Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.
The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation.
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiæ, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.
活细胞内最荧光研究依赖于蛋白质融合荧光蛋白(FPS),如GFP 1。这些荧光标记允许参与诸如基因表达或膜转运2-7过程的蛋白的拷贝数,扩散图案或定位的研究。的FP提供高特异性标记,易于实施,并提供大量库存的各种光物理和化学性质1变种。然而,有机荧光团保持头等选择用于体外实验,由于其更大的光稳定性(高达100倍的FP相比更稳定的)8,9,小尺寸(高达100倍体积小于FPS)和易于分子内标签(主要是通过使用半胱氨酸残基)。所有这些因素都对单分子荧光特别重要和FRET研究10。
几个内部方法COMBIN荷兰国际集团有机标签和体内检测的优点已被引入,在过去的十年;然而,这样的方法或者采用相对较大的多肽的标签( 例如 ,TMP,卤素,或20kDa的SNAP标签)11-14,需要使用的非天然氨基酸15,或限于大的,单膜的真核细胞( 如 ,刮加载,加载注射器,注射),16-19。
这个协议描述了一种新颖的,简单的和高通量的内化方法,夫妻的有机荧光团的优点与体内观察。为了开发这种技术,我们适于通常用于以加载微生物,如大肠杆菌转化细胞与质粒DNA 20,21电穿孔过程大肠杆菌或S.酵母与有机生物分子标记。该协议包括4个简单的步骤:细胞培养与生物分子标记,电穿孔,细胞恢复和细胞洗涤以除去非内化的生物分子。这里,我们提出这个电协议,以及在细胞成像和数据分析过程,以研究细胞系和单分子荧光和FRET信号。
电穿孔依赖于横跨一个低离子强度的细胞悬浮液排出的高电压电场形成瞬态膜孔,通过该生物分子可进入细胞中( 图1)20,21。正如改造的细菌或酵母质粒DNA,细胞具有电穿孔,以确保其electrocompetency事先做好准备。此过程中,由几个洗涤步骤用的水,增加了膜的通透性和降低的细胞溶液的离子强度,以避免产生电弧的电穿孔杯中。在这个协议中,细胞可如下所述制备(参见协议:1.1),或从商业提供商购买秒。
图1:该内化协议的示意图从左至右:加标记的生物分子的几微升至电感受态细胞(双标记的DNA片段和细菌在这个例子中)的等分试样;孵育1至10分钟,在冰上并转移到预冷的电穿孔杯中;电穿孔,然后后立即加入0.5-1毫升丰富的培养基中的细胞;孵育在37℃下(或由生物体所要求的温度,例如 29℃,酵母),让细胞恢复;执行5洗涤步骤,以除去任何过量的未内化的标记的分子;重悬在100-200微升的PBS缓冲液和吸液管将10μl在琼脂糖垫的最终的沉淀;盖上盖玻片清洗和图像上的荧光显微镜的垫(在宽视场模式或HILO模式)。
而DNA的内化是直接( 图2),注意事项需要内在使用电穿孔标记的蛋白质时要采取。首先,有机标记的蛋白质的储备样品仍然可能包含游离的染料的一小部分。游离的染料分子比蛋白质小很多,因此可能被优先内在化。以确保所观察到的内在荧光分子的绝大多数对应于感兴趣的蛋白质,初始蛋白质样品应含有少于〜2%无染料( 图5)22。非内化标记的蛋白质的过量也可以粘到电穿孔后的细胞外膜;这种现象是蛋白特异性和需要被检查为每个新的蛋白质。我们提出了几个选项,允许拆除非内在的蛋白质从细胞装样品(见PROTOCOL:3.3.3)。
最后,将细胞重悬浮于小体积的磷酸盐缓冲液中,吸移到琼脂糖垫,允许在荧光显微镜的成像。固定在琼脂糖垫是SIMPLe和成像细胞在盖玻片不损害其完整性的有效方式。垫应包含一个低荧光培养基。
细胞成像可以进行无论是在广角,全内反射荧光(TIRF)或使用HILO(高度倾斜和层压光学片)显微镜。在希洛构造中,激光束更深地穿入样品比在TIRF,但不照亮整个样本作为宽视场,从而允许更大的信噪比23。根据所使用的激光功率和时间分辨率,内化的生物分子进行计数(使用逐步-漂白分析, 图3),局部的,或跟踪24-28。用FRET对荧光团的双标记的构建物的内化允许FRET两者中的单细胞或单分子的水平( 图6)的定量。
不同的参数可被改变取决于期望的输出,并研究了生物系统。第一,每个细胞的内化材料的量可以通过改变标记的生物分子的加入到细胞之前电穿孔( 图2)的浓度来调节。电场强度也将影响两个装载效率和细胞活力;如预期的,而装载效率增加而增加电场强度,电穿孔的细胞的生存力降低( 图4A)。这两个参数可以通过记录的加载的百分比和电穿孔后分裂的细胞进行定量。这再加上荧光成像的可行性实验也验证了观察内在生物分子在活细胞中,并允许连续观察了好几代( 图4B)。
总之,这个协议允许荧光标记的DNA和蛋白质分子的内化入大肠杆菌或S.酵母 26。标有有机荧光团的单个分子可被跟踪以高时空分辨率的时间尺度一个数量级超过的FP。最后,这种方法是用宽视场,TIRF和共焦检测,以及脉冲激发方案,诸如ALEX(交流激光激发28,29)相兼容。
许多参数可以细胞电穿孔和数据采集取决于感兴趣的生物系统和实验(细胞级或单分子分析)的确切性质上期间被改变。例如,电穿孔DNA导入细菌时,标记的双链DNA片段的0.25至5皮摩尔导致低的内化效率,允许直接单分子检测( 即 ,无需事先漂白)。上述5pmol的双链DNA,细胞往往是重仓,制度更适合于单细胞分析。所有标记的DNA也应该预先凝胶纯化以除去游离的染料的任何痕迹从DNA储备液(未反应的荧光团)。此外,随着DNA降解,特别是用于smFRET实验的潜在问题,可以通过使用的DNA与非天然核酸,或者该核酸外切酶保护可访问的末端如发夹环基序处理。
另一个adjustabl在电穿孔e参数是电穿孔期间所施加的场强。低场强(约1千伏/厘米)将导致相应的单分子研究低负载效率。更高的场强(高达1.8千伏/厘米)将增加装载效率;但是,没有电穿孔后的场强和细胞活力之间的逆相关(参见图4)。作为参考,用于细菌和酵母电穿孔正常磁场强度为〜1.5千伏/厘米。的时间常数,表示此衰减的长度,是一种方便的参数遵循,因为时间常数滴只要任何电弧现象发生在比色皿。在正常设定时,时间常数应大于4毫秒;较低的值会导致低装载效率甚至无负载受损细胞。最electroporators提供其他自由度(如“脉冲截断”或“脉冲状”),它可以既修饰以调小区负载和活力。我们应用此方法,以细菌和酵母,但是类似的程序也应当允许标记的生物分子到哺乳动物细胞的内化使用适当的电穿孔仪的设置,因为它们的膜实际上是较不复杂(单脂双层),并且由于电穿孔已经被用于此类细胞21。
当内化标记的蛋白,所有的自由染料需要从所述标记蛋白原液现有电穿孔除去。游离的染料分子,由于它们的小的尺寸,可以优先内化在感兴趣的蛋白质,并且难以在数据分析期间区分(尽管他们预期更快扩散)。作为指导,对于有机标记的蛋白的样品,以适合于电穿孔,剩余的游离的染料量应低于2%,22(用SDS-PAGE的荧光扫描检测)。这个过程是特别重要的,一些分子可能会坚持到电细菌或酵母的外膜。在这方面,所述阴性对照样品应显示每个细胞的荧光强度比电穿孔的细胞显然较低,最好低至空细胞(细胞尚未孵育任何荧光标记的生物分子,也没有电穿孔的, 图2)的自发荧光水平。
与双链DNA,标记的蛋白质的内化效率是与加入到前电穿孔的细胞的生物分子的量。然而,其他参数,例如大小和电荷,起到内在化的作用。小蛋白表现出高的内化效率,而较大的蛋白质(高达98 kDa的)可以被成功内化,但以较低的效率( 图5)26。所述isolelectric点的蛋白质,与细胞的膜电位的相互作用和其他物理化学参数也电过程中的影响力小区负载。这样一来,用户需要优化的实验为自己的系统,知道标记的蛋白(> 50μM)的高初始浓度将给予成功加载的最好机会。电穿孔还提供了一个新的工具,扰乱,并通过引入蛋白质和其他生物分子进入细胞(无论是标注或未标注)分析细胞功能。 T7 RNA聚合酶的实验( 图5C)本实验,我们可以引入的生物分子,可以在体内使用电改变的基因表达的这样的例子。
当执行单分子荧光实验,TIR照明通常比其他照明模式的青睐,因为它提供了在一个薄截面盖玻片表面(〜100nm)的上述最佳信噪比通过激发仅荧光团。但是成像标记的生物分子扩散里面活的微生物可能再叠纸更深照度(高达0.8微米的大肠杆菌 )。更深照明希洛模式实现的,同时保持高信噪比。另一方面,宽视场成像是特别重要的用于分步漂白分析,在用户通过漂白具有高的激光功率的整个加载细胞和除以初始细胞荧光强度所产生的单一强度估计内化分子的数目由一个单一的分子(单光漂白工序中, 图3)。还需要宽视场成像为长期分子跟踪,以便感兴趣的分子扩散进行本地化,即使它们的轨迹覆盖整个细胞体积。
在这个协议中,我们提出了如何电穿孔,一个标准技术生物学家和生物化学用于递送核酸的细胞中,构成用于输送荧光的生物分子在各种细胞类型的简单方法。日是新颖的,高通量的技术提供了一个独特的工具来观察标记的分子在其天然环境中。在标记有荧光团覆盖一个宽的波长范围内加成的生物分子,电穿孔可以提供分子修饰与许多化学基团,如非天然核苷酸和氨基酸,金属螯合剂,交联剂,和笼蔽基。如果感兴趣的生物系统不是必不可少的细胞发育,对靶蛋白的编码基因也被删除(或击倒),确保内部后观察到的蛋白代表了所有胞内蛋白池(或大多数) 。从本质上说,电穿孔可以“移植” 在体外的生物缀合物的灵活性入活细胞,因此,有利于在努力合成生物学,系统生物学和体内单分子检测。
The authors have nothing to disclose.
We thank Stephan Uphoff for discussions.
R.C. was supported by Linacre College, Oxford University. A.P. was supported by the German Academic Exchange Service (DAAD), the German National Academic Foundation and EPSRC. M.S. was supported by the Wellcome Trust. A.N.K. was supported by a UK BBSRC grant (BB/H01795X/1), and a European Research Council Starter grant (261227).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
ElectroMax DH5-alpha Comptent cells | Invitrogen | 11319-019 | or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast. |
EZ Rich Defined Madia | Teknova | M2105 | low fluorescence rich media |
MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | or any classical electroporator for microorganism transformation |
Certified Molecular Biology agarose | Biorad | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
Microscope coverslips No 1.5 thickness | Menzel | BB024060SC | remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h |
Single-molecule fluorescence microscope | Home-built | described in REFs | |
Localization software | Custom-written, available online | MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. | |
Tracking software | Available online | MATLAB implementation by Blair and Dufresne. |