Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.
The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation.
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiæ, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.
De fleste studier fluorescens i levende celler er avhengig av proteinfusjoner med fluorescerende proteiner (FPS), slik som en GFP. Disse fluorescerende merkene lar studier av kopinummer, diffusjon mønster eller lokalisering av proteiner involvert i prosessene som genekspresjon eller membrantransport 2-7. FPS tilbyr høy merking spesifisitet, enkel implementering, og er tilgjengelig i en stor beholdning av varianter med ulike photophysical og kjemiske egenskaper en. Men organiske fluoroforene forbli den førsteklasses valg for in vitro eksperimenter på grunn av deres større fotostabilitet (opptil 100 ganger mer stabil enn FPS) 8,9, liten størrelse (opp til 100 ganger mindre volum enn FPS) og enkel intra merking (i hovedsak ved bruk av cysteinrester). Alle disse faktorene er spesielt viktig for single-molekyl fluorescens og FRET studerer 10.
Flere internalisering metoder Combining fordelene ved økologisk merking og in vivo deteksjon har blitt innført i løpet av det siste tiåret; Men slike fremgangsmåter enten anvende relativt store polypeptider koder (f.eks TMP, halogen, eller 20 kDa SNAP tags) 11-14, krever bruk av unaturlige aminosyrer 15 eller er begrenset til store enkeltmembran eukaryote celler (f.eks. , skrape lasting, sprøyte lasting, mikroinjeksjon) 16-19.
Denne protokollen beskriver en roman, enkel og høy gjennomstrømming intern metode som par fordelene ved økologisk fluoroforene med in vivo observasjon. For å utvikle denne teknikk, har vi tilpasset electroporation prosedyre som vanligvis anvendes for å transformere celler med plasmid-DNA 20,21 for å laste mikroorganismer, slik som E. coli eller S. cerevisiae med økologisk merkede biomolekyler. Protokollen består av fire enkle trinn: inkubasjon av celler med merkede biomolekyler,elektroporering, celle utvinning, og celle vasking for å fjerne ikke-internalisert biomolekyler. Her presenterer vi denne elektroporering protokollen, samt celle bildebehandling og dataanalyse prosesser for å studere cellebasert og single-molekyl fluorescens og gnage signaler.
Elektroporering er avhengig avfyre et høyspent elektrisk felt over en lav ionestyrke cellesuspensjonen for å danne forbigående membranporene gjennom hvilke biomolekyler kan skrive-celler (figur 1) 20,21. Akkurat som med transformasjon av bakterier eller gjær med plasmid-DNA, celler har til å bli fremstilt før elektroporering for å sikre deres electrocompetency. Denne prosedyren, som består av flere vasketrinn med vann, øker membranens permeabilitet og senker ionestyrken av cellen løsning for å unngå lysbuedannelse i electroporation kyvette. I denne protokollen, kan cellene fremstilles som beskrevet nedenfor (Se PROTOKOLL: 1.1) eller kjøpt fra kommersiell leverandørs.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av internalise protokollen Fra venstre til høyre:. Legge noen mikroliter av merket biomolekyler til aliquot av elektrokompetente celler (dobbelt-merkede DNA-fragmenter og bakterier i dette eksempel); inkuber 1 til 10 minutter på is og overføre til en pre-kjølt elektroporering cuvette; electroporate og deretter legge 0,5-1 ml rik medium til cellene umiddelbart etter; Inkuber ved 37 ° C (eller den temperatur som kreves av organismen, f.eks, 29 ° C for gjær) for å la cellene komme; utføre fem vasketrinn for å fjerne overflødig ikke-internalis merket molekyler; resuspender endelige pellet i 100-200 mL PBS buffer og pipette 10 pl på en agarose pad; dekke puten med en renset dekkglass og bilde på en fluorescens mikroskop (i bredt felt modus eller HILO modus).
Mens DNA intern er grei (figur 2), forholdsregler må tas når internalisert merkede proteiner ved hjelp elektroporering. For det første kan det hende at lager prøve av organisk merket protein fortsatt inneholde en liten prosentandel av fritt farvestoff. Gratis fargestoffer er mye mindre enn proteiner og kan derfor bli internalisert fortrinnsvis. For å sikre at de aller fleste av de observerte internalisert fluorescerende molekyler som svarer til proteinet av interesse, bør den innledende protein prøven inneholde mindre enn ~ 2% fri fargestoff (figur 5) 22. Overskuddet av ikke-internalisert merkede proteiner kan også holde seg til den ytre cellemembran etter elektroporering; Dette fenomenet er protein-spesifikke og må kontrolleres for hvert nytt protein. Vi foreslår flere alternativer som gjør at fjerning av ikke-internalisert proteiner fra det belastede celleprøve (Se PROTOKOLL: 3.3.3).
Til slutt blir cellene resuspendert i et lite volum av fosfatbuffer og pipettert på en agarose puten, slik at deres avbildning på et fluorescensmikroskop. Immobilisering på agarose pads er en simple og effektiv måte for å avbilde celler på et dekkglass uten å skade deres integritet. Puten bør inneholde en lav-fluorescens kulturmedium.
Celle bildebehandling kan utføres enten i widefield, total intern refleksjon fluorescens (TIRF) eller ved hjelp av HILO (Highly Skrå og Laminert Optisk Sheet) mikroskopi. I HILO konfigurasjon, penetrerer laserstrålen dypere inn i prøven enn i TIRF, men ikke lyser hele prøven som for Widefield, slik at en høyere signal-til-støy-forholdet 23. Avhengig av lasereffekten og tidsoppløsning som brukes, kan internalisert biomolekyler telles (ved hjelp av trinnvis-fotobleking analyse, figur 3), lokalisert eller sporet 24-28. Internalisering av dobbelt merket med et konstrukter FRET par av fluoroforer tillater kvantifisering av FRET både enkelt-celle eller enkelt-molekyl nivåer (figur 6).
Forskjellige parametere kan varieresavhengig av den ønskede effekt, og det biologiske system studeres. For det første kan mengden av internalisert materiale per celle bli innstilt ved å endre konsentrasjonen av merket biomolekyler tilsatt til cellene før elektroporering (figur 2). Elektroporering feltstyrke vil også påvirke begge laste effektivitet og cellenes levedyktighet; som forventet, mens laste effektiviteten øker med økende feltstyrke, levedyktigheten av elektroporerte celler avtar (figur 4A). Begge parametere kan kvantifiseres ved å måle prosentandelen av lastet og delende celler etter elektroporering. Dette levedyktighet analysen kombinert med fluorescens bildebehandling bekrefter også observasjon av internalisert biomolekyler i levende celler og tillate kontinuerlig observasjon over flere generasjoner (Figur 4B).
Oppsummert gir dette protokollen internalisering av fluoresceinmerket DNA og protein molekyler innE. coli eller S. cerevisiae 26. Individuelle molekyler merket med organiske fluoroforene kan spores med høy tid og rom oppløsning for tidsskalaer en størrelsesorden lenger enn FPS. Endelig, denne fremgangsmåten er kompatibel med Widefield, TIRF og konfokal deteksjon, samt pulsede eksitasjon ordninger, slik som ALEX (alternerende laser magnetisering 28,29).
Mange parametere kan varieres i løpet av celle elektroporering og datainnsamling, avhengig av det biologiske system av interesse og den nøyaktige natur av eksperimentet (celle-nivå eller enkelt-molekyl-analyse). For eksempel, når electroporating DNA inn i bakterier, 0,25 til 5 pmol av merket dsDNA-fragmenter fører til en lav virkningsgrad internalisering, som tillater direkte påvisning enkelt-molekylet (det vil si., Uten behov for fotobleking på forhånd). Over 5 pmol dsDNA, celler har en tendens til å være tungt lastet, et regime bedre egnet for encellede analyse. Alle merkede DNA bør også være tidligere gelrenset for å fjerne ethvert spor av frie fargestoff (ikke-omsatt fluorofor) fra DNA-stamløsning. Dessuten potensielle problemer med DNA degradering, spesielt for smFRET eksperimenter, kan løses ved hjelp av DNA med unaturlige nukleinsyrer, eller motiver som beskytter exonuclease tilgjengelige termini som hårnål sløyfer.
En annen juste parameter i elektroporering er feltstyrken påføres under elektroporering. Lav feltstyrke (~ 1 kV / cm), vil føre til en lav lasteeffektivitet egnet for enkelt-molekyl studier. Høyere feltstyrker (opp til 1,8 kV / cm) vil øke lasteeffektivitet; men det er en invers korrelasjon mellom feltstyrke og celleviabilitet etter elektroporering (se figur 4). For referanse, en vanlig feltstyrke som brukes for bakterier og gjær elektroporering er ~ 1,5 kV / cm. Tidskonstanten, som representerer lengden av denne råte, er en enkel parameter til følge, fordi tidskonstanten dråper så snart noen lysbuedannelse fenomen forekommer i kyvetten. Under normale innstillinger, bør tidskonstanten være større enn 4 ms; lavere verdier vil føre til lav lasteeffektivitet eller ikke-lastet skadede celler. De fleste electroporators tilby andre frihetsgrader (for eksempel "puls avkutting" eller "puls form") som kan endres for å tune bådecelle lasting og levedyktighet. Vi har anvendt denne metode for både bakterier og gjær, men lignende prosedyrer bør også tillate internalisering av merkede biomolekyler inn i pattedyrceller ved hjelp av egnede electroporator innstillinger siden deres membran er faktisk mindre kompleks (enkelt lipidbilag) og siden elektroporering har allerede blitt anvendt med slike celler 21.
Når internalisert merkede proteiner, må alle frie fargestoff å bli fjernet fra de merkede proteinstamløsning før elektroporering. Frie fargestoffmolekyler på grunn av deres mindre størrelse, kan internaliseres fortrinnsvis i løpet av proteiner av interesse, og er vanskelige å skille ved dataanalyse (til tross for deres forventede raskere diffusjon). Som en rettesnor, for et utvalg av organisk merkede protein for å være egnet for elektroporering, bør mengden av gjenværende fritt fargestoff være under 2% (påvist ved anvendelse av fluorescerende skanning av en SDS-PAGE) 22. Denne fremgangsmåte er spesielt viktig,som noen molekyler kan holde seg til de ytre membraner av elektroporerte bakterier eller gjær. I denne forbindelse bør det negative kontrollprøven viser fluorescens-intensitet per celle klart lavere enn elektroporerte celler, ideelt så lavt som autofluorescens nivået av tomme celler (celler som ikke er inkubert med eventuelle fluorescensmerkede biomolekyler eller elektroporerte, figur 2).
Som med dsDNA er internalise effektiviteten av merkede proteiner bundet til mengden av biomolekyler tilsatt til cellene før elektroporering. Men andre parametre, som størrelse og kostnad, spille en rolle i internalisering. Små proteiner oppviser høy effektivitet internalisering, mens større proteiner (opp til 98 kDa) med hell kan internaliseres, men med lavere effektivitet (figur 5) 26. Den isolelectric punktet av proteinet, potensielle interaksjoner med cellemembranen og andre fysiske og kjemiske parametere ogsåinnflytelse celle lasting under elektroporering. Som et resultat, brukerne trenger å optimalisere eksperimenter for sitt eget system, vel vitende om at en høy initiell konsentrasjon av merket protein (> 50 mm) vil gi den beste muligheten for vellykket lasting. Electroporation tilbyr også et nytt verktøy for å forurolige og analysere cellefunksjon ved å innføre proteiner og andre biomolekyler i celler (enten merket eller umerket). T7-RNA-polymerase eksperimenter (figur 5C) er tilstede, for eksempel av et eksempel på et eksperiment hvor vi kan innføre et biomolekyl som kan endre genekspresjon in vivo ved hjelp av elektroporering.
Ved utføring av enkeltmolekyl fluorescens eksperimenter, er TIR belysning vanligvis foretrekkes fremfor andre belysnings modi som det gir det beste signal-til-støy-forholdet ved bare å eksitere fluoroforer i en tynn seksjon over dekkflaten (~ 100 nm). Men bilde merket biomolekyler diffunderer inne levende mikroorganismer kan reKor dypere belysning (opptil 0,8 mikrometer for E. coli). Dypere belysning oppnås i HILO modus, og samtidig bevare et høyt signal-til-støy-forholdet. På den annen side er bredt felt avbildning spesielt viktig for trinnvis fotobleking analyse, hvor brukeren estimere antall internalisert molekyler ved fotobleking et helt lastet celle med høy lasereffekt og å dividere den første celle fluorescensintensitet ved den enhetlige intensiteten produsert av et enkelt molekyl (enkel fotobleking trinn, figur 3). Widefield avbildning er også nødvendig for langtids molekyl sporing for å lokalisere de diffunderer molekyler av interesse, selv om deres baner dekke hele cellevolumet.
I denne protokollen, presenterer vi hvordan elektroporering en standard teknikk for biologer og biochemists for avgivelse av nukleinsyrer i celler, utgjør en enkel metode for å levere fluorescerende biomolekyler i ulike celletyper. Ther romanen, og tilbyr høy gjennomstrømming teknikk et unikt verktøy for å observere merkede molekyler i sitt opprinnelige miljø. I tillegg biomolekyler merket med fluoroforer som dekker et bredt område av bølgelengder, elektroporering kan levere molekyler modifisert med mange kjemiske grupper, for eksempel unaturlige nukleotider og aminosyrer, metallchelatorer, tverrbindingsmidler, og caging grupper. Hvis det biologiske system av interesse er ikke vesentlig for celleutvikling, kan genet som koder for mål-protein også bli slettet (eller slått ned), slik at proteinene observert etter internalise representerer alle (eller de) av det intracellulære protein bassenget . I hovedsak kan elektroporering "transplantasjon" fleksibiliteten til in vitro bioconjugates i levende celler og derfor nytte innsats i syntetisk biologi, systembiologi, og in vivo single-molekyl deteksjon.
The authors have nothing to disclose.
We thank Stephan Uphoff for discussions.
R.C. was supported by Linacre College, Oxford University. A.P. was supported by the German Academic Exchange Service (DAAD), the German National Academic Foundation and EPSRC. M.S. was supported by the Wellcome Trust. A.N.K. was supported by a UK BBSRC grant (BB/H01795X/1), and a European Research Council Starter grant (261227).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
ElectroMax DH5-alpha Comptent cells | Invitrogen | 11319-019 | or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast. |
EZ Rich Defined Madia | Teknova | M2105 | low fluorescence rich media |
MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | or any classical electroporator for microorganism transformation |
Certified Molecular Biology agarose | Biorad | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
Microscope coverslips No 1.5 thickness | Menzel | BB024060SC | remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h |
Single-molecule fluorescence microscope | Home-built | described in REFs | |
Localization software | Custom-written, available online | MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. | |
Tracking software | Available online | MATLAB implementation by Blair and Dufresne. |