Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.
The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation.
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiæ, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.
רוב מחקרי הקרינה בתוך תאי חיים תלויים בשילובי חלבון עם חלבוני ניאון (fps), כגון GFP 1. תגי ניאון אלה מאפשרים לימודים של עותק מספר, דפוס דיפוזיה או לוקליזציה של חלבונים מעורבים בתהליכים כגון ביטוי גנים או תחבורת קרום 2-7. FPS מציע סגוליות תיוג גבוה, יישום קל, והם זמינים במלאי גדול של גרסאות עם photophysical השונים ותכונות כימיות 1. עם זאת, fluorophores האורגני יישאר בחירת ראש לניסויים במבחנה בשל photostability הגדולה יותר (עד 100 פי יציב יותר מFPS) 8,9 גודל קטן, (עד 100 פי נפח קטן יותר FPS) וקלות תיוג intramolecular (בעיקר באמצעות השימוש בשאריות ציסטאין). כל הגורמים הללו הם חשובים במיוחד לקרינת מולקולה בודדת וסריג לומד 10.
COMBIN שיטות הפנמה כמהing היתרונות של תיוג אורגני ובאיתור vivo הוכנס בעשור האחרון; עם זאת, שיטות כאלה או להעסיק תגי פוליפפטידים גדולים יחסית (תגים למשל, TMP, HALO, או 20 kDa SNAP) 11-14, דורשות השימוש בחומצות אמינו לא טבעיות 15, או מוגבלות לתאים גדולים, חד-קרום האיקריוטים (למשל. , לגרד טעינה, טעינת מזרק, microinjection) 16-19.
פרוטוקול זה מתאר שיטת הפנמת רומן, פשוט ותפוקה גבוהה כי זוגות היתרונות של fluorophores האורגנית עם תצפית in vivo. כדי ששיטה זו, אנו מותאמים הליך electroporation הנפוץ להפוך תאים עם DNA פלסמיד 20,21 כדי לטעון מיקרואורגניזמים, כגון E. coli או S. cerevisiae עם מולקולות ביולוגיות שכותרתו אורגנית. הפרוטוקול כולל 4 צעדים פשוטים: דגירה של תאים עם מולקולות ביולוגיות שכותרתו,electroporation, התאוששות תא, ושטיפת תא כדי להסיר מולקולות ביולוגיות-הפנים שאינם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול זה electroporation, כמו גם את תהליכי ההדמיה תא וניתוח נתונים ללמוד הקרינה מבוססת תאים ומולקולה בודדת וסריג אותות.
Electroporation מסתמכת על פריקת שדה חשמלי במתח גבוה על פני השעיה תא כוח יונית נמוכה כדי ליצור נקבוביות קרום חולף דרכו מולקולות ביולוגיות יכולות להיכנס לתאים (איור 1) 20,21. בדיוק כמו עם הפיכתו של חיידקים או פטריות עם פלסמיד דנ"א, תאים צריכים להיות מוכנים לפני electroporation כדי להבטיח electrocompetency. הליך זה, בהיקף של כמה צעדי שטיפה במים, מגדיל את החדירות הממברנה ומוריד את החוזק היוני של פתרון התא, כדי למנוע קשתי בקובט electroporation. בפרוטוקול זה, יכולים להיות מוכן תאים כמפורט להלן (ראה פרוטוקול: 1.1) או שנרכשו מספק מסחרי s.
איור 1: ייצוג סכמטי של פרוטוקול ההפנמה משמאל לימין:. להוסיף כמה מיקרוליטר של מולקולות ביולוגיות שכותרת לaliquot של תאי electrocompetent (קטעי דנ"א כפול שכותרתו וחיידקים בדוגמא זו); דגירה 1 עד 10 דקות על קרח ומעביר לקובט electroporation טרום צונן; electroporate ולאחר מכן להוסיף 0.5-1 מיליליטר בינוני עשיר לתאים מייד לאחר; לדגור על 37 ° C (או בטמפרטורה הנדרשת על ידי האורגניזם, למשל, 29 ° C עבור שמרים) כדי לאפשר לתאים להתאושש; לבצע 5 צעדי כביסה כדי להסיר כל שאינן מופנמת-מולקולות עודפות שכותרתו; resuspend את הכדור האחרון ב100-200 μl של חיץ PBS ופיפטה 10 μl על כרית agarose; לכסות את משטח עם coverslip ניקה ותמונה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי (במצב רחב שדה או במצב חילו).
בעוד הפנמת DNA היא פשוטה (איור 2), אמצעי זהירות יש לנקוט כאשר הפנמת חלבונים שכותרתו באמצעות electroporation. ראשית, מניית המדגם של חלבון הנקרא באופן אורגני עשוי עדיין מכיל אחוז קטן של צבע חופשי. מולקולות צבע חינם הן הרבה יותר קטנות מאשר חלבונים ולפיכך יתכן כי הפנימו מועדף. כדי להבטיח כי רובם המכריע של נצפו מולקולות ניאון הפנימו מתאים לחלבון של עניין, מדגם החלבון הראשוני צריך להכיל פחות מ ~ 2% צבע חופשי (איור 5) 22. העודף של אי-הפנימו חלבונים שכותרתו יכול גם להיצמד לקרום התא החיצוני לאחר electroporation; תופעה זו היא חלבון ספציפי וצריכה להיבדק לכל חלבון חדש. אנו מציעים מספר אפשרויות המאפשרות את הסרתם של חלבונים-הפנים שאינם ממדגם התא הטעון (ראה פרוטוקול: 3.3.3).
לבסוף, תאי resuspended בנפח קטן של חיץ פוספט וpipetted על כרית agarose, המאפשרים ההדמיה שלהם במיקרוסקופ פלואורסצנטי. קיבוע על רפידות agarose הוא simplדואר ודרך יעילה של תאי הדמיה על coverslip מבלי לפגוע שלמותם. הכרית צריכה להכיל מדיום תרבות נמוכה הקרינה.
הדמיה תא יכולה להתבצע במיקרוסקופ או בwidefield, סך הקרינה השתקפות פנימית (TIRF) או באמצעות הילו (מאוד משופע וגיליון אופטי רבודה). בתצורה חילו, קרן הלייזר חודרת עמוקה יותר לתוך הדגימה מאשר בTIRF, עדיין לא להאיר את המדגם כולו כלwidefield, המאפשר יחס אות לרעש גדול יותר 23. בהתאם לרזולוצית כוח הלייזר וזמן שימוש, ניתן לספור מולקולות ביולוגיות הפנימו (באמצעות ניתוח photobleaching-שלבים, איור 3), מקומיות, או במעקב 24-28. הפנמה של מבנים שכותרתו כפליים עם זוג סריג של fluorophores מאפשרת כימות של סריג הן בתא בודד או רמות מולקולה בודדת (איור 6).
יכולים להיות מגוונים פרמטרים שוניםבהתאם לפלט הרצוי והמערכת הביולוגית למדה. ראשית, כמות החומר הפנים לכל תא יכולה להיות מכוונת על ידי שינוי הריכוז של מולקולות ביולוגיות שכותרתו נוספה לelectroporation התאים הקודם (איור 2). עוצמת שדה Electroporation תשפיע גם הן את יעילות הטעינה וכדאיויות תא; כצפוי, בזמן שמגביר את יעילות טעינה עם עוצמת שדה גובר, את הכדאיות של תאי electroporated יורדת (איור 4 א). ניתן לכמת את שני פרמטרים על ידי הקלטת אחוז טעון וחלוקת תאים לאחר electroporation. assay כדאיות זה בשילוב עם ההדמיה הקרינה גם מאמת את התצפית של מולקולות ביולוגיות הפנימו בתאים חיים ומאפשר תצפית רציפה במשך כמה דורות (איור 4).
לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר ההפנמה של מולקולות דנ"א וחלבון fluorescently שכותרתו לE. coli או S. cerevisiae 26. מולקולות בודדות שכותרתו עם fluorophores האורגני יכולות להיות במעקב עם הרזולוציה spatiotemporal גבוהה ללוחות זמנים בסדר גודל יותר מFPS. לבסוף, שיטה זו תואמת widefield, TIRF וזיהוי confocal, כמו גם תוכניות עירור פעם, כגון ALEX (לסירוגין עירור לייזר 28,29).
יכולים להיות מגוונים פרמטרים רבים במהלך electroporation התא ורכישת נתונים בהתאם למערכת הביולוגית של עניין ואופייה המדויק של הניסוי (ברמת תא או ניתוח מולקולה בודדת). לדוגמא, כאשר electroporating DNA של חיידקים, 0.25-5 pmol של שברי dsDNA כותרת מוביל ליעילות הפנמה נמוכה, המאפשר זיהוי מולקולה בודדת ישיר (כלומר., ללא צורך בphotobleaching לפני כן). מעל 5 pmol dsDNA, תאים נוטים להיות עמוסים במיוחד, משטר מתאים יותר לניתוח תא בודד. כל DNAs שהכותרת צריך להיות גם בעבר על מנת להסיר כל שמץ של צבע חופשי מטוהר ג'ל (לא הגיב fluorophore) מפתרון מניות DNA. חוץ מזה, בעיות פוטנציאליות עם השפלה DNA, במיוחד עבור ניסויי smFRET, ניתן לטפל באמצעות DNAs עם חומצות טבעיות גרעין, או מוטיבים המגנים על termini exonuclease הנגיש כגון לולאות סיכת ראש.
adjustabl נוסףפרמטר דואר בelectroporation הוא עוצמת השדה מיושמת במהלך electroporation. עוצמת שדה נמוכה (~ ק ו 1 / סנטימטר) יוביל ליעילות טעינה נמוכה מתאימה ללימודי מולקולה בודדת. עוצמת שדה גבוהה יותר (עד 1.8 קילו וולט / סנטימטר) תגביר את יעילות הטעינה; עם זאת, יש מתאם הפוך בין עוצמת שדה וכדאיויות תא לאחר electroporation (ראה איור 4). להתייחסות, עוצמת שדה רגילה המשמשת לחיידקים והשמרים electroporation היא ~ 1.5 kV / סנטימטר. קבוע הזמן, המייצג את האורך של הריקבון הזה, הוא פרמטר נוח למעקב, שכן טיפות קבועות הזמן בהקדם כל תופעה קשתית מתרחשת בקובט. תחת הגדרות רגילות, קבוע הזמן צריך להיות גדולה מ 4 ms; ערכים נמוכים עלולים להוביל ליעילות טעינה נמוכה או תאים שניזוקו אף שאינם טעונים. רוב electroporators מציע תארים אחרים של חופש (כמו "חיתוך דופק" או "דופק צורה") אשר יכול להיות שונה כדי לכוון שניטעינת תא כדאיות. אנחנו מוחלים בשיטה זו לשני החיידקים ושמרים, אולם הליכים דומים צריכים גם לאפשר להפנמה של מולקולות ביולוגיות שכותרתו לתוך תאי יונקים באמצעות הגדרות מתאימות electroporator מאז הקרום שלהם הוא למעשה פחות מורכב (bilayer שומנים יחיד) ומאז electroporation כבר נעשה שימוש בתאים כאלה 21.
כאשר הפנמת חלבונים שכותרתו, כל הצבע החופשי צריך להיות מוסר מelectroporation לפני פתרון מניות חלבון שכותרתו. מולקולות צבע חינם, בשל הגודל הקטן שלהם, יכולות להיות מופנמות באופן מועדף על החלבונים של עניין, וקשה להבחין בניתוח נתונים (למרות דיפוזיה מהירה יותר הצפויה שלהם). כמדריך, למדגם בחלבון הנקרא באופן אורגני להיות מתאים לelectroporation, כמות שנותר לצבוע חופשיים צריכה להיות מתחת ל -2% (שזוהה באמצעות סריקת ניאון של SDS-PAGE) 22. תהליך זה הוא חשוב במיוחד,כחלק ממולקולות עלולות להידבק לקרומים החיצוניים של חיידקים או פטריות electroporated. מבחינה זו, מדגם הביקורת השלילי צריך להציג עוצמת הקרינה לכל תא באופן ברור נמוכה מתאי electroporated, באופן אידיאלי נמוכה כמו רמת autofluorescence של תאים ריקים (תאים שלא היה מודגרות עם כל מולקולות ביולוגיות שכותרתו fluorescently ולא electroporated, איור 2).
כמו בdsDNA, יעילות ההפנמה של חלבונים שכותרתו צמודה לסכום של מולקולות ביולוגיות הוסיפו לתאים לפני electroporation. עם זאת, פרמטרים אחרים, כגון גודל ותשלום, לשחק תפקיד בהפנמה. חלבונים קטנים להפגין יעילות הפנמה גבוהה, ואילו חלבונים גדולים יותר (עד 98 KDA) יכול להיות מופנם בהצלחה אבל עם יעילות נמוכה יותר (איור 5) 26. נקודת isolelectric של החלבון, אינטראקציות אפשריות עם קרום התא ופרמטרים physicochemical אחרים גםטעינת תא השפעה במהלך electroporation. כתוצאה מכך, משתמשים צריכים לייעל את הניסויים למערכת משלהם, בידיעה כי ריכוז ראשוני גבוה של חלבון שכותרת (> 50 מיקרומטר) ייתן את הסיכוי הטוב ביותר לטעינה מוצלחת. Electroporation מציע גם כלי חדש להפריע ולנתח פונקציה סלולרית על ידי החדרת חלבונים ומולקולות ביולוגיות אחרות לתאים (שכותרתו או ללא תווית או). ניסויי RNA פולימראז T7 (איור 5 ג) הווה דוגמא כזו של ניסוי שבו אנחנו יכולים להציג את biomolecule שיכול לשנות ביטוי גני in vivo באמצעות electroporation.
בעת ביצוע ניסויי הקרינה מולקולה בודדת, תאורת TIR בדרך כלל העדיפה על פני מצבי תאורה אחרים כפי שהוא מציע יחס אות לרעש הטוב ביותר על ידי fluorophores רק מרגשת בתוך קטע דק מעל פני השטח coverslip (~ 100 ננומטר). עם זאת מולקולות ביולוגי הדמיה שכותרתו לשדר בתוך מיקרואורגניזמים חיים עשויות מחדשמקהלת תאורה עמוקה יותר (עד 0.8 מיקרומטר לE. coli). תאורה עמוקה מושגת במצב חילו, תוך שמירה על יחס אות לרעש גבוה. מצד השני, הדמיה שדה רחבה היא חשובה במיוחד לניתוח photobleaching צעד חכם, שבו המשתמש הוא לאמוד את מספר המולקולות הופנמו על ידי photobleaching תא טעון כל עם כוח גבוה לייזר וחלוקת עוצמת הקרינה סלולארי הראשונית מעוצמת האחידה מיוצרת על ידי מולקולה בודדת (שלב photobleaching בודד, איור 3). ההדמיה Widefield נדרשה גם למעקב מולקולה ארוך טווח על מנת למקם את המולקולות לשדר עניין גם אם המסלולים שלהם לכסות את כל נפח התא.
בפרוטוקול זה, אנו מציגים כיצד electroporation, טכניקה סטנדרטית לביולוגים וביוכימאים לאספקת חומצות גרעין בתאים, מהווה שיטה פשוטה להעברת מולקולות ביולוגי ניאון בסוגי תאים שונים. ההוא רומן, טכניקת תפוקה גבוהה מציעה כלי ייחודי להתבונן מולקולות שכותרתו בסביבה הטבעית שלהם. במולקולות ביולוגיות בנוסף שכותרתו עם fluorophores מכסה מגוון רחב של אורכי גל, electroporation יכול לספק מולקולות שונה עם קבוצות כימיות רבות, כגון נוקלאוטידים וחומצות אמינו לא טבעיים, chelators מתכת, crosslinkers, וקבוצות כולאות. אם המערכת הביולוגית של עניין היא לא חיונית להתפתחות התאים, הגן המקודד לחלבון המטרה יכול להיות גם שנמחק (או דפק למטה), על מנת להבטיח כי החלבונים נצפו לאחר הפנמה כל (או רוב) של בריכת החלבון תאית מייצגים . בעיקרו של דבר, electroporation יכול "השתלה" הגמישות של במבחנה bioconjugates לתאים חיים, ולכן תועלת מאמצים בביולוגיה סינתטית, ביולוגיה של מערכות, ובגילוי מולקולה בודדת vivo.
The authors have nothing to disclose.
We thank Stephan Uphoff for discussions.
R.C. was supported by Linacre College, Oxford University. A.P. was supported by the German Academic Exchange Service (DAAD), the German National Academic Foundation and EPSRC. M.S. was supported by the Wellcome Trust. A.N.K. was supported by a UK BBSRC grant (BB/H01795X/1), and a European Research Council Starter grant (261227).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
ElectroMax DH5-alpha Comptent cells | Invitrogen | 11319-019 | or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast. |
EZ Rich Defined Madia | Teknova | M2105 | low fluorescence rich media |
MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | or any classical electroporator for microorganism transformation |
Certified Molecular Biology agarose | Biorad | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
Microscope coverslips No 1.5 thickness | Menzel | BB024060SC | remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h |
Single-molecule fluorescence microscope | Home-built | described in REFs | |
Localization software | Custom-written, available online | MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. | |
Tracking software | Available online | MATLAB implementation by Blair and Dufresne. |