する効果（ すなわち 、正常および良性細胞）。 Hsp90iを使用されるこの特定の研究では、SPEをターゲットにcificityと「オフターゲット効果」の識別は、キーのみ 悪性形質転換10上に癌細胞で見られる「発癌性のHsp90」の特徴的なプールがあることを前提としている。これは、ex vivoで Hsp90i処理区の良性小葉は不変のままであった結果セクション（挿入図1A）に示されている。同原発腫瘍の別のセクションにある、等しい重要なのは、 図1に反映され、10μMの（治療的に無関係な用量）処理区では、その場 （DCIS） に関連した乳管癌に対し、IDCの巣の完全な応答を示した（データは示していない）不変のままであった。研究のこの行の今後の研究は、この論文の範囲を超えています。しかし、この特定の発見は、発癌に関連して、「悪性形質転換」またはIDC標本の関連するDCISの疾患進行の状態に知らせるHsp90は機能してシャペロンと医薬品開発にex vivoでの技術を使用することの有用性をサポートしています。
エキソビボ技術のさらなる応用は、腫瘍異種移植片モデルにおける前有効性分析に使用する（ すなわち、ex vivoで PDXの切片）薬剤開発における薬物動態/薬力学（PK / PD）に関与実行する前に、高価なデータを決定することであるインビボ研究 -を可能にして通知さ、費用対効果のin vivoでの薬効試験において 。
重要なステップおよび ex vivo技法の潜在的な制限要因は、調達と切片である。腫瘍標本の調達（ すなわち 、原発腫瘍/転移）の生存度が最も高い腫瘍の領域を特定するには細心の注意を迅速に実行する必要があります。大きな腫瘍は肉眼的には見えない、壊死中心領域を有する傾向がある。したがって、組織fを調達ROMの最も外側の縁は、実行可能な試料を得る確率が増加する。所望の厚さで精度のスライスを収集し、切片化に関して（ 例えば 、200μm）を大きく（これは非常に小さなサイズにCNBSを除く）腫瘍密度/堅さによって影響される。例えば、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌とは対照的に、典型的にははるかに密度が高い。密な腫瘍組織は、適切な抵抗を提供する - 永久埋め込み媒体の非存在下で - ブレードに、より密度の低い腫瘍組織にはないのに対し。密度の低い腫瘍の組織型の例としては、浸潤性小葉癌、粘液性癌および胃の腫瘍タイプに限定されるものではない。この潜在的な制限を克服するために、トラブルシューティング、適切なブレード速度と周波数とが必要である。切削プロセス全体を通じて一貫した精密スライスした切片厚、薬剤応答の正確な評価のために重要である。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome Leica VT1000s | Leica | 14047235613 | |
| UltraPure agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 4% and 6% before use |
| Injector blade | Ted Pella | 121-4 | |
| MEM with Penicillin + Streptomycin | Media Core Facilities (MSKCC) | The media is prepared at Memorial Sloan Kettering Cancer Center | |
| Scalpel no. 10 | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| Disposable forceps | Cole-Parmer | 84011182 | |
| Embedding mold | Electron Microscopy Science | 70181 | |
| FBS (heat inactivated) | Gemini | 100106 | |
| 24 well plates | Corning | 3524 | |
| Formalin (10%) | Sigma Diagnostics | SDHT501128 | |
| 16% Formaldehyde solution | Thermo Scientific | 28908 | |
| Embedding microsettes | Simport | M503-2 | |
| Ethanol (70%) | Fisher Scientific | A405P-4 | |
| Waterbath | Fisher Scientific | 15-462-2SQ | |
| Microwave | General Electric | ModelJES2051DNBB | |
| Adhesive (Ethyl Cyanoacrylate) | Sigma-Aldrich | E1505-5G | |
| 10 mm dishes | BD Falcon | 353003 | |
| 15 ml tubes | BD Falcon | 352096 |
References
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