Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.
The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation.
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiæ, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.
जीवित कोशिकाओं के अंदर अधिकांश प्रतिदीप्ति पढ़ाई ऐसी GFP के एक के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपीएस) के साथ प्रोटीन fusions पर निर्भर करते हैं। इन फ्लोरोसेंट टैग ऐसे जीन की अभिव्यक्ति या झिल्ली परिवहन 2-7 के रूप में प्रक्रियाओं में शामिल प्रोटीन की प्रतिलिपि संख्या, प्रसार पैटर्न या स्थानीयकरण के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं। एफपीएस उच्च लेबलिंग विशिष्टता, आसान कार्यान्वयन की पेशकश, और विभिन्न photophysical और रासायनिक गुणों एक साथ वेरिएंट की एक बड़ी सूची में उपलब्ध हैं। हालांकि, कार्बनिक fluorophores के उनके अधिक से अधिक photostability की वजह से इन विट्रो प्रयोगों के लिए प्रधानमंत्री की पसंद बने हुए हैं (अप करने के लिए एफपीएस से अधिक स्थिर 100 गुना) 8,9, छोटे आकार (ऊपर छोटे एफपीएस की तुलना में मात्रा 100 गुना करने के लिए) और intramolecular लेबलिंग की आसानी (मुख्य रूप से सिस्टीन अवशेषों के उपयोग के माध्यम से)। इन सभी कारकों एकल अणु प्रतिदीप्ति के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं और झल्लाहट 10 अध्ययन करता है।
कई internalization के तरीकों को जोड़तीजैविक लेबलिंग की और इन विवो का पता लगाने में लाभ आईएनजी पिछले एक दशक में शुरू किया गया है; हालांकि, इस तरह के तरीकों अप्राकृतिक अमीनो एसिड 15 के उपयोग की आवश्यकता है, या जैसे (बड़े, एकल झिल्ली कोशिकाओं तक ही सीमित हैं, अपेक्षाकृत बड़े polypeptides टैग (जैसे, टीएमपी, हेलो, या 20 केडीए तस्वीर टैग) 11-14 रोजगार या तो। लोड हो रहा है, सिरिंज लोड हो रहा है, microinjection) 16-19 परिमार्जन।
इस प्रोटोकॉल है कि इन विवो अवलोकन के साथ जोड़ों जैविक fluorophores के फायदे एक उपन्यास, सरल और उच्च throughput internalization विधि का वर्णन है। इस तकनीक को विकसित करने के लिए, हम आमतौर पर इस तरह के ई के रूप में सूक्ष्मजीवों, लोड करने के क्रम में प्लास्मिड डीएनए 20,21 के साथ कोशिकाओं को बदलने के लिए इस्तेमाल किया electroporation प्रक्रिया अनुकूलित कोलाई या एस बवाल में लेबल के biomolecules साथ cerevisiae। प्रोटोकॉल चार सरल चरणों के होते हैं: कोशिकाओं के ऊष्मायन लेबल वाले biomolecules के साथ,इलेक्ट्रोपोरेशन, सेल वसूली, और सेल धोने गैर-भाँति के biomolecules दूर करने के लिए। यहाँ, हम इस electroporation प्रोटोकॉल है, साथ ही सेल आधारित और एकल अणु प्रतिदीप्ति अध्ययन और संकेत झल्लाहट करने के लिए सेल इमेजिंग और डेटा विश्लेषण प्रक्रियाओं प्रस्तुत करते हैं।
Electroporation जैवअणुओं (चित्रा 1) 20,21 कोशिकाओं में प्रवेश कर सकते हैं, जिसके माध्यम से क्षणिक झिल्ली pores के फार्म करने के लिए एक कम ईओण ताकत सेल निलंबन भर में एक उच्च वोल्टेज बिजली के क्षेत्र का निर्वहन पर निर्भर करता है। बस प्लास्मिड डीएनए के साथ बैक्टीरिया के परिवर्तन या खमीर के साथ के रूप में, कोशिकाओं उनके electrocompetency सुनिश्चित करने के लिए electroporation के लिए पहले तैयार किया जाना है। यह प्रक्रिया, पानी के साथ कई धोने कदम से मिलकर, झिल्ली पारगम्यता बढ़ जाती है और electroporation क्युवेट में arcing से बचने के लिए सेल के समाधान के आयनिक ताकत को कम करती है। इस प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं (प्रोटोकॉल देखें: 1.1) से नीचे वर्णित के रूप में तैयार किया जा सकता है या वाणिज्यिक प्रदाता से खरीदाएस।
चित्रा 1: internalization के प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व बाएं से दाएं:। Electrocompetent कोशिकाओं (दोगुना लेबल डीएनए टुकड़े और इस उदाहरण में बैक्टीरिया) की विभाज्य लेबल biomolecules के कुछ microliters जोड़ें; बर्फ पर 1 मिनट के लिए 10 सेते हैं और एक पूर्व ठंडा electroporation क्युवेट के लिए स्थानांतरण; Electroporate और फिर तुरंत बाद कोशिकाओं को 0.5-1 मिलीलीटर अमीर मध्यम जोड़ने; कोशिकाओं को ठीक करने के लिए करते 37 डिग्री सेल्सियस (या जीव द्वारा अपेक्षित तापमान, जैसे, खमीर के लिए 29 डिग्री सेल्सियस) पर सेते हैं; किसी भी अतिरिक्त गैर-भाँति लेबल वाले अणुओं को निकालने के लिए 5 धोने चरणों का प्रदर्शन; पीबीएस बफर और पिपेट एक agarose पैड पर 10 μl के 100-200 μl में अंतिम गोली resuspend; (विस्तृत क्षेत्र मोड या HILO मोड में) एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर एक साफ coverslip और छवि के साथ पैड को कवर किया।
डीएनए internalization (चित्रा 2) सरल है, सावधानियों इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग कर लेबल प्रोटीन internalizing जब उठाए जाने की जरूरत। सबसे पहले, बवाल लेबल प्रोटीन का जायजा नमूना अभी भी मुक्त डाई का एक छोटा सा प्रतिशत शामिल हो सकता है। नि: शुल्क डाई अणु प्रोटीन की तुलना में बहुत छोटे होते हैं और इसलिए अधिमान्यतया भाँति किया जा सकता है। मनाया भाँति फ्लोरोसेंट अणु के विशाल बहुमत के हित के प्रोटीन के अनुरूप है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, प्रारंभिक प्रोटीन नमूना कम 2 ~% से मुक्त डाई (चित्रा 5) 22 को शामिल करना चाहिए। गैर-भाँति लेबल प्रोटीन की अतिरिक्त भी electroporation के बाद बाहरी कोशिका झिल्ली के लिए छड़ी कर सकते हैं; इस घटना प्रोटीन-विशिष्ट है और प्रत्येक नए प्रोटीन के लिए जाँच की जानी चाहिए। हम (: 3.3.3 प्रोटोकोल देखें) भरी हुई सेल नमूना से गैर-भाँति प्रोटीन को हटाने की अनुमति है कि कई विकल्प का प्रस्ताव।
अंत में, कोशिकाओं फॉस्फेट बफर की एक छोटी मात्रा में resuspended कर रहे हैं और एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर उनके इमेजिंग की अनुमति देता है, एक agarose पैड पर pipetted। Agarose पैड पर स्थिरीकरण एक simpl हैई और उनके अखंडता को नुकसान पहुँचाने के बिना एक coverslip पर कोशिकाओं इमेजिंग के कुशल तरीका है। पैड एक कम प्रतिदीप्ति संस्कृति के माध्यम से शामिल करना चाहिए।
सेल इमेजिंग या तो widefield में, कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) या HILO का उपयोग कर (अत्यधिक झुका और टुकड़े टुकड़े में ऑप्टिकल शीट) माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन किया जा सकता है। HILO विन्यास में, लेजर बीम एक बड़ा संकेत करने वाली शोर अनुपात 23, की अनुमति widefield के लिए के रूप में पूरे नमूना रोशन नहीं करता है, अभी तक TIRF में से नमूना में गहरा प्रवेश। इस्तेमाल किया लेजर शक्ति और समय संकल्प पर निर्भर करता है, भली भाँति biomolecules, (चित्रा 3 stepwise-photobleaching विश्लेषण का उपयोग) में गिना स्थानीयकृत, या 24-28 लगाया जा सकता है। Fluorophores के एक झल्लाहट जोड़ी के साथ दोगुना लेबल वाले निर्माणों की internalization एकल कोशिका या एकल अणु के स्तर (चित्रा 6) पर झल्लाहट दोनों की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है।
विभिन्न मापदंडों अलग किया जा सकता हैवांछित उत्पादन और अध्ययन जैविक प्रणाली पर निर्भर करता है। सबसे पहले, सेल प्रति भाँति सामग्री की राशि कोशिकाओं पूर्व इलेक्ट्रोपोरेशन (चित्रा 2) के लिए जोड़ लेबल वाले biomolecules के एकाग्रता बदलकर देखते जा सकता है। Electroporation क्षेत्र ताकत भी लोड हो रहा है दक्षता और सेल व्यवहार्यता दोनों को प्रभावित करती है; उम्मीद के रूप में, बढ़ती क्षेत्र ताकत के साथ लोड हो रहा है क्षमता बढ़ जाती है, जबकि electroporated कोशिकाओं की व्यवहार्यता (चित्रा -4 ए) कम हो जाती है। दोनों मानकों भरी हुई का प्रतिशत रिकॉर्डिंग और electroporation के बाद कोशिकाओं को विभाजित करके मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ मिलकर यह व्यवहार्यता परख भी जीवित कोशिकाओं में भली भाँति biomolecules के अवलोकन की पुष्टि करता है और कई पीढ़ियों (4B चित्रा) से अधिक निरंतर अवलोकन की अनुमति है।
सारांश में, इस प्रोटोकॉल fluorescently लेबल डीएनए और प्रोटीन के अणुओं के internalization में अनुमति देता हैई कोलाई या एस cerevisiae 26। जैविक fluorophores के साथ लेबल व्यक्तिगत अणुओं परिमाण के एक आदेश अब एफपीएस से timescales के लिए उच्च spatiotemporal संकल्प के साथ लगाया जा सकता है। अंत में, इस विधि widefield, TIRF और confocal का पता लगाने, साथ ही इस तरह के एलेक्स (लेजर उत्तेजना 28,29 बारी) के रूप में स्पंदित उत्तेजना योजनाओं के साथ संगत है।
कई मापदंडों सेल electroporation और डाटा अधिग्रहण ब्याज की जैविक प्रणाली और प्रयोग (सेल-स्तर या एकल अणु विश्लेषण) की सटीक प्रकृति पर निर्भर करता है के दौरान अलग किया जा सकता है। बैक्टीरिया में डीएनए electroporating जब उदाहरण के लिए, लेबल dsDNA टुकड़े की 0.25-5 pmol (पहले से photobleaching के लिए आवश्यकता के बिना, अर्थात्।) डायरेक्ट एकल अणु का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, एक कम internalization के दक्षता की ओर जाता है। 5 pmol dsDNA ऊपर, कोशिकाओं भारी एकल कोशिका विश्लेषण के लिए एक व्यवस्था बेहतर अनुकूल, लोड करने के लिए करते हैं। सभी लेबल DNAs भी पहले जेल शुद्ध मुक्त डाई के किसी भी ट्रेस को दूर करने के क्रम में होना चाहिए डीएनए शेयर समाधान से (फ्लोरोफोरे गैर प्रतिक्रिया व्यक्त)। इसके अलावा, विशेष रूप से smFRET प्रयोगों के लिए डीएनए गिरावट के साथ संभावित मुद्दों, अप्राकृतिक न्यूक्लिक एसिड होता है, या इस तरह के बाल के लिये कांटा छोरों के रूप में exonuclease-सुलभ टर्मिनी कि रक्षा रूपांकनों के साथ DNAs का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है।
एक अन्य adjustablelectroporation में ई पैरामीटर electroporation के दौरान लागू क्षेत्र की ताकत है। कम क्षेत्र शक्ति (~ 1 केवी / सेमी) एकल अणु के अध्ययन के लिए उपयुक्त एक कम लोड हो रहा है दक्षता को बढ़ावा मिलेगा। (1.8 केवी / सेमी तक) हायर क्षेत्र ताकत लोड हो रहा है दक्षता में वृद्धि होगी; हालांकि, electroporation के बाद क्षेत्र शक्ति और सेल व्यवहार्यता के बीच एक व्युत्क्रम संबंध है (चित्रा 4 देखें)। संदर्भ के लिए, बैक्टीरिया और खमीर electroporation के लिए प्रयोग किया जाता है एक सामान्य क्षेत्र शक्ति ~ 1.5 केवी / सेमी है। समय लगातार बूंदों के रूप में जल्द ही किसी भी arcing को घटना क्युवेट में होता है के रूप में के बाद से इस क्षय की लंबाई का प्रतिनिधित्व लगातार समय, पालन करने के लिए एक सुविधाजनक पैरामीटर है। सामान्य सेटिंग्स के तहत, समय लगातार 4 एमएस से अधिक होना चाहिए; कम मूल्यों कम लोड हो रहा है दक्षता या यहां तक कि गैर-भरी हुई क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को बढ़ावा मिलेगा। अधिकांश electroporators दोनों धुन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है (जैसे कि "पल्स ट्रंकेशन" या "आकार नाड़ी" के रूप में) स्वतंत्रता के अन्य डिग्री प्रदान करते हैंसेल लोडिंग और व्यवहार्यता। हम फिर भी इसी तरह की प्रक्रियाओं को भी अपने झिल्ली (एकल लिपिड bilayer) वास्तव में कम जटिल है और electroporation के बाद से पहले से ही इस तरह की कोशिकाओं के साथ प्रयोग किया गया है के बाद से उपयुक्त electroporator सेटिंग्स का उपयोग स्तनधारी कोशिकाओं में लेबल वाले biomolecules के internalization के लिए अनुमति चाहिए, दोनों बैक्टीरिया और खमीर के लिए इस पद्धति लागू 21।
लेबल प्रोटीन internalizing करते हैं तो सभी मुक्त डाई लेबल प्रोटीन शेयर समाधान से पहले electroporation से हटा दिया जाना चाहिए। नि: शुल्क डाई अणु, की वजह से उनके छोटे आकार के, ब्याज की प्रोटीन अधिक अधिमान्यतया भाँति, और (उनकी उम्मीद तेजी से प्रसार के बावजूद) डेटा विश्लेषण के दौरान भेदभाव करने के लिए मुश्किल हो जाता है हो सकता है। बवाल लेबल प्रोटीन का एक नमूना के लिए एक गाइड, electroporation के लिए उपयुक्त होने के लिए के रूप में, मुक्त डाई शेष की राशि 2% से नीचे होना चाहिए 22 (एक एसडीएस पृष्ठ के फ्लोरोसेंट स्कैनिंग का उपयोग कर पता चला)। इस प्रक्रिया में, विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैकुछ अणुओं electroporated बैक्टीरिया या खमीर की बाहरी झिल्ली को छड़ी सकता है। इस संबंध में, नकारात्मक नियंत्रण नमूना (किसी fluorescently लेबल के biomolecules के साथ incubated और न ही electroporated नहीं किया गया है, जो कोशिकाओं, चित्रा 2) खाली कोशिकाओं की autofluorescence स्तर के रूप में आदर्श के रूप में कम electroporated कोशिकाओं की तुलना में स्पष्ट रूप से कम सेल प्रति प्रतिदीप्ति तीव्रता, प्रदर्शन करना चाहिए।
DsDNA साथ के रूप में, लेबल प्रोटीन के internalization दक्षता electroporation के लिए पूर्व कोशिकाओं को जोड़ा biomolecules के राशि से जुड़ा हुआ है। हालांकि, इस तरह के आकार और प्रभारी के रूप में अन्य मानकों, internalization में एक भूमिका निभाते हैं। छोटे प्रोटीन बड़ा प्रोटीन जबकि (चित्रा 5) 26 (98 केडीए तक) सफलतापूर्वक भली भाँति किया जा सकता है, लेकिन कम क्षमता के साथ, उच्च internalization क्षमता दिखा रहे हैं। प्रोटीन की isolelectric बिंदु, कोशिका झिल्ली के साथ संभावित बातचीत और भी अन्य भौतिक मापदंडोंelectroporation के दौरान प्रभाव सेल लोड हो रहा है। नतीजतन, उपयोगकर्ताओं लेबल प्रोटीन (> 50 माइक्रोन) के एक उच्च प्रारंभिक एकाग्रता सफल लोड करने के लिए सबसे अच्छा मौका होगा, यह जानकर कि उनकी स्वयं की व्यवस्था के लिए प्रयोगों का अनुकूलन करने की जरूरत है। Electroporation भी उपद्रव और कोशिकाओं (या तो लेबल या लेबल हटाया गया) में प्रोटीन और अन्य biomolecules शुरू करने से सेलुलर समारोह का विश्लेषण करने के लिए एक नए उपकरण प्रदान करता है। वर्तमान T7 शाही सेना पोलीमरेज़ प्रयोगों (चित्रा 5C) हम electroporation का उपयोग vivo में जीन की अभिव्यक्ति को बदल सकते हैं कि एक बायोमोलिक्यूल लागू कर सकते हैं, जहां एक प्रयोग के ऐसे एक उदाहरण है।
एकल अणु प्रतिदीप्ति प्रयोगों प्रदर्शन जब यह coverslip सतह (~ 100 एनएम) के ऊपर एक पतली धारा के भीतर रोमांचक केवल fluorophores के द्वारा सबसे अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात प्रदान करता है, के रूप में TIR रोशनी आमतौर पर अन्य रोशनी मोड पर इष्ट है। हालांकि रहने वाले सूक्ष्मजीवों के अंदर diffusing इमेजिंग में लेबल के biomolecules फिर से हो सकता हैगायकगण गहरी रोशनी (अप कोलाई के लिए 0.8 माइक्रोन के लिए)। एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात जबकि संरक्षण और गहरा रोशनी, Hilo मोड में हासिल की है। दूसरी ओर, व्यापक क्षेत्र इमेजिंग उपयोगकर्ता उच्च शक्ति लेजर के साथ एक पूरी भरी हुई सेल photobleaching और उत्पादन एकात्मक तीव्रता से प्रारंभिक सेल प्रतिदीप्ति तीव्रता विभाजित करके भाँति अणुओं की संख्या का आकलन किया जाता है, जहां कदम-वार photobleaching के विश्लेषण के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है एक अणु (एकल photobleaching से कदम, चित्रा 3) से। उनके trajectories के पूरे सेल की मात्रा को कवर किया है, भले ही widefield इमेजिंग भी ब्याज की diffusing अणुओं स्थानीयकरण के क्रम में लंबी अवधि के अणु नज़र रखने के लिए आवश्यक है।
इस प्रोटोकॉल में, हम electroporation, कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड पहुंचाने के लिए जीव और जीव रसायन के लिए एक मानक तकनीक, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट जैवअणुओं देने के लिए एक सरल विधि का गठन कैसे प्रस्तुत करते हैं। गुउपन्यास, उच्च throughput तकनीक उनके पैतृक वातावरण में लेबल के अणुओं का निरीक्षण करने के लिए एक अनूठा उपकरण प्रदान करता है। Fluorophores के तरंग दैर्ध्य की एक विस्तृत रेंज को कवर के साथ लेबल अलावा biomolecules में, इस तरह के अप्राकृतिक न्यूक्लियोटाइड और अमीनो एसिड, धातु chelators, crosslinkers, और caging समूहों के रूप में कई रासायनिक समूहों के साथ संशोधित अणुओं वितरित कर सकते हैं इलेक्ट्रोपोरेशन। ब्याज की जैविक प्रणाली सेल के विकास के लिए आवश्यक नहीं है, तो internalization के बाद मनाया प्रोटीन के intracellular प्रोटीन पूल के सभी (या सबसे) का प्रतिनिधित्व करते हैं, यह सुनिश्चित करने का लक्ष्य है प्रोटीन के लिए जीन एन्कोडिंग भी नष्ट किया जा सकता है (या खटखटाया-डाउन) । संक्षेप में, electroporation के "प्रत्यारोपण" जीवित कोशिकाओं में इन विट्रो bioconjugates के लचीलेपन और इसलिए सिंथेटिक जीव विज्ञान, सिस्टम जीव विज्ञान में प्रयास, और इन विवो एकल अणु का पता लगाने में फायदा हो सकता है।
The authors have nothing to disclose.
We thank Stephan Uphoff for discussions.
R.C. was supported by Linacre College, Oxford University. A.P. was supported by the German Academic Exchange Service (DAAD), the German National Academic Foundation and EPSRC. M.S. was supported by the Wellcome Trust. A.N.K. was supported by a UK BBSRC grant (BB/H01795X/1), and a European Research Council Starter grant (261227).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
ElectroMax DH5-alpha Comptent cells | Invitrogen | 11319-019 | or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast. |
EZ Rich Defined Madia | Teknova | M2105 | low fluorescence rich media |
MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | or any classical electroporator for microorganism transformation |
Certified Molecular Biology agarose | Biorad | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
Microscope coverslips No 1.5 thickness | Menzel | BB024060SC | remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h |
Single-molecule fluorescence microscope | Home-built | described in REFs | |
Localization software | Custom-written, available online | MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. | |
Tracking software | Available online | MATLAB implementation by Blair and Dufresne. |