Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.
The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation.
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiæ, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.
تعتمد معظم الدراسات مضان داخل الخلايا الحية على اندماج بروتين مع البروتينات الفلورية (FPS)، مثل GFP 1. هذه العلامات الفلورية تسمح دراسات في عدد النسخ، ونمط نشر أو توطين البروتينات المشاركة في عمليات مثل التعبير الجيني أو النقل غشاء 2-7. ضباط الإتصال توفر عالية خصوصية وضع العلامات، وسهل التنفيذ، وتتوفر في مخزون كبير من المتغيرات مع مختلف photophysical والخصائص الكيميائية 1. ومع ذلك، لا تزال fluorophores العضوية في اختيار رئيس للفي التجارب المختبرية نتيجة لزيادة صمود الخاصة بهم (تصل إلى 100 أضعاف أكثر استقرارا من FPS) 8،9، وصغر حجمها (تصل إلى 100 أضعاف حجم أصغر من FPS) وسهولة وضع العلامات ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئ (بشكل رئيسي من خلال استخدام بقايا السيستين). كل هذه العوامل أهمية خاصة لجزيء واحد مضان والحنق يدرس 10.
عدة طرق استيعاب تنافسيةجي مزايا العضوية ووضع العلامات في الكشف فيفو أدخلت على مدى العقد الماضي. ومع ذلك، فإن مثل هذه الأساليب إما توظف البروتينية علامات كبيرة نسبيا (العلامات على سبيل المثال، TMP، HALO، أو 20 كيلو دالتون SNAP) 11-14، تتطلب استخدام الأحماض الأمينية غير طبيعية 15، أو تقتصر على الخلايا حقيقية النواة كبيرة، واحدة غشاء (على سبيل المثال. ، كشط التحميل، حقنة التحميل، حقن مكروي) 16-19.
يصف هذا البروتوكول رواية، واضحة وعالية الإنتاجية طريقة استيعاب أن الأزواج مزايا العضوية fluorophores مع الملاحظة في الجسم الحي. لتطوير هذه التقنية، فإننا تكييفها الإجراء Electroporation لليشيع استخدامها لتحويل الخلايا مع البلازميدات DNA 20،21 من أجل تحميل الكائنات الحية الدقيقة، مثل E. كولاي أو S. الخباز مع الجزيئات الحيوية وصفت عضويا. يتكون البروتوكول من 4 خطوات بسيطة: حضانة الخلايا مع الجزيئات الحيوية المسمى،Electroporation لل، والانتعاش الخلية، وغسل الخلايا لإزالة الجزيئات الحيوية غير المنضوية. هنا، نقدم هذا البروتوكول Electroporation لل، فضلا عن عمليات التصوير الخلية وتحليل البيانات لدراسة مضان القائم على خلية واحدة جزيء والحنق الإشارات.
يعتمد على Electroporation للتفريغ حقل كهربائي عالي الجهد عبر انخفاض الأيونية تعليق خلية قوة لتشكيل غشاء المسام عابرة من خلالها يمكن الجزيئات الحيوية دخول الخلايا (الشكل 1) 20،21. كما هو الحال مع التحول من البكتيريا أو الخميرة مع DNA البلازميد، والخلايا يجب أن تكون مستعدة قبل Electroporation لللضمان electrocompetency بهم. هذا الإجراء، تتكون من عدة خطوات غسل بالماء، ويزيد من نفاذية الغشاء ويقلل من القوة الأيونية من الحل خلية لتجنب الانحناء في كفيت Electroporation لل. في هذا البروتوكول، وخلايا يمكن أن تكون على استعداد كما هو موضح أدناه (انظر بروتوكول: 1.1) أو تم شراؤها من مزود التجاري الصورة.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للبروتوكول استيعاب من اليسار إلى اليمين: إضافة بضع ميكرولتر من الجزيئات الحيوية المسمى إلى قسامة من الخلايا electrocompetent (شظايا الحمض النووي المسمى مضاعف والبكتيريا في هذا المثال)؛ احتضان 1 إلى 10 دقيقة على الجليد ونقل إلى كفيت electroporation قبل المبردة. electroporate ثم قم بإضافة 0.5-1 المتوسطة الغنية مل إلى الخلايا بعد فورا؛ احتضان عند 37 ° C (أو على درجة الحرارة المطلوبة من قبل كائن، على سبيل المثال، 29 درجة مئوية لمدة الخميرة) للسماح للخلايا التعافي. أداء 5 غسل خطوات لإزالة أي المنضوية غير جزيئات الزائدة المسمى. resuspend الكرية النهائي في 100-200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العازلة وماصة 10 ميكرولتر على لوحة الاغاروز. تغطية لوحة مع ساترة تنظيفها والصورة على المجهر مضان (في وضع حقل واسع أو وضع HILO).
في حين استيعاب DNA واضح ومباشر (الشكل 2)، تحتاج الاحتياطات الواجب اتخاذها عند استيعاب البروتينات المسماة باستخدام Electroporation لل. أولا، قد لا تزال تحتوي على عينة الأسهم من البروتين المسمى عضويا نسبة مئوية صغيرة من الصبغة مجانا. جزيئات الصبغة الحرة هي أصغر بكثير من البروتينات، وبالتالي قد يكون داخليا تفضيلي. للتأكد من أن الغالبية العظمى من احظ جزيئات الفلورسنت المنضوية تتوافق مع البروتين من الفائدة، وينبغي أن تتضمن العينة البروتين الأولية أقل من ~ 2٪ صبغ الحرة (الشكل 5) 22. فائض غير المنضوية-البروتينات وصفت ويمكن أيضا عصا لغشاء الخلية الخارجي بعد Electroporation لل. هذه الظاهرة هو البروتين محددة وتحتاج إلى أن يتم التحقق لكل بروتين جديد. نقترح العديد من الخيارات التي تسمح بإزالة البروتينات غير المنضوية من عينة الخلايا المحملة (انظر بروتوكول: 3.3.3).
وأخيرا، ومعلق الخلايا في حجم صغير من العازلة الفوسفات وpipetted على لوحة agarose، والسماح التصوير على المجهر مضان. تجميد على منصات الاغاروز هو simplالبريد وسيلة فعالة لتصوير الخلايا على ساترة دون الإضرار سلامتها. وينبغي أن تتضمن لوحة ثقافة المتوسط المنخفض مضان.
التصوير الخلية لا يمكن أن يؤديها إما في widefield، ومجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) أو باستخدام HILO (شديدة الميل ورقة مغلفة البصرية) المجهري. في تكوين HILO، شعاع الليزر تخترق أعمق في عينة مما كان عليه في TIRF، ولكن لا إلقاء الضوء على عينة برمتها لwidefield، والسماح لأكبر نسبة الإشارة إلى الضوضاء 23. اعتمادا على القرار قوة الليزر والوقت المستخدم، الجزيئات الحيوية المنضوية يمكن الاعتماد (باستخدام تحليل photobleaching من تدريجي، الشكل 3)، المترجمة، أو 24-28 تتبعها. تدخيل يبني المسمى مضاعف مع زوج الحنق من fluorophores يسمح الكمي من الحنق على حد سواء في خلية واحدة أو مستويات جزيء واحد (الشكل 6).
يمكن أن تختلف معايير مختلفةاعتمادا على النتيجة المرجوة والنظام البيولوجي دراستها. أولا، كمية المواد المنضوية في كل خلية يمكن ضبطها عن طريق تغيير تركيز الجزيئات الحيوية وصفت تضاف إلى الخلايا Electroporation للالسابقة (الشكل 2). سوف قوة المجال Electroporation للتؤثر أيضا على حد سواء كفاءة التحميل وبقاء الخلية. كما هو متوقع، في حين أن زيادة كفاءة التحميل مع زيادة قوة المجال، وبقاء خلايا electroporated النقصان (الشكل 4A). يمكن قياسها كميا كل من المعلمات عن طريق تسجيل نسبة تحميلها وتقسيم الخلايا بعد Electroporation لل. هذا الاختبار بقاء إلى جانب التصوير مضان أيضا يتحقق مراقبة الجزيئات الحيوية المنضوية في الخلايا الحية، والسماح المراقبة المستمرة على مدى عدة أجيال (الشكل 4B).
باختصار، هذا البروتوكول يسمح تدخيل fluorescently المسمى DNA والبروتين جزيئات فيكولاي أو S. الخباز 26. يمكن تتبع الجزيئات الفردية المسمى مع fluorophores العضوية لقرار الزمانية المكانية عالية لفترات زمنية أمر من حجم أطول من الثانية. وأخيرا، وهذا الأسلوب هو متوافق مع widefield، TIRF والكشف متحد البؤر، فضلا عن برامج الإثارة نابض، مثل ALEX (بالتناوب الليزر الإثارة 28،29).
يمكن أن تختلف العديد من المعلمات أثناء Electroporation للخلية والحصول على البيانات اعتمادا على النظام البيولوجي للاهتمام والطبيعة الدقيقة للتجربة (على مستوى الخلية أو تحليل جزيء واحد). على سبيل المثال، عندما electroporating الحمض النووي في البكتيريا، ،25-5 بمول من شظايا dsDNA المسمى يؤدي إلى كفاءة استيعاب منخفضة، مما يسمح المباشر الكشف عن جزيء واحد (أي.، من دون الحاجة ل photobleaching مسبقا). فوق 5 بمول dsDNA، وخلايا تميل الى ان تكون محملة بالسلاح، وهو نظام أكثر ملاءمة للتحليل وحيدة الخلية. وينبغي أيضا أن تكون جميع السلطات الوطنية المعينة وصفت سابقا من أجل إزالة أي أثر للصبغة خالية من تنقية جل (fluorophore غير رد فعل) من محلول المخزون DNA. الى جانب ذلك، المشاكل المحتملة مع تدهور الحمض النووي، وخاصة للتجارب smFRET، يمكن معالجتها باستخدام السلطات الوطنية المعينة مع الأحماض النووية غير طبيعية، أو الزخارف التي تحمي-نوكلياز خارجية يمكن الوصول إليها مصطلحات مثل الحلقات القاسي.
adjustabl آخرالمعلمة الإلكترونية في Electroporation للهي قوة المجال تطبيقها خلال Electroporation لل. انخفاض قوة المجال (~ 1 كيلو فولت / سم) سوف يؤدي إلى انخفاض كفاءة تحميل المناسبة للدراسات جزيء واحد. سوف شدة المجال أعلى (تصل إلى 1.8 كيلو فولت / سم) زيادة كفاءة تحميل. ومع ذلك، هناك علاقة عكسية بين قوة المجال وبقاء الخلية بعد Electroporation لل(انظر الشكل 4). للإشارة، قوة الحقل العادية المستخدمة للبكتيريا والخميرة Electroporation للهي ~ 1.5 كيلو فولت / سم. ثابت الوقت، وهو ما يمثل طول هذا الاضمحلال، معلمة مريحة لمتابعة، ومنذ ذلك الوقت قطرات مستمرة في أقرب وقت يحدث أي ظاهرة الانحناء في كفيت. ضمن إعدادات العادية، يجب أن تكون ثابتة الوقت أكبر من 4 مللي ثانية. وانخفاض القيم يؤدي إلى انخفاض كفاءة التحميل أو الخلايا التالفة حتى غير المحملة. العرض الأكثر electroporators درجة أخرى من الحرية (مثل "اقتطاع النبض" أو "نبض شكل") التي يمكن تعديلها لضبط كلاتحميل الخلايا وقدرتها على البقاء. طبقنا هذه الطريقة على كل من البكتيريا والخميرة، ولكن يجب أن إجراءات مماثلة تسمح أيضا تدخيل الجزيئات الحيوية وصفت في خلايا الثدييات باستخدام إعدادات electroporator المناسبة منذ الغشاء هو في الواقع أقل تعقيدا (طبقة ثنائية الدهن واحدة) ومنذ Electroporation للتم بالفعل استخدام مع مثل هذه الخلايا 21.
عندما استيعاب البروتينات المسمى، يحتاج الى كل صبغة مجانا ليتم إزالتها من Electroporation للسابق وصفت حل الأسهم البروتين. جزيئات الصبغة الحرة، نظرا لحجم أصغر، ويمكن المنضوية تفضيلي على البروتينات من الفائدة، ويصعب التمييز خلال تحليل البيانات (على الرغم من المتوقع أسرع نشرها). كدليل، لعينة من البروتين المسمى عضويا تكون مناسبة ل electroporation، وينبغي أن تكون كمية المتبقية صبغ الحرة أقل من 2٪ (الكشف عنها باستخدام المسح الضوئي فلوري من SDS-PAGE) 22. هذه العملية أهمية خاصة،حيث أن بعض الجزيئات قد التمسك الأغشية الخارجية للبكتيريا electroporated أو الخميرة. وفي هذا الصدد، ينبغي أن عينة السيطرة السلبية عرض كثافة مضان لكل خلية أقل وضوحا من خلايا electroporated، من الناحية المثالية منخفضة تصل إلى مستوى تألق ذاتي للخلايا فارغة (الخلايا التي لم المحتضنة مع أي الجزيئات الحيوية fluorescently المسمى ولا electroporated، الشكل 2).
كما هو الحال مع dsDNA، ترتبط كفاءة استيعاب البروتينات وصفت لكمية الجزيئات الحيوية تضاف إلى الخلايا قبل Electroporation لل. ومع ذلك، غيرها من المعالم، مثل الحجم وتهمة، تلعب دورا في استيعاب. بروتينات صغيرة يحمل الكفاءة استيعاب عالية، في حين أن البروتينات أكبر (تصل إلى 98 كيلو دالتون) يمكن المنضوية بنجاح ولكن مع انخفاض كفاءة (الشكل 5) 26. نقطة isolelectric من البروتين، والتفاعلات المحتملة مع غشاء الخلية وغيرها من المعلمات الفيزيائية أيضاتأثير تحميل خلية أثناء Electroporation لل. ونتيجة لذلك، يحتاج المستخدمون لتحسين تجارب لنظامهم الخاص، مع العلم أن تركيز أولي عالية من البروتين المسمى (> 50 ميكرومتر) سوف يعطي أفضل فرصة لتحميل ناجحة. كما يقدم Electroporation للأداة جديدة لالتشويش وتحليل وظيفة الخلوية عن طريق إدخال البروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى إلى خلايا (إما المسمى أو غير المسماة). التجارب T7 RNA البلمرة (الشكل 5C) الحالية مثل هذا المثال على تجربة حيث يمكننا إدخال جزيء حيوي التي يمكن أن تغير التعبير الجيني في الجسم الحي باستخدام Electroporation لل.
عند إجراء التجارب مضان جزيء واحد، وعادة ما فضلت TIR إنارة فوق وسائط الإضاءة الأخرى، حيث أنها توفر أفضل نسبة الإشارة إلى الضوضاء التي كتبها fluorophores الوحيدة المثيرة داخل قسم رقيقة فوق سطح ساترة (~ 100 نانومتر). ومع ذلك التصوير المسمى الجزيئات الحيوية نشرها داخل الكائنات الحية الدقيقة التي تعيش قد تعيدكراس الإضاءة أعمق (ما يصل إلى 0.8 ميكرون لكولاي). ويتحقق الإضاءة أعمق في وضع HILO، مع الحفاظ على نسبة عالية إشارة إلى الضوضاء. من ناحية أخرى، والتصوير حقل واسع مهم بشكل خاص لتحليل photobleaching من خطوة حكيمة، حيث كان المستخدم تقدير عدد جزيئات المنضوية بواسطة photobleaching من خلية محملة بالكامل مع قوة الليزر عالية وتقسيم كثافة مضان الخلايا الأولية من شدة وحدوية المنتجة من جزيء واحد (الخطوة photobleaching من واحدة، الشكل 3). مطلوب Widefield التصوير أيضا لتتبع جزيء طويل الأجل من أجل توطين الجزيئات نشرها من الاهتمام حتى لو تغطي مساراتها حجم الخلية بأكمله.
في هذا البروتوكول، نقدم كيف Electroporation لل، وهي تقنية قياسية لعلماء الأحياء والكيمياء الحيوية لتقديم الأحماض النووية في خلايا، يشكل طريقة بسيطة لتقديم الجزيئات الحيوية الفلورسنت في مختلف أنواع الخلايا. عشرهو الرواية، وتقنية عالية الإنتاجية وتوفر أداة فريدة من نوعها لمراقبة الجزيئات المسمى في بيئتها الأصلية. في الجزيئات الحيوية بالإضافة المسمى مع fluorophores التي تغطي مجموعة واسعة من الأطوال الموجية، Electroporation للجزيئات يمكن أن يحقق المعدلة مع العديد من المجموعات الكيميائية، مثل النيوكليوتيدات غير طبيعية والأحماض الأمينية، وchelators المعدنية، crosslinkers، والجماعات تتم محاصرة. إذا كان النظام البيولوجي للاهتمام ليست ضرورية في تطوير الخلايا، وترميز الجين للبروتين الهدف يمكن أيضا أن يتم حذف (أو طرقت إلى أسفل)، وضمان أن البروتينات وحظ بعد استيعاب وتمثل جميع (أو أكثر) من تجمع البروتين داخل الخلايا . في جوهرها، Electroporation للأن "زراعة" مرونة في المختبر bioconjugates في الخلايا الحية وبالتالي تستفيد الجهود في مجال البيولوجيا الاصطناعية، وبيولوجيا الأنظمة، والحية الكشف عن جزيء واحد.
The authors have nothing to disclose.
We thank Stephan Uphoff for discussions.
R.C. was supported by Linacre College, Oxford University. A.P. was supported by the German Academic Exchange Service (DAAD), the German National Academic Foundation and EPSRC. M.S. was supported by the Wellcome Trust. A.N.K. was supported by a UK BBSRC grant (BB/H01795X/1), and a European Research Council Starter grant (261227).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
ElectroMax DH5-alpha Comptent cells | Invitrogen | 11319-019 | or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast. |
EZ Rich Defined Madia | Teknova | M2105 | low fluorescence rich media |
MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | or any classical electroporator for microorganism transformation |
Certified Molecular Biology agarose | Biorad | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
Microscope coverslips No 1.5 thickness | Menzel | BB024060SC | remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h |
Single-molecule fluorescence microscope | Home-built | described in REFs | |
Localization software | Custom-written, available online | MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. | |
Tracking software | Available online | MATLAB implementation by Blair and Dufresne. |