A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).
Myokardieinfarkt stadig den vigtigste dødsårsag i de vestlige lande, på trods af betydelige fremskridt i stenten udviklingsområde i de seneste årtier. For afklaring af de underliggende mekanismer og udvikling af nye terapeutiske strategier, tilgængeligheden af gyldige dyremodeller er obligatoriske. Da vi har brug for nye indsigter i patomekanismer af hjertekarsygdomme under in vivo betingelser for at bekæmpe myokardieinfarkt, gyldigheden af dyremodel er et afgørende aspekt. Imidlertid beskyttelse af dyr er yderst relevante i denne sammenhæng. Derfor etablerer vi en minimalt invasiv og enkel model for myokardieinfarkt i mus, som sikrer en høj reproducerbarhed og overlevelsesraten for dyrene. Således dette modeller opfylder kravene i 3R-princippet (Replacement, raffinement og reduktion) til dyreforsøg og sikre videnskabelige oplysninger til brug for videreudvikling af terapeutiske strategier for cardiovascular sygdomme.
Myokardieinfarkt er en af de hyppigste dødsårsager i de industrialiserede lande. Trods ubestridelige fremskridt af diagnostiske og terapeutiske metoder, kardiovaskulære sygdomme er stadig den vigtigste årsag til dødelighed. I betragtning af den forbedrede levetid og liv risici, der forventes en fortsat stigning i forekomsten af hjerte-kar-sygdomme i fremtiden. Der er derfor et stærkt behov for at etablere og validere nye tilgange til behandling af kardiovaskulær sygdom. Oplysningerne om humane undersøgelser lider sine begrænsninger, disse undersøgelser generelt er utilstrækkelige til at forklare og forstå de mekanismer på molekylært niveau, ikke er i stand til at levere løsninger på disse store sundhedsproblemer.
Desuden er grundforskning blevet begrænset på grund af kompleksiteten og vanskeligheden ved at gengive mekanismerne i kardiovaskulær sygdom i laboratoriet. Derfor, for at øge vores viden om patofysiologien af hjertevaskulære sygdomme, er det vigtigt at validere dyremodeller 1,2. Men for at identificere alle kaskader af molekylære begivenheder, der er involveret i heling efter myokardieinfarkt, analyse på forskellige tidspunkter er nødvendigt, forårsager et stort antal dyr eksperimenter.
Myokardieinfarkt eksperimenter udføres ofte ved anvendelse af dyremodeller. Inducerende myokardieinfarkt hos små dyr 3-11 er det mest egnede og effektive model anvendes til at undersøge cellulære og molekylære begivenheder end store dyremodeller. Desuden ingen andre arter viser tilgængeligheden af transgene eller knockout-stammer såsom mus 12. Disse musemodeller er meget nyttige i andre sygdomme, herunder cardiovaskulære patologier (såsom aterosklerose, i stent restenose) 13,14. Derudover lav graviditet periode og det høje antal af afkom kvalificere musemodeller som mest attraktive system til at studere molekylære mekanismer for myocardial infArction 12.
, Størrelsen af hjertet hos mus forventer alligevel høj præcision for manipulation under mikrokirurgi. Undervisning sådanne kvalificerede og dygtige kirurgi personale er en tidskrævende og arbejdskrævende proces. Derfor har vi her præsentere en detaljeret mikrokirurgi procedure, herunder tips og tricks til at guide samarbejdspartnere selv med gennemsnitlige kvalifikationer, såsom studerende eller teknikere til at udføre den komplekse myokardieinfarkt model i mus.
Indledningsvis er intubation udføres ved hjælp af en kort kanyle uden at bruge tracheotomi. Thorax indsnit er beliggende i det interkostale område, undgå skade af ribber eller / og omgivende væv. Denne sub-trin er yderst relevant for at sikre hurtig genopretning og healing 15. Ligaturen er lavet differentiale for kronisk iskæmi og iskæmi / reperfusion modeller, for en høj overlevelsesprocent samtidig opretholde en betydelig infarkt størrelse. Vores erfaring viser, that hjælp silkesutur sikrer en højere reproducerbarhed sammenlignet med kryo-skader 16.
Som konklusion her beskrevne metode kan anvendes i både kronisk iskæmi og iskæmi / reperfusion modeller i små dyr. De tips og tricks præsenteres i denne procedure er beregnet til at gøre det muligt for personale med selv lave eller gennemsnitlige kvalifikation til at anvende det i små dyremodeller.
Under proceduren, er der nogle kritiske punkter skal bemærkes: Den intubation, åbningen brysthulen og LAD ligatur. Den første kritiske trin er intubation af dyret før experiements. Mange grupper bruger en lodret understøtning for fastsættelse af mus og en lyskilde til at indsætte kanylen direkte ind i luftrøret. Denne metode har usikkerhed om den korrekte indføring af kanylen i luftrøret og er den mest tilbøjelige til at mislykkes af nybegyndere. At give et mindre indsnit, kan styres positionen af kanylen under hele manøvren, hvilket således formindsker defaultraten. Desuden er trakeostomi overgået, dermed reducere komplikationer og reducere den tid af drift.
Den næste kritiske trin er åbningen af brysthulen. Medianen sternotomi repræsenterer en høj risiko manøvre forsinke inddrivelsen af dyrene. Den laterale venstre indsnit indebærer opskæring af 2-3 ribber 15 </sup> fører til mangelfuld genopretning og øget dødelighed. Vi bruges i modellen små, diskrete indsnit mellem ribbenene tilbyder minimal byrde. Dyrene komme sig meget hurtigt efter operationen og ikke tilstedeværende defekter eller forstyrret healing. Den lavere inter-kystnære rum tages som et referencepunkt. I betragtning af dette, korrekt og differentieret adgang til ligaturen sted for kronisk og iskæmi / reperfusion model, ikke giver anledning til alvorlige problemer.
Ligaturen selv repræsenterer det mest kritiske trin. Den venstre nedadgående kranspulsåre er svært at visualiseres, og ofte skal bindes uden visning. Derfor er nogle anatomiske referencepunkter påpeget at hjælpe kirurgen at udføre den korrekte ligering. Til den kroniske infarkt model er ligaturen placeret i midten af den ventrale side af hjertet, mellem øremuslingen og toppunktet, over slutningen af den større forreste vene (figur 2B). Effektiviteten kan controlled ved at visualisere udseendet af grå farve i de berørte områder. Hvis infarktområdet vises anterior og omfatter ikke den posteriore væg, kan en ny sutur placeres til venstre for den første sutur. Det vigtigste roden af LAD er altid synlig under auricle 18, og derfor ikke giver anledning til alvorlige problemer med at afsløre denne del. Imidlertid øremuslingen viser den store risiko for blødning og skal håndteres forsigtigt.
Proceduren er begrænset af tilstedeværelsen af passende udstyr. En ventilator og passende anæstesi system til små dyr er dyre og kræver forbindelser til gas og ventilationssystem af værelset. Endvidere er det nødvendigt i den første uge en nøje overvågning af dyrene efter procedure til påvisning af eventuel klinisk. For at undersøge hjertefunktionen under forsøget, er høj opløsning ultralyd, kompleks Langendorf perfusion-systemet, eller små intraventrikulære kateter målinger kræves, invOlving høje omkostninger og yderligere ekspertise.
I betragtning af den myokardieinfarkt, er der ingen alternative metoder til rådighed til at reproducere kompleksiteten af begivenhederne i vitro. Afhængig interessepunktet, ex vivo perfusion af en isoleret hjerte i Langendorff system giver oplysninger om kontraktilitet, hjertefunktion og myokardie levedygtighed som reaktion på forskellige stimuli eller narkotika. Udelukker dog alle interferenser af blodkomponenter og immunsystemet, og det er ikke indiceret til lange-studier af remodeling og helbredelse efter myokardieinfarkt.
Efter udførelse af myokardie procedure infarkt, kan alle andre funktionelle analyse skal gennemføres, ligesom intraventrikulære trykmålinger, ultralyd (små dyr ultralyd-systemer), eller isoleret hjerte Langendorff-perfusion. Desuden kan alle biologiske og molekylær analyse udføres for at identificere celler, proteiner, mRNA'er microRNA'er, geian eller andre biomarkører, der kan anvendes som terapeutiske mål at udvikle nye behandlingsstrategier for myokardieinfarkt.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Interdisciplinary Centre for Clinical Research IZKF Aachen (junior research group to E.A.L.) within the faculty of Medicine at RWTH Aachen University. We are grateful Dr. Rusu and Ashley Christina Vourakis for critical review of the manuscript and Mrs. Roya Soltan for the professional help with immunohistochemistry staining.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Stereomicroscope | Olympus | SZ/X9 | |
Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 730043 | Model Minient 845 |
Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | Harvard Apparatus | Selfcontained isofluranebased anesthesia unit for use on lab tables, with a compact 8" x 11" footprint. | |
Intubation cannula | Harvard Apparatus | 732737 | |
Forceps | FST, Germany | 9119700 | standard tip curved 0.17 mm x 0.1 mm |
Scissors | FST, Germany | 9146011 | straight |
Vannas scissor | Aesculap, Germany | OC 498 R | |
Retractors | FST, Germany | 1820010 | 2.5mm wide |
Retractors | FST, Germany | 1820011 | 5mm wide |
Wire handles | FST, Germany | 1820005 | 10cm |
Wire handles | FST, Germany | 1820006 | 14cm |
Ketamine 10% | CEVA, Germany | ||
Xylazine 2% | Medistar, Germany | ||
Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | ||
Silicon tube | IFK Isofluor, Germany | custommade product | diameter 500µm |
section thickness 100 µm | |||
polytetrafluorethylene catheter | |||
PROLENE Suture 6/0 | ETHICON | 8707H | polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC1, 13mm, 3/8 Circle |
7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | |
Ultrasound | Vevo, Canada | 770 Vevo |