A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).
El infarto de miocardio sigue siendo la principal causa de muerte en los países occidentales, a pesar de los considerables progresos en el área de desarrollo de stent en las últimas décadas. Para el esclarecimiento de los mecanismos subyacentes y el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, la disponibilidad de modelos animales válidos son obligatorios. Puesto que necesitamos nuevos conocimientos sobre mecanismos patogénicos de las enfermedades cardiovasculares en condiciones in vivo para luchar contra el infarto de miocardio, la validez del modelo animal es un aspecto crucial. Sin embargo, la protección de los animales son de gran relevancia en este contexto. Por lo tanto, establecemos un modelo mínimamente invasivo y sencillo de infarto de miocardio en ratones, lo que asegura una alta reproducibilidad y la tasa de supervivencia de los animales. Por lo tanto, este modelo cumple con las exigencias del principio 3R (reemplazo, refinamiento y reducción) para los experimentos con animales y asegurar la información científica necesaria para su posterior desarrollo de estrategias terapéuticas para cardiovenfermedades ascular.
El infarto de miocardio es una de las principales causas de muerte en los países industrializados. A pesar del progreso innegable de los enfoques diagnósticos y terapéuticos, las enfermedades cardiovasculares siguen siendo la principal causa de mortalidad. Dada la esperanza de vida mejorado y riesgos relacionados con la vida, se espera un aumento continuo de la incidencia de enfermedades cardiovasculares en el futuro. Por lo tanto, existe una fuerte necesidad de establecer y validar nuevos enfoques para el tratamiento de la enfermedad cardiovascular. La información de estudios en humanos sufren de sus limitaciones, estos estudios por lo general no son suficientes para explicar y entender los mecanismos a nivel molecular, siendo incapaz de dar soluciones a estos problemas de salud importantes.
Por otra parte, la investigación básica ha sido limitada debido a la complejidad y dificultad de reproducir los mecanismos de la enfermedad cardiovascular en el laboratorio. Por lo tanto, para aumentar nuestro conocimiento sobre la fisiopatología de cardioenfermedades vasculares, es esencial para validar modelos animales 1,2. Sin embargo, para identificar todas las cascadas de eventos moleculares implicados en la curación después de infarto de miocardio, el análisis en diferentes puntos temporales es necesario, causando un gran número de animales experimentos.
Experimentos con infarto de miocardio con frecuencia se realizan mediante el uso de modelos animales. La inducción de infarto de miocardio en animales pequeños 3-11 es el modelo más adecuado y eficiente empleado para investigar los eventos celulares y moleculares que los modelos animales grandes. Por otra parte, ninguna otra especie presenta la disponibilidad de cepas transgénicas o como ratones knockout 12. Estos modelos de ratón son muy útiles en otras enfermedades, incluyendo patologías cardiovasculares (tales como la aterosclerosis, la restenosis en stent) 13,14. Además, el período de embarazo de bajo y el alto número de progenie califican modelos de ratón como el sistema más atractivo para estudiar los mecanismos moleculares de INFA infartorction 12.
Sin embargo, el tamaño del corazón en ratones espera de alta precisión de la manipulación durante la microcirugía. La enseñanza de este personal de cirugía calificados y capacitados es un tiempo y proceso de trabajo intensivo. Por lo tanto, aquí presentamos un procedimiento de microcirugía detallada, incluyendo consejos y trucos para guiar colaboradores, incluso con calificaciones promedio, como los estudiantes o técnicos para llevar a cabo el complejo modelo de infarto de miocardio en ratones.
Inicialmente, la intubación se realiza por medio de una cánula corta sin utilizar la traqueotomía. La incisión torácica se encuentra en la zona intercostal, evitando la lesión de nervios o / y el tejido circundante. Esta sub-paso es de gran importancia para asegurar una rápida recuperación y la curación 15. La ligadura se hace diferenciado para los modelos de isquemia crónica y la isquemia / reperfusión, por una alta tasa de supervivencia mientras que todavía mantiene un tamaño significativo de miocardio. Nuestra experiencia muestra that usando sutura de seda asegura una reproducibilidad más alta en comparación con crio-lesiones 16.
En conclusión, el método aquí descrito es aplicable tanto en la isquemia crónica y modelos de isquemia / reperfusión en animales pequeños. Los trucos y consejos presentados en este procedimiento están destinadas a permitir que el personal con incluso bajo o promedio de calificación de aplicarlo en modelos animales pequeños.
Durante el procedimiento, hay algunos puntos críticos que se destacaron: la intubación, la apertura de la cavidad torácica y la ligadura LAD. El primer paso fundamental es la intubación del animal antes experiements. Muchos grupos están utilizando un soporte vertical para la fijación del ratón y una fuente de luz para insertar la cánula directamente en la tráquea. Este método tiene la incertidumbre relativa a la correcta inserción de la cánula en la tráquea y es el más propenso al fracaso por los novicios. Realización de una pequeña incisión, la posición de la cánula puede ser controlada durante toda la maniobra, lo que disminuye la tasa predeterminada. Por otra parte, la traqueotomía es superada, disminuyendo así las complicaciones y reducir el tiempo de operación.
El siguiente paso fundamental es la apertura de la cavidad torácica. La esternotomía media representa una maniobra de alto riesgo retrasar la recuperación de los animales. La incisión lateral izquierdo que implica el corte de 2-3 costillas 15 </sup>, conduce a la recuperación deficiente y aumento de la mortalidad. Se utilizó en el modelo de incisión pequeña, discreta entre las costillas que ofrecen carga mínima. Los animales se recuperan muy rápidamente después de la cirugía y no lo hacen defectos presentes o curación perturbado. El espacio inter-costal inferior se toma como punto de referencia. Teniendo en cuenta esto, el acceso adecuado y diferenciado al lugar de ligadura crónica e isquemia / reperfusión modelo, no plantea problemas serios.
La ligadura en sí representa el paso más crítico. La arteria coronaria descendente izquierda es difícil de ser visualizado, y a menudo necesita ser consolidado sin vista. Por lo tanto, algunos puntos de referencia anatómicos se señalan para ayudar al cirujano para realizar la ligadura correcta. Para el modelo de miocardio crónico, la ligadura se coloca en el centro de la parte ventral del corazón, entre la aurícula y el ápice, sobre el final de la vena principal anterior (Figura 2B). La eficiencia se puede controllena mediante la visualización de la aparición del color gris en las zonas afectadas. Si el área infartada aparece anterior y no incluye la pared posterior, una nueva sutura puede ser colocado a la izquierda de la primera sutura. La raíz principal de LAD es siempre visible bajo la aurícula 18, y por lo tanto no presenta serios problemas en la detección de esta parte. Sin embargo, la aurícula presenta el mayor riesgo de sangrado y debe ser manejado con cuidado.
El procedimiento está limitado por la existencia de un equipo apropiado. Un ventilador y sistema de anestesia apropiada para los animales pequeños son caros y requieren conexiones a gas y sistema de ventilación de la habitación. Además, una estrecha supervisión de los animales es necesario en la primera semana después del procedimiento para detectar la posible clínico. Para examinar la función del corazón durante el experimento, se requieren de alta resolución de ultrasonido, complejo sistema de perfusión Langendorf, o pequeñas mediciones catéter intraventricular, involving altos costos y experiencia adicional.
Teniendo en cuenta el infarto de miocardio, no hay métodos alternativos disponibles para reproducir la complejidad de los eventos in vitro. Dependiendo del punto de interés, ex vivo de perfusión de un corazón aislado en el sistema de Langendorff proporciona información sobre la contractilidad, la función del corazón y de la viabilidad miocárdica en respuesta a diferentes estímulos o drogas. Sin embargo, se excluyen todas las interferencias de componentes de la sangre y el sistema inmunológico, y no está indicada para largos estudios de remodelación y la curación después de un infarto de miocardio.
Después de realizar el procedimiento de infarto de miocardio, todos los demás análisis funcional se puede llevar a cabo, como mediciones de la presión intraventricular, ultrasonido (sistemas de ultrasonido pequeño de animales) o corazón aislado de Langendorff-perfusión. Por otra parte, todos los análisis biológica y molecular se puede realizar para identificar las células, proteínas, ARNm, microRNAs, genes u otros biomarcadores, que se pueden utilizar como dianas terapéuticas para desarrollar nuevas estrategias de tratamiento para el infarto de miocardio.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Interdisciplinary Centre for Clinical Research IZKF Aachen (junior research group to E.A.L.) within the faculty of Medicine at RWTH Aachen University. We are grateful Dr. Rusu and Ashley Christina Vourakis for critical review of the manuscript and Mrs. Roya Soltan for the professional help with immunohistochemistry staining.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Stereomicroscope | Olympus | SZ/X9 | |
Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 730043 | Model Minient 845 |
Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | Harvard Apparatus | Selfcontained isofluranebased anesthesia unit for use on lab tables, with a compact 8" x 11" footprint. | |
Intubation cannula | Harvard Apparatus | 732737 | |
Forceps | FST, Germany | 9119700 | standard tip curved 0.17 mm x 0.1 mm |
Scissors | FST, Germany | 9146011 | straight |
Vannas scissor | Aesculap, Germany | OC 498 R | |
Retractors | FST, Germany | 1820010 | 2.5mm wide |
Retractors | FST, Germany | 1820011 | 5mm wide |
Wire handles | FST, Germany | 1820005 | 10cm |
Wire handles | FST, Germany | 1820006 | 14cm |
Ketamine 10% | CEVA, Germany | ||
Xylazine 2% | Medistar, Germany | ||
Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | ||
Silicon tube | IFK Isofluor, Germany | custommade product | diameter 500µm |
section thickness 100 µm | |||
polytetrafluorethylene catheter | |||
PROLENE Suture 6/0 | ETHICON | 8707H | polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC1, 13mm, 3/8 Circle |
7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | |
Ultrasound | Vevo, Canada | 770 Vevo |