Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.
The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation.
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiæ, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.
De meeste studies fluorescentie binnen levende cellen afhankelijk proteïne fusies met fluorescente proteïnen (FP), zoals GFP 1. Deze fluorescerende labels laten onderzoeken van het aantal kopieën, diffusie patroon of lokalisatie van eiwitten die betrokken zijn bij processen zoals genexpressie of membraan transport 2-7. KP's bieden een hoge etikettering specificiteit, eenvoudige implementatie, en zijn verkrijgbaar in een grote voorraad van varianten met verschillende fotofysische en chemische eigenschappen 1. Echter, organische fluoroforen blijven de eerste keuze voor in vitro experimenten vanwege hun grotere photostability (tot 100 maal stabieler dan KP) 8,9, klein formaat (tot 100 maal kleiner volume dan FP) en gemak van intramoleculaire labeling (hoofdzakelijk door middel van cysteïneresten). Al deze factoren zijn met name belangrijk voor enkel-molecuul fluorescentie en FRET bestudeert 10.
Verschillende internalisatie methoden combining de voordelen van biologische etikettering en in vivo detectie geïntroduceerd in het afgelopen decennium; Dergelijke werkwijzen hebben ofwel relatief grote polypeptiden markeringen (bijvoorbeeld TMP, halogeen of 20 kDa SNAP markeringen) 11-14, vereisen het gebruik van niet-natuurlijke aminozuren 15 of beperkt tot een enkele, grote membraan eukaryotische cellen (bijv. , schraap laden, spuit laden, micro-injectie) 16-19.
Dit protocol beschrijft een nieuwe, eenvoudige en high-throughput internalisatie methode die koppels de voordelen van biologische fluoroforen met in vivo observatie. Om deze techniek te ontwikkelen wij elektroporatieprocedure vaak gebruikt om cellen te transformeren met plasmide DNA 20,21 om micro-organismen, zoals E. laden aangepast coli of S. cerevisiae met organisch label biomoleculen. Het protocol bestaat uit 4 stappen: incubatie van cellen met gelabelde biomoleculen,elektroporatie, cel herstel, en cel wassen om niet-geïnternaliseerde biomoleculen te verwijderen. Hier presenteren we deze elektroporatie protocol, alsook de cell imaging en gegevensanalyse processen celgebaseerde en enkel-molecuul fluorescentie bestuderen en FRET-signalen.
Elektroporatie vertrouwt op het ontladen van een hoog voltage elektrische veld over een lage ionsterkte celsuspensie voorbijgaande membraan poriën waardoor biomoleculen cellen kan komen (figuur 1) 20,21 vormen. Net als bij transformatie van bacteriën of gist met plasmide-DNA, cellen voorafgaand aan elektroporatie hun electrocompetency waarborgen worden voorbereid. Deze procedure bestaat uit verscheidene wasstappen met water, verhoogt het membraan permeabiliteit en verlaagt de ionische sterkte van de celoplossing boogvorming in de elektroporatie cuvette te voorkomen. In dit protocol kunnen cellen worden bereid zoals hieronder beschreven (zie PROTOCOL: 1,1) of gekocht van commerciële aanbieders.
Figuur 1: Schematische weergave van de internalisatie protocol Van links naar rechts:. Voeg enkele microliters van gelabelde biomoleculen aan het monster van elektrocompetente cellen (dubbel-gemerkte DNA-fragmenten en bacteriën in dit voorbeeld); Incubeer 1 tot 10 minuten op ijs en naar een vooraf gekoelde elektroporatie cuvette; electroporate en voeg dan 0,5-1 ml rijk medium aan de cellen onmiddellijk na; incuberen bij 37 ° C (of de door het organisme temperatuur, bijvoorbeeld 29 ° C voor gist) laten de cellen te herstellen; voeren 5 wassen stappen om het overtollige niet-geïnternaliseerde gelabelde moleculen te verwijderen; resuspendeer de laatste pellet in 100-200 pi PBS-buffer en pipet 10 pi op een agarose pad; bedekken het pad met een gereinigd dekglaasje en beeld op een fluorescentie microscoop (in brede veld modus of HILO-modus).
Terwijl DNA internalisatie is eenvoudig (figuur 2), moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen bij het internaliseren van gelabelde eiwitten met behulp van elektroporatie. Ten eerste, zou de voorraad monster van organisch gemerkt eiwit bevatten nog steeds een klein percentage van de vrije kleurstof. Gratis dye moleculen zijn veel kleiner dan eiwitten en kan daarom bij voorkeur te worden geïnternaliseerd. Om de overgrote meerderheid van de waargenomen geïnternaliseerde fluorescerende moleculen overeen met het eiwit van interesse, moet de initiële eiwitmonster minder dan ~ 2% bevatten vrije kleurstof (Figuur 5) 22. De overmaat van niet-geïnternaliseerde gelabelde eiwitten kunnen ook vasthouden aan de buitenste celmembraan na elektroporatie; Dit fenomeen eiwit specifiek en moet worden gecontroleerd bij elke nieuwe eiwit. Wij stellen verschillende opties die de verwijdering van niet-geïnternaliseerde eiwitten van de geladen celmonster mogelijk maakt (zie PROTOCOL: 3.3.3).
Tenslotte worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in een klein volume fosfaatbuffer en gepipetteerd op een agarose pad, zodat de weergave op een fluorescentie microscoop. Immobilisatie op agarose pads is een simple en efficiënte manier van beeldvorming van cellen op een dekglaasje zonder nadelige gevolgen voor hun integriteit. Het pad moet een low-fluorescentie kweekmedium bevatten.
Cell imaging kan worden uitgevoerd in groothoek, totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) of met behulp van HILO (hoogst geneigde en gelamineerd Optical Blad) microscopie. In de HILO configuratie, de laserstraal dringt dieper in het monster dan in TIRF, maar niet het gehele monster voor groothoek verlichten, waardoor een grotere signaal-ruisverhouding 23. Afhankelijk van het laservermogen en tijdsresolutie gebruikt, kan geïnternaliseerd biomoleculen worden geteld (met behulp van stapsgewijze fotobleken analyse, figuur 3), gelokaliseerde of bijgehouden 24-28. Internalisatie van dubbel gemerkte constructen met een FRET paar fluoroforen maakt de kwantificering van FRET zowel eencellige of single-molecule niveaus (Figuur 6).
Verschillende parameters kunnen worden gevarieerdafhankelijk van de gewenste uitvoer en het biologische systeem bestudeerd. Ten eerste kan de hoeveelheid materiaal per cel geïnternaliseerd worden afgestemd door veranderen van de concentratie van gemerkte biomoleculen aan de cellen toegevoegd vóór elektroporatie (figuur 2). Elektroporatie veldsterkte zal ook zowel het laden efficiency en levensvatbaarheid van de cellen te beïnvloeden; zoals verwacht, terwijl de beladingsgraad toeneemt met toenemende veldsterkte, de levensvatbaarheid van geëlektroporeerde cellen afneemt (figuur 4A). Beide parameters kunnen worden gekwantificeerd door het opnemen van het percentage van geladen en delende cellen na elektroporatie. Dit levensvatbaarheid test in combinatie met fluorescentie beeldvorming controleert ook de waarneming van geïnternaliseerde biomoleculen in levende cellen en laten continue observatie over meerdere generaties (Figuur 4B).
Kortom, dit protocol maakt de internalisering van fluorescent gelabelde DNA en eiwitmoleculen inE. coli of S. Cerevisiae 26. Individuele moleculen gelabeld met organische fluoforen kan worden gevolgd met een hoge tijdruimtelijk resolutie voor tijdschalen een orde van grootte meer dan KP's. Tenslotte is deze werkwijze geschikt groothoek, TIRF en confocale detectie en gepulste excitatie's, zoals ALEX (afwisselende laser excitatie 28,29).
Veel parameters kunnen worden gevarieerd tijdens cell elektroporatie en data acquisitie afhankelijk van het biologisch systeem van belang en de precieze aard van het experiment (celniveau of single-molecule analyse). Wanneer bijvoorbeeld electroporating DNA in bacteriën, 0,25-5 pmol gelabelde dsDNA fragmenten leidt tot een lage internalisatie efficiëntie, die rechtstreeks werkende moleculen detectie (bijv., Zonder fotobleken vooraf). Boven 5 pmol dsDNA, cellen hebben de neiging om zwaar worden geladen, een regime beter geschikt voor single-cell analyse. Alle gelabelde DNAs ook eerder gel gezuiverd om elk spoor van vrije kleurstof te verwijderen (niet-gereageerde fluorofoor) vanaf het DNA voorraadoplossing. Trouwens, mogelijke problemen met DNA degradatie, met name voor smFRET experimenten, kunnen worden aangepakt met behulp van DNA's met onnatuurlijke nucleïnezuren, of motieven die exonuclease-toegankelijke termini te beschermen, zoals haarspeld lussen.
Een andere adjustable parameter elektroporatie is de veldsterkte toegepast tijdens elektroporatie. Lage veldsterkte (~ 1 kV / cm) leidt tot een lage beladingsgraad geschikt voor single-molecule studies. Hogere sterktes veld (tot 1,8 kV / cm) zal het laden efficiëntie te verhogen; echter, er een omgekeerde correlatie tussen veldsterkte en levensvatbaarheid van de cellen na elektroporatie (zie figuur 4). Ter referentie, een normale veldsterkte voor bacteriën en gist elektroporatie is -1,5 kV / cm. De tijdconstante vertegenwoordigt de lengte van het verval, is een handige parameter te volgen, omdat de tijdconstante daalt zodra er vonken verschijnsel optreedt in de cuvette. Onder normale instellingen, moet de tijdconstante van meer dan 4 ms; lagere waarden zal leiden tot een lage beladingsgraad of zelfs niet-geladen beschadigde cellen. De meeste electroporators bieden andere vrijheidsgraden (zoals "pulse truncatie" of "pulsvorm"), die kan worden aangepast om af te stemmen beidecel laden en levensvatbaarheid. We pasten deze methode zowel bacteriën en gisten, maar soortgelijke procedures ook de internalisatie van gelabelde biomoleculen in zoogdiercellen mogelijk met geschikte electroporator instellingen omdat hun membraan eigenlijk minder complex (enkele lipide dubbellaag) en aangezien elektroporatie is al gebruikt met dergelijke cellen 21.
Wanneer internaliserend gemerkte eiwitten, heeft al vrij kleurstof uit het gemerkte eiwit stock oplossing vóór elektroporatie worden verwijderd. Vrije kleurstofmoleculen, vanwege hun kleinere afmetingen, kunnen worden geïnternaliseerd voorkeur de eiwitten van belang en zijn moeilijk te onderscheiden tijdens de data-analyse (ondanks hun verwachte snellere diffusie). Als richtlijn voor een monster van biologisch gelabeld eiwit geschikt voor elektroporatie, moet de hoeveelheid resterende vrije kleurstof minder dan 2% (gedetecteerd met fluorescentie scanning van een SDS-PAGE) 22. Dit proces is bijzonder belangrijk,zoals sommige moleculen kunnen kleven aan de buitenste membranen van geëlektroporeerd bacteriën of gist. In dit verband moet het negatieve controlemonster fluorescentie-intensiteit per cel duidelijk onder geëlektroporeerde cellen, idealiter zo laag als de autofluorescentie niveau van lege cellen (cellen die niet zijn geïncubeerd met elk fluorescent gelabelde biomoleculen of elektroporatie, figuur 2) weergegeven.
Zoals met dsDNA, wordt de internalisatie efficiëntie van gelabelde eiwitten gekoppeld aan de hoogte van biomoleculen aan de cellen toegevoegd voorafgaand aan elektroporatie. Echter, andere parameters, zoals de grootte en lading, een rol spelen in internalisatie. Kleine eiwitten vertonen een hoge internalisatie efficiëntie, terwijl grotere eiwitten (tot 98 kDa) kunnen vervolgens worden geïnternaliseerd, maar met een lagere efficiëntie (figuur 5) 26. De isolelectric punt van het proteïne, potentiële interacties met de celmembraan en andere fysico-chemische parameters ookinvloed cel laden tijdens elektroporatie. Dientengevolge moeten gebruikers experimenten optimaliseren hun eigen systeem wetenschap dat een hoge beginconcentratie van gemerkt eiwit (> 50 uM) de beste kans op succes geladen geven. Elektroporatie biedt ook een nieuwe tool te verstoren en te analyseren cellulaire functie door de invoering van eiwitten en andere biomoleculen in cellen (ofwel gemerkte of niet-gemerkte). De T7 RNA polymerase experimenten (Figuur 5C) aanwezig zo'n voorbeeld van een experiment waarbij we een biomolecule die genexpressie veranderen in vivo middels elektroporatie kunnen introduceren.
Bij het uitvoeren van enkel-molecuul fluorescentie experimenten wordt TIR belichting meestal de voorkeur boven andere verlichtingsmodi omdat daarmee de beste signaal-ruisverhouding prikkelen slechts fluoroforen binnen een dunne gedeelte boven het dekglaasje oppervlak (~ 100 nm). Maar beeldvorming gelabelde biomoleculen te diffunderen in levende micro-organismen kunnen rekatern dieper verlichting (tot 0,8 micrometer voor E. coli). Dieper verlichting wordt bereikt HILO modus toch een hoge signaal-ruisverhouding. Anderzijds, breed beeldveld is bijzonder belangrijk voor stapsgewijs fotobleken analyse, waarbij de gebruiker het schatten van het aantal geïnternaliseerde moleculen door fotobleken een volledig geladen cel met hoog laservermogen en de initiële cel fluorescentie-intensiteit te delen door het unitaire intensiteit geproduceerd door een enkel molecuul (één fotobleken stap, figuur 3). Widefield beeldvorming is ook vereist voor langdurige molecuul volgen om de diffunderende moleculen van interesse lokaliseren zelfs als de trajecten de gehele cell volume.
In dit protocol presenteren we hoe elektroporatie, een standaardtechniek voor biologen en biochemici voor het afleveren van nucleïnezuren in cellen, is een eenvoudige werkwijze voor het afleveren fluorescerende biomoleculen in verschillende celtypen. This nieuw, high-throughput techniek biedt een unieke tool om gelabelde moleculen te observeren in hun eigen omgeving. Bovendien biomoleculen gemerkt met fluoroforen die een breed golflengtegebied, elektroporatie kunnen moleculen gemodificeerd met vele chemische groepen, zoals onnatuurlijke nucleotiden en aminozuren, metaal chelatoren, crosslinkers en kooien groepen leveren. Als het biologische systeem van belang is niet essentieel voor de celontwikkeling, kan het gen dat codeert voor het doeleiwit worden verwijderd (of aangereden), zodat de waargenomen na internalisatie eiwitten vertegenwoordigen alle (of de meeste) van het intracellulaire eiwit- . In wezen kan elektroporatie "transplantatie" de flexibiliteit van in vitro biologische conjugaten in levende cellen ten voordele inspanningen synthetische biologie, systeembiologie en in vivo single-molecule detectie.
The authors have nothing to disclose.
We thank Stephan Uphoff for discussions.
R.C. was supported by Linacre College, Oxford University. A.P. was supported by the German Academic Exchange Service (DAAD), the German National Academic Foundation and EPSRC. M.S. was supported by the Wellcome Trust. A.N.K. was supported by a UK BBSRC grant (BB/H01795X/1), and a European Research Council Starter grant (261227).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
ElectroMax DH5-alpha Comptent cells | Invitrogen | 11319-019 | or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast. |
EZ Rich Defined Madia | Teknova | M2105 | low fluorescence rich media |
MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | or any classical electroporator for microorganism transformation |
Certified Molecular Biology agarose | Biorad | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
Microscope coverslips No 1.5 thickness | Menzel | BB024060SC | remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h |
Single-molecule fluorescence microscope | Home-built | described in REFs | |
Localization software | Custom-written, available online | MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. | |
Tracking software | Available online | MATLAB implementation by Blair and Dufresne. |