Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.
The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation.
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiæ, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.
Die meisten Fluoreszenzuntersuchungen in lebenden Zellen hängen von Proteinfusionen mit fluoreszierenden Proteinen (FRP), wie GFP 1. Diese fluoreszierenden Tags erlauben Untersuchungen der Kopienzahl, Diffusionsmuster oder Lokalisierung von Proteinen in Prozesse wie die Genexpression oder Membrantransport 7.2 beteiligt. Rahmenprogramme bieten eine hohe Kennzeichnungs Spezifität, einfach implementiert werden und sind in einem großen Bestand an Varianten mit unterschiedlichen photophysikalischen und chemischen Eigenschaften 1 zur Verfügung. Allerdings bleiben organische Fluorophore die erste Wahl für die in vitro durch ihre größere Fotoexperimente (bis zu 100-mal stabiler als RP) 8,9, geringe Größe (bis zu 100-fach geringeres Volumen als RP) und die einfache intramolekulare Kennzeichnung (vor allem durch die Verwendung von Cystein-Resten). Alle diese Faktoren sind besonders wichtig für die Einzelmolekül-Fluoreszenz und FRET untersucht 10.
Mehrere Internalisierung Methoden combining die Vorteile von Bio-Kennzeichnung und in-vivo-Nachweis haben sich im letzten Jahrzehnt eingeführt wurden; aber solche Methoden entweder beschäftigen relativ große Polypeptide Tags (zB TMP, Halogen oder 20 kDa SNAP Tags) von 11 bis 14, erfordern die Verwendung von unnatürlichen Aminosäuren 15 oder an großen, Single-Membran eukaryotischen Zellen beschränkt (z. , Scrape Loading, Spritze Belastung, Mikroinjektion) 16-19.
Dieses Protokoll beschreibt eine neue, einfache und Hochdurchsatz-Verfahren Verinnerlichung, dass Paare die Vorteile organischer Fluorophore mit in vivo Beobachtung. Um diese Technik zu entwickeln, passten wir die Elektroporation Verfahren häufig verwendet, um Zellen mit Plasmid DNA 20,21 um Mikroorganismen, wie E. laden Transformations coli oder S. cerevisiae mit organisch markierten Biomolekülen. Das Protokoll besteht aus 4 Schritten: Inkubation von Zellen mit markierten BiomoleküleElektroporation, Zellgewinnung und Zellwasch auf nicht verinnerlicht Biomolekülen zu entfernen. Hier präsentieren wir dieses Elektroporation Protokoll, sowie die Cell Imaging und Datenanalyseverfahren, um zellbasierte und Einzelmolekül-Fluoreszenz zu studieren und FRET-Signale.
Elektroporation beruht auf Entladen eines elektrischen Hochspannungsfeld in einer niedrigen Ionenstärke Zellsuspension transienter Membranporen durch die Biomoleküle Zellen eindringen (Figur 1) 20,21 bilden. Genau wie bei Transformation von Bakterien oder Hefe, die mit Plasmid-DNA, haben Zellen vor der Elektroporation ihre electrocompetency zu gewährleisten, hergestellt werden. Dieses Verfahren, das aus mehreren Waschschritten mit Wasser, erhöht die Durchlässigkeit der Membran und verringert die Ionenstärke der Zelllösung, um Überschlagen im Elektroporationsküvette vermeiden. In diesem Protokoll können Zellen, wie unten beschrieben (siehe PROTOCOL: 1,1), hergestellt werden oder von kommerziellen Anbieter gekaufts.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Internalisierung Protokoll Von links nach rechts:. Es werden einige Mikroliter der markierten Biomolekülen auf das Aliquot elektrokompetenter Zellen (doppelt markierte DNA-Fragmente und Bakterien in diesem Beispiel); Inkubation 1 bis 10 Minuten auf Eis und Transfer in ein vorgekühltes Elektroporationsküvette; elektroporieren und fügen 0,5-1 ml Vollmedium zu den Zellen unmittelbar nach; Inkubieren bei 37 ° C (oder der durch den Organismus erforderliche Temperatur, beispielsweise 29 ° C für Hefe) die Zellen zu gewinnen lassen; 5 Waschschritte durchführen, um überschüssige nicht internalisierte markierten Moleküle zu entfernen; resuspendieren endgültige Pellet in 100-200 ul PBS-Puffer und Pipette 10 ul auf einem Agarose-Pad; decken Sie das Pad mit einem Deckglas reinigen und Bild auf einem Fluoreszenzmikroskop (in Weitfeld-Modus oder HILO-Modus).
Während DNA-Internalisierung ist unkompliziert (Abbildung 2), als Internalisierungsfaktor markierten Proteine unter Verwendung von Elektroporation die ergriffen werden müssen Vorsichtsmaßnahmen. Erstens könnte die Aktie Probe organisch markierten Proteins noch eine geringe Prozentsatz an freiem Farbstoff. Freien Farbstoffmoleküle sind viel kleiner als Proteine und könnte daher bevorzugt internalisiert werden. Um sicherzustellen, dass die überwiegende Mehrheit der beobachteten internalisiert fluoreszierenden Molekülen zu dem Protein von Interesse entspricht, sollte die anfängliche Proteinprobe weniger als ~ 2% enthalten freie Farbstoff (5) 22. Der Überschuß an nicht internalisierte markierten Proteine können auch an der äußeren Zellmembran nach der Elektroporation kleben; Dieses Phänomen ist proteinspezifische und muss für jede neue Protein kontrolliert werden. Wir schlagen vor, mehrere Optionen, die die Entfernung von nicht internalisierte Proteine aus der geladenen Zellprobe zu ermöglichen (siehe PROTOKOLL: 3.3.3).
Schließlich werden die Zellen in einem kleinen Volumen von Phosphatpuffer pipettiert und auf einem Agarose-Pad, wodurch die Abbildung auf einem Fluoreszenzmikroskop. Immobilisierung auf Agarose-Pads ist ein simple und effiziente Art der Bildgebung von Zellen auf einem Deckglas ohne Schädigung ihrer Integrität. Die Unterlage sollte eine niedrige Fluoreszenzkulturmedium enthalten.
Cell Imaging kann entweder im Weitfeld, Totalreflexions-Fluoreszenz (TIRF) oder über HILO (stark geneigt und laminierte optische Sheet) Mikroskopie durchgeführt werden. Im HILO Konfiguration dringt der Laserstrahl tiefer in die Probe als im TIRF, noch nicht die gesamte Probe wie für Weitfeld zu beleuchten, so dass ein größeres Signal-zu-Rausch-Verhältnisses 23. In Abhängigkeit von der Laserleistung und Zeitauflösung verwendet wird, kann verinnerlicht Biomoleküle angerechnet werden (mit Hilfe schrittweise Photobleaching-Analyse, Abbildung 3), lokalisiert oder verfolgt 24-28. Internalisierung von doppelt markierten Konstrukte mit einem FRET-Paar von Fluorophoren erlaubt die Quantifizierung von FRET sowohl auf Einzelzelle oder der Einzelmolekülebenen (Abbildung 6).
Verschiedene Parameter können variiert werden,abhängig von der gewünschten Leistung und dem biologischen System untersucht. Erstens kann die Menge des Materials pro Zelle internalisiert durch Verändern der Konzentration von markierten Biomolekülen zugegeben, um die Zellen vor der Elektroporation (2) eingestellt werden. Elektroporation Feldstärke wird auch beeinflussen sowohl die Ladeeffizienz und die Lebensfähigkeit der Zellen; wie erwartet, während die Ladeeffizienz erhöht sich mit zunehmender Feldstärke, die Lebensfähigkeit der elektroporierten Zellen ab (4A). Beide Parameter können durch Aufzeichnung der Prozentsatz der belasteten und sich teilenden Zellen nach der Elektroporation zu quantifizieren. Diese Lebensfähigkeitstest in Verbindung mit Fluoreszenz-Bildgebung überprüft auch die Beobachtung von verinnerlicht Biomoleküle in lebenden Zellen und ermöglichen eine kontinuierliche Beobachtung über mehrere Generationen (4B).
Zusammenfassend lässt dieses Protokoll die Internalisierung von fluoreszenzmarkierten DNA-und Proteinmoleküle inE. coli oder S. cerevisiae 26. Einzelmoleküle mit organischen Fluorophoren markiert mit hoher Raum-Zeit-Auflösung für Zeitskalen eine Größenordnung länger als RP verfolgt werden. Schließlich ist dieses Verfahren mit Weitfeld, TIRF und konfokale Detektion sowie gepulste Anregung Systeme wie ALEX (Wechsellaseranregung 28,29) kompatibel.
Viele Parameter können während der Zell Elektroporation und die Datenerfassung in Abhängigkeit von dem biologischen System von Interesse und der genauen Art des Experiments (Zellebene oder Einzelmolekülanalyse) variiert werden. Wenn zum Beispiel die Elektroporation von DNA in Bakterien, 0,25 bis 5 pmol der markierten dsDNA-Fragmenten führt zu einer geringen Effizienz der Internalisierung, die eine direkte Detektion von Einzelmolekülen (dh., Ohne die Notwendigkeit einer Photobleich vorher). Vor 5 pmol dsDNA, Zellen dazu neigen, stark belastet werden, eine Regelung für die Einzelzell-Analyse besser geeignet. Alle markierten DNAs sollten zuvor gelgereinigt, um jede Spur von freien Farbstoff zu entfernen (nicht-umgesetzte Fluorophor) von der DNA-Stammlösung. Außerdem potenzielle Probleme mit den DNA-Abbau, insbesondere für smFRET Experimente können mit DNAs mit unnatürliche Nukleinsäuren oder Motive, die Exonuclease-zugänglichen Enden zu schützen, wie Haarnadelschleifen richten.
Ein weiterer adjustablE-Parameter in der Elektroporation ist die Feldstärke während der Elektroporation angewendet. Niedriger Feldstärke (~ 1 kV / cm) wird auf einen niedrigen Ladeeffizienz für Einzelmoleküluntersuchungen angemessen zu führen. Höhere Feldstärken (bis zu 1,8 kV / cm) wird die Ladeeffizienz zu steigern; jedoch gibt es eine umgekehrte Korrelation zwischen Feldstärke und die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Elektroporation (siehe Abbildung 4). Zur Bezugnahme ist eine normale Feldstärke für Bakterien und Hefe Elektroporation verwendet ~ 1,5 kV / cm. Die Zeitkonstante, die die Länge dieser Zerfall, ist ein bequemer Parameter zu folgen, da die Zeitkonstante sinkt, sobald eines Bogenphänomens in der Küvette erfolgt. Unter normalen Einstellungen sollte die Zeitkonstante größer als 4 ms ist; niedrigere Werte auf niedrige Ladeeffizienz oder sogar nicht-geladenen beschädigten Zellen führen. Meist electroporators bieten anderen Freiheitsgraden (wie "Impuls Abschneiden" oder "Impulsform"), der zur Abstimmung sowohl modifiziert werden könnenZelle Lade und Lebensfähigkeit. Wir wendeten diese Methode, um sowohl Bakterien und Hefen, jedoch ähnliche Verfahren soll auch die Internalisierung von markierten Biomolekülen in Säugerzellen unter Verwendung geeigneter Elektroporator Einstellungen seit der Membran ist eigentlich weniger komplex (Einzel Lipid-Doppelschicht), und da die Elektroporation bereits mit solchen Zellen verwendet 21.
Wenn Internalisierung markierten Proteinen, braucht alle freien Farbstoff aus dem markierten Protein-Stammlösung vor Elektroporation entfernt werden. Freien Farbstoffmoleküle, die aufgrund ihrer kleineren Größe können bevorzugt gegenüber der interessierenden Proteine internalisiert werden, und sind schwierig während der Datenanalyse (trotz ihrer voraussichtlich schneller Diffusion) zu unterscheiden. Als Anhaltspunkt für eine Probe von biologischem markierten Proteins geeignet zur Elektroporation zu sein, sollte die Menge des verbleibenden freien Farbstoffes unter 2% (detektiert unter Verwendung von Fluoreszenzabtastung einer SDS-PAGE) 22. Dieses Verfahren ist besonders wichtig,da einige Moleküle könnten an den äußeren Membranen von Bakterien oder Hefe elektroporiert haften. In dieser Hinsicht sollte die negative Kontrollprobe Fluoreszenzintensität pro Zelle deutlich niedriger als elektroporierten Zellen, idealerweise so niedrig wie der Autofluoreszenz Niveau der leeren Zellen (Zellen, die nicht mit fluoreszenzmarkierten Biomoleküle inkubiert wurden noch elektroporiert, Bild 2) an.
Wie bei dsDNA wird der Internalisierung Effizienz markierte Proteine zur Menge der Biomoleküle an die Zellen vor der Elektroporation hinzugefügt verbunden. Aber auch andere Parameter, wie Größe und Ladung, eine Rolle bei der Internalisierung. Kleine Proteine zeigen eine hohe Internalisierung Effizienzen, während größere Proteine (von bis zu 98 kDa) kann erfolgreich internalisiert werden, aber mit geringerer Effizienz (Figur 5) 26. Der isoelektrische Punkt des Proteins, mögliche Wechselwirkungen mit der Zellmembran und anderen physikalisch-chemischen Parametern auchEinfluss Zellbelastung während der Elektroporation. Infolgedessen müssen die Benutzer Experimente für ihre eigenen System zu optimieren, zu wissen, daß eine hohe Anfangskonzentration des markierten Proteins (> 50 uM) die besten Chancen für eine erfolgreiche Belastung ergeben. Elektroporation bietet auch ein neues Werkzeug, um zu stören und zu analysieren, die Zellfunktion durch die Einführung von Proteinen und anderer Biomoleküle in Zellen (entweder markiert oder unmarkiert). Die T7-RNA-Polymerase-Experimente (5C) vorhanden ist, so ein Beispiel für ein Experiment, wo wir ein Molekül, das die Genexpression in vivo unter Verwendung von Elektroporation ändern kann einzuführen.
Bei der Durchführung von Einzelmolekülfluoreszenzexperimenten wird TIR Beleuchtungs Regel über andere Beleuchtungsarten bevorzugt, da es die beste Signal-zu-Rausch-Verhältnis durch Erregen nur Fluorophore innerhalb einer dünnen Abschnitt oberhalb der Deckfläche (~ 100 nm). Allerdings Bildgebung markierten Biomolekülen diffundieren in lebenden Mikroorganismen könnte erneuterfordern tiefere Beleuchtung (bis zu 0,8 & mgr; m für E. coli). Tiefere Beleuchtung in HILO Modus erreicht, unter Beibehaltung eines hohen Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Andererseits ist Weitfeldabbildungs besonders wichtig für schrittweises Bleichen Analyse, bei dem der Anwender die Schätzung der Anzahl der Moleküle internalisiert durch Photobleichen eines gesamten belasteten Zelle mit hoher Laserleistung und Dividieren des Anfangszellfluoreszenzintensität durch die einheitliche Intensität erzeugt von einem einzelnen Molekül (single Bleichen Schritt 3). Weitfeld-Bildgebung wird auch für die Langzeit Molekül Verfolgung, um die streuenden Moleküle von Interesse zu lokalisieren, auch erforderlich, wenn ihre Flugbahn decken das gesamte Zellvolumen.
In diesem Protokoll präsentieren wir, wie Elektroporation, eine Standardtechnik für Biologen und Biochemikern zur Abgabe von Nukleinsäuren in Zellen, stellt eine einfache Methode zur Bereitstellung von fluoreszierenden Biomolekülen in verschiedenen Zelltypen. Thist neu, bietet Hochdurchsatz-Technik ein einzigartiges Werkzeug, um markierte Moleküle in ihrer natürlichen Umgebung zu beobachten. Zusätzlich Biomolekülen mit Fluorophore mit einem breiten Spektrum von Wellenlängen gekennzeichnet, die Elektroporation können Moleküle mit vielen chemischen Gruppen, wie unnatürliche Nukleotide und Aminosäuren, Metallchelatoren, Vernetzer und Käfighaltung Gruppen modifiziert zu liefern. Wenn das biologische System in der Umgebung ist nicht wesentlich für die Zellentwicklung, kann das Gen-Kodierung für das Zielprotein ebenfalls gelöscht (oder zerlegt), so dass die nach Internalisierung beobachtet Proteine stellen alle (oder die meisten) der intrazellulären Proteinpool . Im Wesentlichen kann die Elektroporation "Transplantation" die Flexibilität des In-vitro-Biokonjugate in lebende Zellen und damit profitieren Bemühungen in der Synthetischen Biologie, Systembiologie und In-vivo-Detektion von Einzelmolekülen.
The authors have nothing to disclose.
We thank Stephan Uphoff for discussions.
R.C. was supported by Linacre College, Oxford University. A.P. was supported by the German Academic Exchange Service (DAAD), the German National Academic Foundation and EPSRC. M.S. was supported by the Wellcome Trust. A.N.K. was supported by a UK BBSRC grant (BB/H01795X/1), and a European Research Council Starter grant (261227).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
ElectroMax DH5-alpha Comptent cells | Invitrogen | 11319-019 | or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast. |
EZ Rich Defined Madia | Teknova | M2105 | low fluorescence rich media |
MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | or any classical electroporator for microorganism transformation |
Certified Molecular Biology agarose | Biorad | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
Microscope coverslips No 1.5 thickness | Menzel | BB024060SC | remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h |
Single-molecule fluorescence microscope | Home-built | described in REFs | |
Localization software | Custom-written, available online | MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. | |
Tracking software | Available online | MATLAB implementation by Blair and Dufresne. |