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Biology

Electroporation के माध्यम से रहने का सूक्ष्मजीवों में internalization और फ्लोरोसेंट biomolecules का अवलोकन

Published: February 8, 2015 doi: 10.3791/52208
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Clarendon Laboratory, Department of Physics, University of Oxford, 2Wellcome Trust Sanger Institute, Genome Center

Introduction

जीवित कोशिकाओं के अंदर अधिकांश प्रतिदीप्ति पढ़ाई ऐसी GFP के एक के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपीएस) के साथ प्रोटीन fusions पर निर्भर करते हैं। इन फ्लोरोसेंट टैग ऐसे जीन की अभिव्यक्ति या झिल्ली परिवहन 2-7 के रूप में प्रक्रियाओं में शामिल प्रोटीन की प्रतिलिपि संख्या, प्रसार पैटर्न या स्थानीयकरण के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं। एफपीएस उच्च लेबलिंग विशिष्टता, आसान कार्यान्वयन की पेशकश, और विभिन्न photophysical और रासायनिक गुणों एक साथ वेरिएंट की एक बड़ी सूची में उपलब्ध हैं। हालांकि, कार्बनिक fluorophores के उनके अधिक से अधिक photostability की वजह से इन विट्रो प्रयोगों के लिए प्रधानमंत्री की पसंद बने हुए हैं (अप करने के लिए एफपीएस से अधिक स्थिर 100 गुना) 8,9, छोटे आकार (ऊपर छोटे एफपीएस की तुलना में मात्रा 100 गुना करने के लिए) और intramolecular लेबलिंग की आसानी (मुख्य रूप से सिस्टीन अवशेषों के उपयोग के माध्यम से)। इन सभी कारकों एकल अणु प्रतिदीप्ति के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं और झल्लाहट 10 अध्ययन करता है।

कई internalization के तरीकों को जोड़तीजैविक लेबलिंग की और इन विवो का पता लगाने में लाभ आईएनजी पिछले एक दशक में शुरू किया गया है; हालांकि, इस तरह के तरीकों अप्राकृतिक अमीनो एसिड 15 के उपयोग की आवश्यकता है, या जैसे (बड़े, एकल झिल्ली कोशिकाओं तक ही सीमित हैं, अपेक्षाकृत बड़े polypeptides टैग (जैसे, टीएमपी, हेलो, या 20 केडीए तस्वीर टैग) 11-14 रोजगार या तो। लोड हो रहा है, सिरिंज लोड हो रहा है, microinjection) 16-19 परिमार्जन।

इस प्रोटोकॉल है कि इन विवो अवलोकन के साथ जोड़ों जैविक fluorophores के फायदे एक उपन्यास, सरल और उच्च throughput internalization विधि का वर्णन है। इस तकनीक को विकसित करने के लिए, हम आमतौर पर इस तरह के ई के रूप में सूक्ष्मजीवों, लोड करने के क्रम में प्लास्मिड डीएनए 20,21 के साथ कोशिकाओं को बदलने के लिए इस्तेमाल किया electroporation प्रक्रिया अनुकूलित कोलाई या एस बवाल में लेबल के biomolecules साथ cerevisiae। प्रोटोकॉल चार सरल चरणों के होते हैं: कोशिकाओं के ऊष्मायन लेबल वाले biomolecules के साथ,इलेक्ट्रोपोरेशन, सेल वसूली, और सेल धोने गैर-भाँति के biomolecules दूर करने के लिए। यहाँ, हम इस electroporation प्रोटोकॉल है, साथ ही सेल आधारित और एकल अणु प्रतिदीप्ति अध्ययन और संकेत झल्लाहट करने के लिए सेल इमेजिंग और डेटा विश्लेषण प्रक्रियाओं प्रस्तुत करते हैं।

Electroporation जैवअणुओं (चित्रा 1) 20,21 कोशिकाओं में प्रवेश कर सकते हैं, जिसके माध्यम से क्षणिक झिल्ली pores के फार्म करने के लिए एक कम ईओण ताकत सेल निलंबन भर में एक उच्च वोल्टेज बिजली के क्षेत्र का निर्वहन पर निर्भर करता है। बस प्लास्मिड डीएनए के साथ बैक्टीरिया के परिवर्तन या खमीर के साथ के रूप में, कोशिकाओं उनके electrocompetency सुनिश्चित करने के लिए electroporation के लिए पहले तैयार किया जाना है। यह प्रक्रिया, पानी के साथ कई धोने कदम से मिलकर, झिल्ली पारगम्यता बढ़ जाती है और electroporation क्युवेट में arcing से बचने के लिए सेल के समाधान के आयनिक ताकत को कम करती है। इस प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं (प्रोटोकॉल देखें: 1.1) से नीचे वर्णित के रूप में तैयार किया जा सकता है या वाणिज्यिक प्रदाता से खरीदाएस।

चित्र 1
चित्रा 1: internalization के प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व बाएं से दाएं:। Electrocompetent कोशिकाओं (दोगुना लेबल डीएनए टुकड़े और इस उदाहरण में बैक्टीरिया) की विभाज्य लेबल biomolecules के कुछ microliters जोड़ें; बर्फ पर 1 मिनट के लिए 10 सेते हैं और एक पूर्व ठंडा electroporation क्युवेट के लिए स्थानांतरण; Electroporate और फिर तुरंत बाद कोशिकाओं को 0.5-1 मिलीलीटर अमीर मध्यम जोड़ने; कोशिकाओं को ठीक करने के लिए करते 37 डिग्री सेल्सियस (या जीव द्वारा अपेक्षित तापमान, जैसे, खमीर के लिए 29 डिग्री सेल्सियस) पर सेते हैं; किसी भी अतिरिक्त गैर-भाँति लेबल वाले अणुओं को निकालने के लिए 5 धोने चरणों का प्रदर्शन; पीबीएस बफर और पिपेट एक agarose पैड पर 10 μl के 100-200 μl में अंतिम गोली resuspend; (विस्तृत क्षेत्र मोड या HILO मोड में) एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर एक साफ coverslip और छवि के साथ पैड को कवर किया।

(चित्रा 1) की अनुमति के एक अमीर माध्यम में incubated हैं। गैर-भाँति लेबल वाले biomolecules के अतिरिक्त पहली नमक के एक काफी उच्च एकाग्रता और कुछ डिटर्जेंट युक्त बफर में धोने से निकाल दिया जाता है (: 3.3 प्रोटोकोल देखें)। नमक की उपस्थिति अन्यथा बाहरी झिल्ली पर छड़ी सकता है, जो गैर-भाँति में लेबल के biomolecules द्वारा गठित गैर विशिष्ट electrostatic बातचीत बाधित। इसी तरह, वाशिंग बफर में डिटर्जेंट की मौजूदगी गैर विशिष्ट हाइड्रोफोबिक बातचीत बाधित।

डीएनए internalization (चित्रा 2) सरल है, सावधानियों इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग कर लेबल प्रोटीन internalizing जब उठाए जाने की जरूरत। सबसे पहले, बवाल लेबल प्रोटीन का जायजा नमूना अभी भी मुक्त डाई का एक छोटा सा प्रतिशत शामिल हो सकता है। नि: शुल्क डाई अणु प्रोटीन की तुलना में बहुत छोटे होते हैं और इसलिए अधिमान्यतया भाँति किया जा सकता है। मनाया भाँति फ्लोरोसेंट अणु के विशाल बहुमत के हित के प्रोटीन के अनुरूप है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, प्रारंभिक प्रोटीन नमूना कम 2 ~% से मुक्त डाई (चित्रा 5) 22 को शामिल करना चाहिए। गैर-भाँति लेबल प्रोटीन की अतिरिक्त भी electroporation के बाद बाहरी कोशिका झिल्ली के लिए छड़ी कर सकते हैं; इस घटना प्रोटीन-विशिष्ट है और प्रत्येक नए प्रोटीन के लिए जाँच की जानी चाहिए। हम (: 3.3.3 प्रोटोकोल देखें) भरी हुई सेल नमूना से गैर-भाँति प्रोटीन को हटाने की अनुमति है कि कई विकल्प का प्रस्ताव।

अंत में, कोशिकाओं फॉस्फेट बफर की एक छोटी मात्रा में resuspended कर रहे हैं और एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर उनके इमेजिंग की अनुमति देता है, एक agarose पैड पर pipetted। Agarose पैड पर स्थिरीकरण एक simpl हैई और उनके अखंडता को नुकसान पहुँचाने के बिना एक coverslip पर कोशिकाओं इमेजिंग के कुशल तरीका है। पैड एक कम प्रतिदीप्ति संस्कृति के माध्यम से शामिल करना चाहिए।

सेल इमेजिंग या तो widefield में, कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) या HILO का उपयोग कर (अत्यधिक झुका और टुकड़े टुकड़े में ऑप्टिकल शीट) माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन किया जा सकता है। HILO विन्यास में, लेजर बीम एक बड़ा संकेत करने वाली शोर अनुपात 23, की अनुमति widefield के लिए के रूप में पूरे नमूना रोशन नहीं करता है, अभी तक TIRF में से नमूना में गहरा प्रवेश। इस्तेमाल किया लेजर शक्ति और समय संकल्प पर निर्भर करता है, भली भाँति biomolecules, (चित्रा 3 stepwise-photobleaching विश्लेषण का उपयोग) में गिना स्थानीयकृत, या 24-28 लगाया जा सकता है। Fluorophores के एक झल्लाहट जोड़ी के साथ दोगुना लेबल वाले निर्माणों की internalization एकल कोशिका या एकल अणु के स्तर (चित्रा 6) पर झल्लाहट दोनों की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है।

विभिन्न मापदंडों अलग किया जा सकता हैवांछित उत्पादन और अध्ययन जैविक प्रणाली पर निर्भर करता है। सबसे पहले, सेल प्रति भाँति सामग्री की राशि कोशिकाओं पूर्व इलेक्ट्रोपोरेशन (चित्रा 2) के लिए जोड़ लेबल वाले biomolecules के एकाग्रता बदलकर देखते जा सकता है। Electroporation क्षेत्र ताकत भी लोड हो रहा है दक्षता और सेल व्यवहार्यता दोनों को प्रभावित करती है; उम्मीद के रूप में, बढ़ती क्षेत्र ताकत के साथ लोड हो रहा है क्षमता बढ़ जाती है, जबकि electroporated कोशिकाओं की व्यवहार्यता (चित्रा -4 ए) कम हो जाती है। दोनों मानकों भरी हुई का प्रतिशत रिकॉर्डिंग और electroporation के बाद कोशिकाओं को विभाजित करके मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ मिलकर यह व्यवहार्यता परख भी जीवित कोशिकाओं में भली भाँति biomolecules के अवलोकन की पुष्टि करता है और कई पीढ़ियों (4B चित्रा) से अधिक निरंतर अवलोकन की अनुमति है।

सारांश में, इस प्रोटोकॉल fluorescently लेबल डीएनए और प्रोटीन के अणुओं के internalization में अनुमति देता हैई कोलाई या एस cerevisiae 26। जैविक fluorophores के साथ लेबल व्यक्तिगत अणुओं परिमाण के एक आदेश अब एफपीएस से timescales के लिए उच्च spatiotemporal संकल्प के साथ लगाया जा सकता है। अंत में, इस विधि widefield, TIRF और confocal का पता लगाने, साथ ही इस तरह के एलेक्स (लेजर उत्तेजना 28,29 बारी) के रूप में स्पंदित उत्तेजना योजनाओं के साथ संगत है।

Protocol

1. सेल तैयारी

  1. प्रयोगशाला बनाया electrocompetent बैक्टीरिया की तैयारी
    1. मध्यम परिभाषित ऐसे M9 या ईज़ी अमीर के रूप में एक कम प्रतिदीप्ति माध्यम में ब्याज की कोलाई तनाव का एक ही कॉलोनी से एक 5-10 मिलीलीटर रातोंरात preculture तैयार करें।
    2. सुबह में, 600 आयुध डिपो 0.02 पर शुरू होता है एनएम कि इस तरह रातोंरात preculture के साथ एक नया 400 मिलीलीटर संस्कृति टीका लगाना। 1 एम MgSO 4 के 2.5 मिलीग्राम और 1 एम 2 MgCl के 2.5 मिलीलीटर मध्यम कम प्रतिदीप्ति 400 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस से बढ़ने और 0.4-0.6 पहुंचता है एनएम आयुध डिपो 600 तक 250 आरपीएम।
    4. 10-15 मिनट के लिए एक आइस-पानी के स्नान में संस्कृति द्रुतशीतन द्वारा वृद्धि को रोकने के।
      अब से, (बर्फ पर) 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी चरणों के लिए बाहर ले: ध्यान दें।
    5. जी एक्स 1000 में संस्कृति 15 मिनट अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और एच 2 ओ आसुत ठंडा और बाँझ 250 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend
    6. Centrifugation के दोहराएँ और मेजबान टी कदमोंwice, तो 50 मिलीलीटर 100 मिलीलीटर पानी की मात्रा कम और।
    7. जी एक्स 1000 में संस्कृति 10 मिनट अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 25 मिलीलीटर ठंडा और बाँझ आसुत एच 2 ओ + 10% ग्लिसरॉल में सेल गोली resuspend।
    8. Centrifugation के दोहराएँ और मेजबान 10 मिलीलीटर, 5 मिलीलीटर, और अंत में करने के लिए 500 μl 10% ग्लिसरॉल समाधान की मात्रा कम है, तीन बार दोहराएँ।
    9. -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में 20 μl प्रत्येक, फ्लैश फ्रीज की aliquots में कोशिकाओं विभाज्य।
  2. वाणिज्यिक electrocompetent बैक्टीरियल कोशिकाओं
    1. एक वाणिज्यिक सेल विभाज्य एक पतला: एक बाँझ ठंडा आसुत जल के साथ। -80 डिग्री सेल्सियस पर 20 μl aliquots और दुकान बनाओ।
  3. Electrocompetent खमीर की तैयारी
    नोट: Electrocompetent एस cerevisiae कोशिकाओं प्रत्येक electroporation के प्रयोग से पहले तैयार कर रहे हैं और ई के लिए के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित नहीं किया जा सकता कोलाई।
    1. प्रारंभ करने के लिए, 5 टीका लगानाब्याज के वांछित तनाव का एक ही कॉलोनी के साथ शून्य मिलीलीटर YPD मध्यम।
    2. 30 डिग्री सेल्सियस और 0.6-0.8 पहुंचता है एनएम आयुध डिपो 600 तक 250 rpm पर सेते हैं।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1000 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं।
    4. एच 2 ओ आसुत ठंडा और बाँझ 25 एमएल में गोली Resuspend
    5. दो बार में 25 मिलीलीटर पानी resuspending और 1 एम पर सोर्बिटोल का एक ठंडा समाधान के 2 मिलीलीटर में दो बार resuspending धोने चरणों को दोहराएँ
    6. 1 एम सोर्बिटोल के 250 μl में कोशिकाओं Resuspend और 50 μl aliquots में कोशिकाओं को विभाजित।

2. Agarose पैड तैयारी

  1. पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट कणों को निकालने के लिए एक घंटे के लिए 500 डिग्री सेल्सियस पर एक भट्ठी में एक coverslip जला। Coverslips के एल्यूमीनियम पन्नी में शामिल कमरे के तापमान पर सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है "स्वच्छ जल"।
    नोट: इस तरह के प्लाज्मा सफाई या पिरान्हा समाधान के रूप में अन्य सामान्य सफाई तरीकों पृष्ठभूमि के रूप में लंबे समय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैसाफ स्लाइड के प्रतिदीप्ति अर्ध अशक्त बना हुआ है।
  2. एक माइक्रोवेव ओवन एक 2% agarose के पिघलने से एक कम प्रतिदीप्ति agarose समाधान तैयार - आसुत पानी के घोल (70 डिग्री सेल्सियस)। इसके तत्काल बाद 2X कम प्रतिदीप्ति संस्कृति के माध्यम से 500 μl को स्पष्ट 2% agarose समाधान के 500 μl जोड़ने और धीरे मिश्रण।
  3. यह नीचे और कठोर ठंडा करने से पहले, तुरंत इस agarose पिपेट - एक खुर्दबीन coverslip (कोई 1.5 मोटाई) पर मध्यम समाधान लगभग 2 सेमी व्यास और कुछ मिलीमीटर ऊंचाई के एक पैड फार्म के क्रम में। बुलबुले से बचने और यदि आवश्यक हो तो एक पिपेट सुझावों के साथ उन्हें पॉप।
  4. एक दूसरा "जला" coverslip के साथ पैड समतल (कोई 1.5 मोटाई, चित्रा 1 देखें)।
    नोट: यह ऊपरी coverslip के एक फ्लैट सजातीय पैड फार्म और कोशिकाओं से तैयार किया जा रहा है, जबकि धूल और सूखने से बचाने में मदद करता। ऐसे M9 या ऐसे ईज़ी रिच परिभाषित माध्यम के रूप में अमीर माध्यम के रूप में कम से कम मध्यम उनके कम प्रतिदीप्ति के लिए परीक्षण किया गया है।

3. Electroporatआयन

  1. ऊष्मायन
    1. सक्षम कोशिकाओं (20 μl बैक्टीरिया या 50 μl खमीर) की एक भी विभाज्य करने के लिए एक कम नमक बफर (<50 मिमी नमक) में संग्रहीत लेबल वाले अणुओं के 5 μl को जोड़ें और बर्फ पर 10 मिनट सेते हैं।
      नोट: शेयर समाधान में fluorescently लेबल अणुओं की एकाग्रता और इस तरह इलेक्ट्रोपोरेशन करने से पहले सीधे लोड हो रहा है दक्षता के साथ जोड़ा जाता है सेल करने के लिए जोड़ा लेबल वाले अणुओं की राशि (चित्रा 3, और चर्चा)। कुछ प्रोटीन कम नमक शर्त के साथ कम संगत कर रहे हैं के रूप में, भंडारण बफर में नमक एकाग्रता में वृद्धि की जा सकती है, लेकिन कोशिकाओं पूर्व electroporation के लिए जोड़ा लेबल वाले अणुओं की मात्रा तो कम किया जाना चाहिए।
    2. (क्रमशः, बैक्टीरिया और खमीर के लिए 0.1 और 0.2 सेमी अंतर) एक पूर्व ठंडा electroporation क्युवेट में कोशिकाओं और लेबल biomolecules के मिश्रण स्थानांतरण। धीरे समाधान से किसी भी संभावित बुलबुले को दूर करने के लिए बेंच पर क्युवेट नल।
    3. घन जगहelectroporator में Vette और समाधान करने के लिए एक उच्च वोल्टेज बिजली पल्स लागू (0.9-1.8 केवी / सेमी, वोल्टेज को चुनने के बारे में अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें)। इस तरह की एक नाड़ी में लेबल के biomolecules कोशिकाओं में फैलाना करने की इजाजत दी कोशिका झिल्ली में क्षणिक pores के रूपों।
    4. Electroporator पर प्रदर्शित समय लगातार 4 से 6 एमएस के बीच है कि जाँच करें। लोअर समय स्थिरांक अक्सर बहुत अधिक नमक एकाग्रता और / या क्युवेट में बुलबुले की उपस्थिति के कारण कर रहे हैं, और बहुत कम या कोशिकाओं का कोई लोड हो रहा है को बढ़ावा मिलेगा।
  2. वसूली
    1. इसके तत्काल बाद electroporation के बाद, इस तरह के समाज, ईज़ी रिच परिभाषित मध्यम, YPD या कोशिकाओं के लिए किसी भी अमीर माध्यम के रूप में अमीर माध्यम के 500 μl जोड़ें।
    2. बैक्टीरिया के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूना है और 2 से 10 मिनट के लिए खमीर के लिए 29 डिग्री सेल्सियस सेते हैं। उपयोगकर्ता बढ़ रही है और electroporation के बाद विभाजित कोशिकाओं के प्रतिशत का मूल्यांकन करना चाहता है जहां व्यवहार्यता माप के लिए, w के रूप में एक लंबे समय तक वसूली समय (1 घंटे के लिए) का उपयोगई पहली कोशिका विभाजन से पहले इस तरह के अंतराल टाइम्स निरीक्षण करते हैं।
  3. धोने कदम
    1. 3300 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक मिनट के लिए कोशिकाओं नीचे कताई द्वारा किसी भी गैर-भाँति के biomolecules दूर करने के लिए कोशिकाओं को धो लें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 500 μl पीबीएस में कोशिकाओं resuspend।
      नोट: प्रत्येक नमूना के लिए, लेबल biomolecules के एक ही राशि के साथ incubated लेकिन electroporated और मुख्य नमूने के रूप में ठीक उसी तरह से नहीं धोया कोशिकाओं का एक नकारात्मक नियंत्रण तैयार करते हैं।
    2. पिछले चरणों तीन बार दोहराएँ।
    3. प्रोटीन internalization के मामले में, ब्याज की लेबल प्रोटीन के गुणों और व्यवहार के आधार पर कपड़े धोने की प्रक्रिया का अनुकूलन। निम्नलिखित चरणों संभव अनुकूलन के उदाहरण हैं:
      1. <, पीबीएस बाहरी कोशिका झिल्ली 22 से चिपके रहते हैं हो सकता है, जो गैर-भाँति प्रोटीन को हटाने के लिए 100 मिमी NaCl और 0.005% ट्राइटन X100 युक्त का उपयोग करते हुए पहले 3 धोने चक्र सम्पन्नसमर्थन> 26।
        1. फिल्टर में electroporated कोशिकाओं pipetting द्वारा एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के अंदर फिट 0.22 माइक्रोन ताकना व्यास फिल्टर के साथ electroporated कोशिकाओं फ़िल्टर। 800 XG पर 3 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए नीचे स्पिन। प्रवाह के माध्यम से त्यागें। कोशिकाओं पर 500 μl नई पीबीएस जोड़ें और पहले की तरह एक बार फिर से उन्हें स्पिन और 22 एक बार इन चरणों को दोहराएँ।
      2. किसी भी गैर-भाँति प्रोटीन के पाचन अनुमति देने के लिए पहली बार धोने चक्र के दौरान प्रोटीज कश्मीर की एक छोटी राशि (500 μl पीबीएस में 10 एनजी) जोड़ें।
    4. 3300 XG पर 1 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए कोशिकाओं नीचे स्पिन। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पीबीएस के 150 μl में कोशिकाओं resuspend।
    5. ऊपरी coverslip के हटाने और छोटी बूंद से सेल निलंबन छोटी बूंद के 10 μl के प्रसार के द्वारा agarose पैड पर लोड सेल समाधान बिखरा हुआ है। एक अप्रयुक्त स्वच्छ जल coverslip (कोई 1.5 मोटाई, खुर्दबीन उद्देश्य विनिर्देश मिलान) टी पर बदलेंबहुत धीरे स्लाइड पर पैड और प्रेस की वह शीर्ष।
    6. विभिन्न नमूनों इमेजिंग जबकि एक अपारदर्शी बॉक्स में पैड भंडारण के द्वारा प्रकाश से electroporated कोशिकाओं की रक्षा।

4. माइक्रोस्कोप डाटा अधिग्रहण

नोट: रहने वाले सूक्ष्मजीवों में एकल सेल और एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी कोई भी उचित प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर प्रदर्शन किया जा सकता है (कस्टम निर्मित या वाणिज्यिक)।

  1. सेटिंग्स
    1. Widefield या HILO रोशनी
      1. किसी भी TIRF / एकल अणु खुर्दबीन के साथ छवि नमूने हैं।
        नोट: एक उदाहरण के रूप में, हम एक TIRF सेट अप के साथ प्रयोगशाला में एक स्वनिर्धारित उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। एक 532 एनएम और एक 637 एनएम डायोड लेजर से मुस्कराते हुए संयुक्त और उद्देश्य के पीछे फोकल हवाई जहाज़ पर ध्यान केंद्रित करने से पहले collimated कर रहे हैं। नमूना से प्रतिदीप्ति एक लंबे समय से गुजारें और एक पायदान फिल्टर का उपयोग कर उत्तेजना प्रकाश से अलग, एक ही उद्देश्य के माध्यम से एकत्र, और फिर में विभाजित हैएक dichroic दर्पण का उपयोग कर विकास और हरे चैनल। दो चैनलों एक इलेक्ट्रॉन गुणा आरोप युग्मित डिवाइस (ईएम सीसीडी) कैमरा के चिप के अलग हिस्सों पर imaged हैं। वीडियो गतिज मोड का उपयोग कर दर्ज कर रहे हैं। व्हाइट प्रकाश छवियों को एक सफेद रोशनी दीपक और एक रोशनी स्रोत के रूप में माइक्रोस्कोप से जुड़ी एक कंडेनसर का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं।
      2. सामान्य एकल अणु अवलोकन के लिए, TIRF या HILO 23 माइक्रोस्कोप की रोशनी मोड (HILO इमेजिंग बनाम TIRF के बारे में अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें) निर्धारित किया है। बल्कि coverslip के साथ संपर्क में इसकी कम झिल्ली से आंतरिक सेल, 4.5.4 देखने के लिए एक TIRF माइक्रोस्कोप पर एक HILO मोड सेट करने के लिए, coverslip सतह की तुलना में थोड़ा अधिक ध्यान केंद्रित (छवि शिफ्ट करने के लिए थोड़ा उत्तेजना प्रकाश की घटना के कोण में कमी )।
      3. सेल-स्तर विश्लेषण के लिए, लंबे समय से एकल अणु प्रयोगों या कदम वार photobleaching के विश्लेषण ट्रैकिंग, एक widefield मोड ensuri करने के लिए माइक्रोस्कोप की रोशनी मोड सेटपूरे सेल मात्रा के निरंतर अवलोकन एनजी और इसलिए सभी भली भाँति लेबल वाले अणुओं की।
    2. आमतौर पर, 0.5-3 मेगावाट के आसपास उपयोग उत्तेजना शक्तियों (~ 50-400 डब्ल्यू / 2 सेमी)।
      नोट: निचले लेजर शक्तियों लंबे समय रहते प्रतिदीप्ति अवलोकन और उच्च लेजर शक्तियों उच्च spatiotemporal संकल्प या stepwise photobleaching के विश्लेषण के लिए आवश्यक हो सकता है, जबकि मिनट (1) के ऊपर नज़र रखने के लक्ष्य को हासिल करने के लिए उपयोगी होते हैं।
    3. 15 एमएस से अधिक सामान्य अवलोकन और तीव्रता मात्रा का ठहराव के लिए 100 एमएस करने के प्रयोगों पर नज़र रखने के लिए लेकर जोखिम बार प्रयोग करें। नोट: अन्य फ्रेम दर और मोड विशेष रूप से तेजी diffusing प्रजातियों 30 के अध्ययन के लिए, stroboscopic रोशनी के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    4. TIRF माइक्रोस्कोप में, ~ 100 एनएम / पिक्सेल के एक पिक्सेल लंबाई में जिसके परिणामस्वरूप एक बढ़ाई पर एक इलेक्ट्रॉन गुणा सीसीडी (EMCCD) कैमरे पर प्रतिदीप्ति चैनल रिकॉर्ड है। TIRF सेटअप संदर्भ 26 में अधिक से अधिक जानकारी में वर्णन है।
  2. आंकड़ा अधिग्रहण
    1. बंद स्विच या प्रयोग के शुरू तक लेजर रोशनी ब्लॉक। कारण overexposure के लिए कैमरे को नुकसान को रोकने के लिए रवाना EMCCD कैमरे लाभ स्विच।
    2. उद्देश्य के लिए करीब सेल लाने के क्रम में, उल्टा खुर्दबीन मंच पर, नीचे की ओर का सामना करना पड़ सेल से ढके पक्ष के साथ agarose पैड सैंडविच रखें। प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी मोड 28 में कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित किया। सेल का पता लगाने के क्रम में सफेद प्रकाश इमेजिंग के तहत देखने की प्रत्येक कोशिका की एक छवि रिकॉर्ड सफेद रोशनी बंद स्विच करने से पहले की रूपरेखा।
    3. प्रयोगशाला परिवेश प्रकाश से नमूना सुरक्षित रखें।
    4. HILO उत्तेजना मोड के लिए, coverslip सतह के करीब नमूने की केवल खंड रोशन द्वारा प्रत्येक अधिकतम संकेत करने वाली शोर अनुपात करने के लिए उत्तेजना बीम के कोण समायोजित करें।
      1. HILO रोशनी को प्राप्त करने के लिए, एक 100x 1.4 एनए उद्देश्य 28 (उच्च nume के पीछे फोकल हवाई जहाज़ में लेजर बीम ध्यान केंद्रितइस तरह 1.45 या 1.49 के रूप में RICAL छिद्र) भी उपयुक्त हैं। बीम एक कोण के साथ उद्देश्य से बाहर निकालता है तो यह है कि किरण को सीधा ध्यान केंद्रित लेंस स्थानांतरण द्वारा, ध्यान उद्देश्य केंद्र से अलग ले जाता है।
      2. कोशिकी पृष्ठभूमि संकेत बनाम संकेत करने वाली शोर अनुपात, इंट्रासेल्युलर प्रतिदीप्ति तीव्रता अधिकतम करने के लिए लेंस स्थिति को समायोजित करें।
    5. कैमरा लाभ स्विच और लेजर पर स्विच करने से पहले डाटा अधिग्रहण शुरू करते हैं।
    6. डेटा रिकॉर्डिंग है, जबकि पहले या प्रतिदीप्ति डेटा रिकॉर्डिंग के बाद प्रत्येक FOV के एक सफेद प्रकाश छवि अधिग्रहण; इस प्रतिदीप्ति चैनलों में सेल की सीमाओं की पहचान करने में मदद करता है।
    7. व्यवहार्यता के आकलन के लिए
      1. कोशिकाओं electroporation के बाद विकसित करने के लिए अनुमति देने के लिए agarose पैड में एक कम प्रतिदीप्ति अमीर मध्यम का प्रयोग करें।
      2. अध्ययन सूक्ष्मजीव (37 डिग्री सेल्सियस ई कोलाई के लिए, 29 डिग्री सेल्सियस एस cerevisiae के लिए के लिए अधिकतम तापमान के लिए माइक्रोस्कोप संतुलित करना) एक उद्देश्य हीटर प्रणाली के साथ।
      3. रिकॉर्ड दोनों सफेद प्रकाश और प्रतिदीप्ति छवियों हर 30 मिनट, पूरे डेटा रिकॉर्डिंग के दौरान देखने का वास्तव में एक ही मैदान पर बने रहने के लिए सुनिश्चित कर रही है। कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए शुरू करने से पहले ≈1 घंटे के अंतराल में आम तौर पर मनाया जाता है।
    8. सेल प्रति भाँति biomolecules की संख्या की गणना
      1. उच्च मूल्यों (2-3 मेगावाट) और लंबे समय जोखिम (100 एमएस) के लिए लेजर शक्ति निर्धारित करें।
      2. पूरे सेल रोशन करने के क्रम में मोड widefield के लिए रोशनी सेट करें।
      3. के रूप में रिकॉर्ड फिल्मों प्रतिदीप्ति photobleaching के पूरा होने के बाद अतिरिक्त फ्रेम (50-100 फ्रेम) दर्ज करने के लिए सुनिश्चित करते हुए 4.2 कदम में वर्णित है।

5. डेटा विश्लेषण

  1. सामान्य विश्लेषण
    1. ऐसे मुफ्त सॉफ्टवेयर ImageJ के रूप में एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, सफेद प्रकाश और प्रतिदीप्ति excitations में दोनों दर्ज की छवियों और फिल्मों, विश्लेषण।
      1. ImageJ में, फ़ाइल में माइक्रोस्कोप (TIF स्वरूप) पर दर्ज की छवियों या फिल्मों> ओपन> आपकी फ़ाइल स्थान खुला।
      2. गुणात्मक एक कंप्यूटर स्क्रीन पर प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना करने के लिए,> सभी प्रतिदीप्ति छवियों छवि में वही चमक और विपरीत सेटिंग्स के साथ प्रदर्शित कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित कर लें> चमक / विपरीत समायोजित। एक चयनित छवि के लिए स्वयं या स्वतः सेटिंग्स समायोजित प्रेस बटन "सेट" और "अन्य सभी छवियों के लिए प्रचार" विकल्प का चयन करें।
      3. , "न्यूनतम और अधिकतम ग्रे मूल्य 'और' ग्रे मूल्य मतलब" विश्लेषण> सेट माप, और (कम से कम) "क्षेत्र", "मानक विचलन" का चयन करें: निकालने के लिए सूचना के प्रकार सेट करें।
      4. > उपाय, सेल प्रतिदीप्ति तीव्रता तुलना क्षेत्र के ImageJ की मुक्तहस्त चयन बटन का उपयोग हित के चयन और सेल तीव्रता में विश्लेषण निकालने के लिए। जिसके परिणामस्वरूप तालिका माप मूल्यों में शामिल है औरबचाया और / या अन्य सॉफ्टवेयर को कॉपी किया जा सकता है। "मतलब" मान चयनित क्षेत्र में पिक्सेल प्रति औसत तीव्रता से मेल खाती है और सीधे कोशिकाओं के बीच या एक सेल और पृष्ठभूमि के बीच तुलना की जा सकती।
      5. एक electroporated सेल नमूने में, एक सेल पिक्सेल प्रति अपनी औसत तीव्रता नकारात्मक नियंत्रण के पिक्सेल प्लस 3 बार अपने मानक विचलन (ए वी (मैं सेल लोड)> ए वी (मैं -EP) + प्रति औसत तीव्रता से बड़ा है यदि लोड माना जाता है 3 * StdDev (मैं -EP))।
    2. नमूनों की गुणवत्ता और लदान का मूल्यांकन करने के क्रम में झूठे रंग प्रतिदीप्ति ओवरले छवियों और फिल्मों का निर्माण करें।
      1. ImageJ में, इस तरह के सफेद रोशनी छवि और छवि> रंग में एक ही FOV करने के लिए इसी प्रतिदीप्ति छवि के रूप में ओवरले छवियों> चैनलों मिलाएं। सफेद रोशनी के लिए प्रत्येक छवि (सी 4 (ग्रे के लिए एक रंग) का चयन करें, सी 1 लाल चैनल के लिए (लाल), सी 2 (ग्रीन चैनल ... आदि के लिए हरी।)।
      2. चेकओवरले प्रतिदीप्ति सेल सीमाओं के भीतर स्थित है जो छवि (सफेद प्रकाश छवि) और उस पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम और सजातीय है (सेल सीमाओं के बाहर कोई चमकीले धब्बों) पर।
      3. कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या का विश्लेषण करने से पहले, खाली सेल छवियों के लिए इसी तरह की नकारात्मक नमूना करने के लिए इसी गुणात्मक छवियाँ हैं की जाँच करें और electroporated कोशिकाओं की तुलना में काफी कम तीव्रता प्रदर्शित करते हैं।
    3. व्यवहार्यता प्रयोगों के लिए, स्वयं (4.2.6 देखें) समय के साथ बढ़ रहा है देखने का एक ही क्षेत्र से, गैर विभाजित लेकिन (समान) दिख बरकरार है और क्षतिग्रस्त (मृत) कोशिकाओं को विभाजित के प्रतिशत गिनती।
    4. पर्याप्त आंकड़े इकट्ठा करने के क्रम में नमूना (electroporated, नकारात्मक नियंत्रण और खाली कोशिकाओं) के अनुसार कम से कम 200 कोशिकाओं की व्यवहार्यता का मूल्यांकन।
  2. सेल आधारित विश्लेषण
    1. कदम-वार photobleaching के विश्लेषण से सेल प्रति भाँति biomolecules की संख्या की गणना
      1. Selecti के आधार पर विभाजित कोशिकाओंImageJ की मुक्तहस्त चयन बटन का उपयोग हित के क्षेत्र एनजी और ठीक सेल (झिल्ली सेल के बराबर) के आस-पास कोई आकृति बनाएं।
      2. छवि> ढेर> प्लॉट जेड अक्ष प्रोफ़ाइल में समय के साथ सेल तीव्रता निकालें। जिसके परिणामस्वरूप ग्राफ कि विशेष सेल के लिए एक photobleaching की अवस्था में जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक फिल्म फ्रेम बनाम सेल सीमा के भीतर क्षेत्र के लिए पिक्सेल प्रति औसत तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है। यह एक कम asymptote (पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति) तक पहुँचने सेल तीव्रता का एक प्रारंभिक घातीय कमी शामिल है। माप मूल्यों और "सहेजें" या "कॉपी" पर क्लिक करके बचाया और / या अन्य सॉफ्टवेयर को कॉपी किया जा सकता है।
      3. एक स्प्रेडशीट स्तंभ में कॉपी और विरंजन मूल्यों पेस्ट (मैं रॉ)।
      4. पिछले 50-100 फ्रेम (कम asymptote) के लिए प्राप्त मैं कच्चे मूल्यों के औसत से (मैं ऑटो) photobleaching के बाद शेष पिक्सेल प्रति औसत autofluorescence गणना।
      5. एसप्रारंभिक photobleaching की अवस्था से है कि सेल के लिए photobleaching के बाद शेष पिक्सेल प्रति औसत autofluorescence ubtract: मैं विरंजन = मैं कच्चे - मैं ऑटो।
      6. का प्रयोग करें आधारभूत-घटाया (मैं फ्रेम बनाम विरंजन) timetraces photobleaching के कारण एक भी फ्लोरोफोरे 26 की विरंजन के लिए औसत कदम आकार (एकात्मक फ्लोरोफोरे तीव्रता) का मूल्यांकन करने के लिए कम से कम 10 quantized कदम दिखा।
      7. एकात्मक फ्लोरोफोरे तीव्रता से प्रारंभिक आधारभूत-घटाया सेल तीव्रता (मैं = 0 टी में विरंजन) विभाजित करके सेल प्रति भाँति अणुओं की संख्या का मूल्यांकन।
    2. एकल सेल झल्लाहट क्षमता
      1. (दाता उत्तेजना पर) दोनों दाता और स्वीकर्ता उत्सर्जन चैनलों में पिक्सेल प्रति औसत कोशिकाओं तीव्रता को मापने और प्रत्येक चैनल के लिए सेल सीमा के भीतर 5.1.1.4 में समझाने के रूप में।
      2. प्रत्येक चर्चा में पृष्ठभूमि के लिए औसत पिक्सेल तीव्रता को मापनेस्लाइड के एक रिक्त क्षेत्र से annel।
      3. पिक्सेल प्रति औसत तीव्रता से इस पृष्ठभूमि तीव्रता घटाना। दाता उत्तेजना पर कुल (स्वीकर्ता + दाता) द्वारा विभाजित पृष्ठभूमि घटाया स्वीकर्ता तीव्रता पृष्ठभूमि घटाया तीव्रता की गणना के द्वारा प्रत्येक कक्ष के लिए झल्लाहट की गणना करने के लिए इन पृष्ठभूमि घटाया प्रतिदीप्ति तीव्रता का उपयोग करें: (मैं + मैं दाता स्वीकर्ता) / स्वीकर्ता
  3. एकल अणु विश्लेषण
    1. एकल अणु ट्रैकिंग और प्रसार विश्लेषण
      नोट: जीवित कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट अणु diffusing और उनके स्पष्ट प्रसार गुणांक का मूल्यांकन करने के लिए ट्रैकिंग के लिए प्रोटोकॉल, 28 26 में वर्णित किया गया है।
      1. संक्षेप में, एक 2 डी अण्डाकार गाऊसी द्वारा प्रत्येक फ्रेम में एकल fluorophores के छवियों फिट बैठते हैं। वे 5-7 पिक्सल (0.48-0.67 माइक्रोन) की एक खिड़की के भीतर लगातार फ्रेम में छपी यदि लिंक एक ट्रैक करने के अणुओं स्थानीयकृत। एक memor का प्रयोग करेंएक फ्रेम के y पैरामीटर के कारण पलक या चूक स्थानीयकरण करने के लिए एक फ्लोरोफोरे के क्षणिक लापता होने के लिए खाते।
    2. विवो smFRET विश्लेषण में
      1. मैन्युअल ImageJ में एक फिल्म के माध्यम से जा रहा द्वारा फिल्मों से स्थानीय अणुओं के अंदर की कोशिकाओं की पहचान करने और झल्लाहट (स्वीकर्ता) चैनल में स्थिर (या काफी स्थिर) के अणुओं की पहचान।
      2. एक स्थिर अणु करने के लिए इसी स्वीकर्ता और दाता चैनल में तीव्रता निकालने के लिए, (एक ~3 पिक्सेल त्रिज्या का उपयोग कर, प्रत्येक एकल फ्लोरोफोरे के आसपास वृत्त) ImageJ की "ओवल" चयन बटन का उपयोग हर चैनल में अणु के आसपास के क्षेत्र का चयन करें और > अणु तीव्रता में विश्लेषण उपाय निकाल सकते हैं। जिसके परिणामस्वरूप तालिका माप मूल्यों में शामिल है और बचाया और / या अन्य सॉफ्टवेयर को कॉपी किया जा सकता है।
      3. विश्लेषण किया सभी तख्ते पर स्लाइड के एक रिक्त क्षेत्र में एक ही आकार का एक चक्र से औसत पिक्सेल तीव्रता से प्रति चैनल पृष्ठभूमि मूल्यों की गणना।
      4. एकल कोशिका के रूप में, प्रतिदीप्ति के लिए (दाता उत्तेजना पर) दाता और स्वीकर्ता चैनलों में पृष्ठभूमि घटाया प्रतिदीप्ति मूल्यों का प्रयोग करें और समय के निशान झल्लाहट (5.2.1.7 देखें) मामले झल्लाहट।
        नोट: स्वचालित और मजबूत विश्लेषण और एल्गोरिदम सन्दर्भ 26-28, 31 में वर्णित किया गया है।

Representative Results

नमूना तैयार करना

प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों का चित्र 1 में schematics के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। एक उदाहरण के रूप में, हम दोगुना से लेबल (दाता और स्वीकर्ता रंजक) डीएनए टुकड़े के साथ बैक्टीरिया की लोडिंग का प्रतिनिधित्व किया। डीएनए internalization के लिए प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2 में दिखाया गया है। प्रत्येक electroporated नमूने के लिए, खाली कोशिकाओं और गैर electroporated कोशिकाओं के लिए डेटा भी (चित्रा 2) दर्ज किए गए। "खाली कोशिकाओं" न तो फ्लोरोसेंट biomolecules और न ही electroporated के साथ incubated कोशिकाओं electrocompetent के अनुरूप; फ्लोरोसेंट चैनल में उनकी तीव्रता समान प्रयोगात्मक शर्तों (लेसर शक्ति, समय संकल्प, तापमान, आदि) के तहत autofluorescence स्तर को दर्शाता है। "गैर electroporated कोशिकाओं" (यह भी कहा -EP, यानी, शून्य से ईपी) कोशिकाओं फ्लोरोसेंट biomolec साथ incubated किया गया है electrocompetent जिसमें एक नकारात्मक नियंत्रण के अनुरूपules लेकिन electroporated नहीं। इन गैर electroporated कोशिकाओं खाली कोशिकाओं की autofluorescence के समान है और भरी हुई, electroporated कोशिकाओं द्वारा प्रदर्शित प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना में काफी कम एक प्रतिदीप्ति स्तर का प्रदर्शन करना चाहिए। यह बाहरी कोशिका झिल्ली का पालन किया है हो सकता है कि किसी भी गैर-भाँति लेबल वाले biomolecules के हटाने की पुष्टि करता है।

चित्र 2
चित्रा 2: बैक्टीरिया में अलग सांद्रता में अलग fluorophores के साथ लेबल dsDNA के internalization (एई) और खमीर (एफ) के लिए प्रतिनिधि परिणाम सही करने के लिए वाम:। सफेद प्रकाश, प्रतिदीप्ति और ओवरले छवियाँ। - + / ईपी electroporation के साथ / बिना ऊष्मायन अर्थ। स्केल सलाखों: 3 माइक्रोन। ए Cy3B dsDNA, 10 pmol, ई कोलाई। बी ATTO647N dsDNA, 10 pmol, ई कोलाई। सी Alexa647 dsDNA, 5 pmol, ई कोलाई। डी Cy3B dsDNA, 100 pmol, ई कोलाई। ई ATTO647N डी एसडीएनए, 100 pmol, ई कोलाई। एफ ATTO647N dsDNA, 30 pmol, खमीर। यह आंकड़ा संदर्भ में 26 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सेल प्रति भाँति biomolecules की संख्या की गणना

प्रक्रिया एक साथ लेबल डीएनए के विभिन्न सांद्रता के साथ प्राप्त प्रतिनिधि परिणामों के साथ, चित्रा 3 और पूरक फिल्म 2 में प्रस्तुत किया है photobleaching विश्लेषण का उपयोग सेल प्रति भाँति में लेबल के biomolecules की संख्या का अनुमान लगाने के लिए। सेल लोड हो रहा दक्षता incubated लेबल डीएनए की आरंभिक राशि के साथ बढ़ जाती है, एक "एकल अणु" स्तर (<10, पूरक मूवी 2 बी) एक "कलाकारों की टुकड़ी" स्तर तक (> 10 से धुन करने के लिए उपयोगकर्ता सेल प्रति लेबल वाले अणुओं की संख्या की इजाजत दी पूरक मूवी 2A)। भरी हुई कोशिकाओं का प्रतिशत आकलन के एक मजबूत तरीका टी हैओ, गैर electroporated कोशिकाओं के औसत सेल तीव्रता प्लस 3 बार उनके मानक विचलन (यानी, ए वी (मैं-ईपी) + 3 * StdDev (मैं-ईपी) जहां ए.वी. = औसत से ऊपर एक सेल तीव्रता को प्रदर्शित करने electroporated कोशिकाओं की संख्या गिनती मैं = पिक्सेल प्रति तीव्रता, एसटीडी। देव। = मानक विचलन और -EP = गैर electroporated) चित्रा 3 में दिखाया गया है।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Photobleaching विश्लेषण का उपयोग भली भाँति अणुओं की संख्या की गणना (ए) एकल कोशिका विश्लेषण photobleaching। प्रतिदीप्ति तीव्रता timetraces के उदाहरण (नीला: कच्चे डेटा, लाल: फिट; insets: WL और पहले और विरंजन के बाद ATTO647N लेबल dsDNA के साथ भरी हुई ई कोलाई के प्रतिदीप्ति छवियों)। शीर्ष पर: एकल कदम विरंजन घटना। मध्य: विरंजन दिखा ± 3 अणुओं से युक्त सेलऔर निमिष। नीचे: कम से कम 10 अणुओं के लिए इसी> 10 कदम युक्त सेल कम से कम 6 अलग पहचाना चरणों से युक्त 57 कोशिकाओं से एक स्वचालित कदम ढाले कलन विधि से एक कदम ऊंचाई तीव्रता का (बी) हिस्टोग्राम।। एकल गाऊसी फिट प्रति सेकंड 8100 फोटॉनों की एक एकात्मक फ्लोरोफोरे तीव्रता करने के लिए इसी, 11 ± 3 ए.यू. पर केंद्रित है। तारक ऊपर या एकात्मक फ्लोरोफोरे तीव्रता से प्रारंभिक प्रतिदीप्ति तीव्रता विभाजन के बाद की गणना ATTO647N dsDNA के विभिन्न मात्रा के साथ electroporated सेल प्रति भाँति अणुओं के बराबर 50 Au (सी) हिस्टोग्राम सभी कदम ऊंचाइयों सभा बिन निशान। नीचे से ऊपर: खाली कोशिकाओं (यानी, फ्लोरोसेंट अणुओं के साथ incubated नहीं और electroporated नहीं), गैर electroporated (लेकिन फ्लोरोसेंट अणु, नाम -EP साथ incubated), और electroporated कोशिकाओं 10 और 100 pmol (ईपी + नाम) dsDNA के साथ incubated। खाली और गैर electroporated कोशिकाओं अनुरूपautofluorescence के लिए, electroporated जबकि कोशिकाओं (≥ 4 अणुओं तारक से चिह्नित बिन देखें) 100 pmol पर अत्यधिक लोड कोशिकाओं के एक उच्च अनुपात के साथ भली भाँति अणुओं का एक व्यापक वितरण, दिखाते हैं। Internalization दक्षता 10 और 100 pmol नमूने के लिए (इंट के साथ कोशिकाओं के अंश। + 3x एसटीडी। देव। गैर -EP नमूना का मतलब>) क्रमश: 94% और 90% था। 10 pmol dsDNA के लिए 121 ± 106 अणुओं, और 100 pmol dsDNA के लिए 176 ± 187 अणुओं: सेल प्रति भाँति अणुओं की संख्या मतलब। सेटिंग: 100 एमएस जोखिम, widefield रोशनी। स्केल सलाखों: 1 माइक्रोन। यह आंकड़ा संदर्भ में 26 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सेल लोडिंग और व्यवहार्यता

लेबल वाले biomolecules के राशि परिवर्तन के अलावा पूर्व electroporation के लिए कोशिकाओं को जोड़ा गया,उपयोगकर्ता electroporation के दौरान (चित्रा 4, पूरक मूवी 1) अलग क्षेत्र ताकत का चयन करके धुन भाँति अणुओं की राशि कर सकते हैं। हायर क्षेत्र ताकत अधिक से अधिक internalization क्षमता का नेतृत्व करने के लिए, लेकिन सेल व्यवहार्यता का एक मामूली कमी करने के लिए नेतृत्व। प्रोटीन internalization के लिए, एक निस्पंदन कदम का उपयोग गैर-भाँति लेबल प्रोटीन (3.3.3.1.1 देखें) को हटाने में मदद कर सकते हैं। ऐसे मामलों में, सेल निस्पंदन मनाया फ्लोरोसेंट प्रोटीन वास्तव में बैक्टीरिया कोशिका द्रव्य के अंदर भली भाँति सुनिश्चित करता है कि; हम (अधिक जानकारी के लिए, रेफरी 22 देखें) हालांकि, कि छानने का काम भी सेल व्यवहार्यता पर एक नकारात्मक प्रभाव पड़ता है, ध्यान दें।

चित्रा 4
चित्रा 4: सेल लोडिंग और व्यवहार्यता पर electroporation के वोल्टेज के प्रभाव (ए) लोड हो रहा है effic पर electroporation के क्षेत्र शक्ति के प्रभाव का प्रतिनिधित्व बार चार्ट।iency (लाल स्तंभ) और कोशिकाओं (हरे रंग की सलाखों) की व्यवहार्यता। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक agarose पैड पर एक घंटे के बाद गैर electroporated सेल (0 केवी / सेमी) विभाजन के 84 ± 8%। एक ही परिस्थितियों में, 78 ± 3% और 0.9 केवी / सेमी और 1.8 केवी / सेमी पर electroporated कोशिकाओं के 49 ± 3% क्रमशः एक घंटा के बाद विभाजित करते हैं। कोशिकाओं के 92 ± 6% 1.8 केवी / सेमी पर लोड कर रहे हैं, जबकि लोड हो रहा है दक्षता के लिए, कोशिकाओं के 73 ± 8%, 0.9 केवी / सेमी पर लोड कर रहे हैं। त्रुटि सलाखों के तीन स्वतंत्र माप से गणना की मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं; 200 से अधिक कोशिकाओं के प्रत्येक नमूने और प्रत्येक को दोहराने के लिए विश्लेषण किया गया। कई पीढ़ियों से अधिक सेल व्यवहार्यता की मामूली हानि के लिए electroporation के वोल्टेज के साथ कुल मिलाकर लोड हो रहा है क्षमता बढ़ जाती है। (बी) सेल आधारित प्रतिदीप्ति माप समग्र प्रतिदीप्ति तीव्रता दोनों बेटी कोशिकाओं के बीच समान रूप से साझा किया जाता है कि पता चलता है। सेल 1 और 2 टी = 0 पैमाने पर (बाएं) सफेद रोशनी छवि में सेल नंबर और प्रतिदीप्ति छवि को संदर्भित करता हैबार: 1 माइक्रोन)। यह आंकड़ा संदर्भ में 26 से संशोधित किया गया है।

प्रोटीन internalization

प्रोटीन internalization के लिए प्रतिनिधि परिणाम आंकड़े 5A एंड बी में हैं। यह संभव पहले electroporation के रूप में प्रोटीन नमूना से शेष मुफ्त (unreacted) डाई के रूप में ज्यादा दूर करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। आंकड़े 5A एंड बी, Cy3b लेबल Klenow टुकड़ा नमूना (KF कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ मैं की Klenow टुकड़ा है जहां Cy3b-KF, 66 केडीए) केवल 1% मुक्त डाई शामिल है में उदाहरणों में; समग्र सेल लोड हो रहा है ऐसे डाई योगदान नगण्य है। मुक्त डाई के बराबर राशि के साथ electroporated (लेबल प्रोटीन का एक ही राशि के साथ incubated) गैर electroporated कोशिकाओं दोनों के साथ ब्याज की electroporated नमूने की तुलना के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं मनाया फ्लोरोसेंट अणु है कि यह सुनिश्चित करने के लिए दो आवश्यक नियंत्रण का गठनवास्तव में लेबल प्रोटीन भाँति रहे हैं।

चित्रा 5
चित्रा 5: जीवित बैक्टीरिया में प्रोटीन internalization के (ए) के विचारों के प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति ओवरले क्षेत्र।। प्रकोष्ठों केवल 1% मुक्त Cy3b डाई निहित एक प्रोटीन है कि शेयर समाधान से 50 pmol RNAP ω सबयूनिट के साथ 1.4 केवी वोल्टेज में electroporated। गैर electroporated (गैर -EP) और खाली कोशिकाओं पहले के रूप में परिभाषित कर रहे हैं। नि: शुल्क डाई RNAP ω Electroporated नमूना के रूप में ही एकाग्रता में भली भाँति किया गया था। 1 मेगावाट, (ए) में नमूने के लिए uncorrected सेल औसतन तीव्रता का 50 एमएस जोखिम। (बी) के वितरण में व्यापक क्षेत्र मोड, 532 एनएम उत्तेजना में इमेजिंग, कुल सेल गिनती के अनुपात में दी गई। नमूना प्रति 400 से अधिक कोशिकाओं खंडों थे। यह आंकड़ा संदर्भ में 22 से संशोधित किया गया है। Unla (सी) internalizationएक T7 प्रमोटर के नियंत्रण के तहत pRSET-EmGFP प्लाज्मिड एन्कोडिंग पन्ना GFP (EmGFP) ले जाने electrocompetent DH5α में beled T7 शाही सेना पोलीमरेज़ (T7 RNAP, 98 केडीए)। वाम: परख के योजनाबद्ध। मध्य: प्रतिदीप्ति ओवरले। अधिकार: incubated और T7 RNAP (नीचे) के साथ electroporated गैर electroporated नमूना (ऊपर) और कोशिकाओं के लिए सेल आधारित प्रतिदीप्ति तीव्रता के histograms; electroporated कोशिकाओं का लगभग 11% उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता शो (इंट के साथ कोशिकाओं के अंश।> + मतलब 3x एसटीडी। देव। गैर -EP का नमूना) EmGFP की अभिव्यक्ति का संकेत है। 3 माइक्रोन: तारक ऊपर या बराबर 1100 एयू स्केल बार सभी तीव्रता सभा डिब्बे से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा संदर्भ में 26 से संशोधित किया गया है।

चित्रा 5C प्रोटीन electroporation की एक और आवेदन प्रस्तुत करता है। इधर, electroporated प्रोटीन लेबल हटाया गया है, लेकिन इसके internalization के एक नमूदार फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया से चलाता है। इस प्रयोग से पूर्व की पुष्टि करता हैभावना और सेल कोशिका द्रव्य में electroporated प्रोटीन की कार्यक्षमता। Unlabeled T7 शाही सेना पोलीमरेज़ (98 केडीए) ई में भली भाँति किया गया था एक T7 प्रमोटर 26 के नियंत्रण के तहत फ्लोरोसेंट प्रोटीन EmGFP के लिए एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग युक्त कोलाई तनाव DH5α। T7 शाही सेना पोलीमरेज़ के लिए जीन DH5α में अनुपस्थित है, हमारे प्रयोगों में EmGFP अभिव्यक्ति कार्यात्मक T7 शाही सेना पोलीमरेज़ इलेक्ट्रोपोरेशन (चित्रा 5C) के माध्यम से कोशिकाओं में पेश किया जाना जरूरी है। एक pmol T7 RNAP, कोशिकाओं के> 11% के साथ electroporation के निम्न (नीली पट्टी, चित्रा 5C) नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में अधिक प्रतिदीप्ति का प्रदर्शन (T7 RNAP का एक ही राशि के साथ incubated, लेकिन electroporated नहीं)। इस परिणाम electroporation द्वारा भली भाँति T7 RNAP अणुओं के अनुपात के vivo में उनकी ईमानदारी को बनाए रखने और सेल कोशिका द्रव्य में अपने इच्छित कार्य कर सकते हैं कि स्थापित करता है।

विवो में एकल अणु पर झल्लाहटऔर एकल कोशिका के स्तर

अंत में, रहने वाले बैक्टीरिया में दोगुना लेबल वाले प्रजातियों के internalization और विश्लेषण 3. रूप फ्लोरोसेंट प्रोटीन fusions के vivo में smFRET पढ़ाई के लिए आदर्श नहीं हैं चित्रा 6 और पूरक मूवी में प्रस्तुत किया है, electroporation का उपयोग कर जीवित कोशिकाओं में दोगुना से लेबल के biomolecules देने की क्षमता एक है इस विधि के महान परिसंपत्तियों की। चित्रा 6A एकल कोशिका (दाता स्वीकर्ता झल्लाहट जोड़ी के रूप में Cy3B और Atto647N fluorophores का उपयोग) अलग झल्लाहट डीएनए मानकों के साथ भरी हुई बैक्टीरिया का विश्लेषण झल्लाहट प्रस्तुत करता है। प्रकोष्ठों 0.17, 0.48 की स्पष्ट झल्लाहट क्षमता के साथ तीन कम दोगुना लेबल dsDNA झल्लाहट मानकों की 20 pmol (ई *) के साथ electroporated कर रहे हैं, और 0.86 में इन विट्रो (पहले 26 निर्धारित)। सभी DNAs (चित्रा 6A, बाएं) और प्रत्येक एकल कोशिका ई * वितरण के मुख्य शिखर कुशलता से कोशिकाओं में प्रवेश (इन विट्रो परिणामों के साथ अच्छी तरह से चित्रा 6A इससे सहमत, सही)। मध्यवर्ती और उच्च झल्लाहट के नमूने में, कम संभवतः कारण स्वीकर्ता विरंजन और photophysical निष्क्रियता, चर सेल लोडिंग के संयोजन के लिए, मनाया जाता है उम्मीद की तुलना में ई * (इस प्रकार, चर संकेत करने वाली शोर अनुपात) और डीएनए गिरावट के साथ सेल आबादी ।

चित्रा 6
चित्रा 6:।। एकल कोशिका और एकल अणु के लिए प्रतिनिधि परिणाम पहनावा और smFRET पढ़ाई एकल बैक्टीरिया में रहने वाले बैक्टीरिया में अवलोकन झल्लाहट कम प्रदर्शन प्रत्येक तीन डीएनए झल्लाहट मानकों की 20 pmol के साथ भरी हुई कोशिकाओं की (ए) के विश्लेषण (~ 0.17), मध्यवर्ती (~ 0.48), और उच्च (~ 0.86) झल्लाहट (इन विट्रो एकल अणु माप का उपयोग कर के रूप में मापा; रेफरी 26 देखें)। वाम: सफेद रोशनी और हरी / लाल (झल्लाहट) प्रतिदीप्ति ओवरले छवियों (स्केल बार: 3 माइक्रोन)। विभिन्न कोशिकाओं से झल्लाहट मूल्यों के उदाहरण (सफेद) संकेत कर रहे हैं। सामान (ऊपर से नीचे) हिंदुस्तान टाइम्स:। uncorrected सेल आधारित झल्लाहट (ई *) डीएनए मानकों झल्लाहट दाता केवल (गहरे हरे रंग की), कम (हल्के हरे रंग), मध्यवर्ती (पीला), और उच्च (लाल) के लिए histograms (बी डी) विवो smFRET में। प्रकोष्ठों 0.25 pmol मध्यवर्ती झल्लाहट डीएनए (पैनल बी), 0.25 pmol उच्च झल्लाहट डीएनए (पैनल सी) के साथ लोड कर रहे हैं, और 5 pmol KF (पैनल डी) दोगुना लेबल। बाएँ स्तंभ: पहले और स्वीकर्ता photobleaching के बाद भी फ्रेम की हरी / लाल प्रतिदीप्ति ओवरले। मध्य स्तंभ: पीला सर्कल में अणु को इसी समय निशान। झल्लाहट क्षमता, दाता उत्सर्जन तीव्रता, और स्वीकर्ता उत्सर्जन तीव्रता क्रमश: नीले, हरे, और लाल रंग में प्रदर्शित कर रहे हैं। सही कॉलम: दाता केवल अणु (हरा) और प्रत्येक नमूने के लिए 20 समय निशान से (पीले, लाल, और ग्रे) दाता स्वीकर्ता अणुओं की झल्लाहट histograms। स्केल सलाखों: एक के लिए तीन माइक्रोन, बी डी के लिए एक माइक्रोन। यह आंकड़ा संदर्भ में 26 से संशोधित किया गया है।208fig6large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

डीएनए या प्रोटीन मध्यवर्ती और उच्च झल्लाहट डीएनए मानकों के नमूने, कम मात्रा में (0.25 pmol) (चित्रा 6B, सी) या झल्लाहट जोड़ी के रूप में डबल लेबल KF (Alexa647 / Cy3B fluorophores के 5 pmol, चित्रा के लिए vivo में smFRET निरीक्षण करने के लिए 6D) ई में electroporated कर रहे हैं कोलाई। इस तरह की सांद्रता ट्रैकिंग, और एकल अणुओं के लिए निगरानी झल्लाहट, प्रत्यक्ष स्थानीयकरण अनुमति देता है, कुछ (एन = 1-10) लेबल वाले अणुओं के साथ भरी हुई कई कोशिकाओं का नेतृत्व किया। दूसरों को स्थिर दिखाई देते हैं या धीरे-धीरे (अनुपूरक मूवी 3) फैलाना जबकि कुछ अणुओं, स्वतंत्र रूप से फैलाना। 1-30 के लिए पिछले और smFRET की पहचान दिखाने के लिए स्थिर दोगुना लेबल के biomolecules (चित्रा 6, मध्य) के Timetraces: उदाहरण के लिए स्वीकर्ता विरंजन पर दाता और स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति में anticorrelated परिवर्तन (, टी ~ 16 सेकंड, चित्रा 6B, मध्यम ), एकल द्वारा पीछा(उदाहरण के लिए, टी ~; 19 सेकंड, चित्रा 6B) -step दाता विरंजन। ऐसे timetraces (6 चित्रा, दाएं) इन विट्रो अध्ययन 26,31,32 में प्रकाशित साथ उत्कृष्ट समझौते में है कि एक मतलब मूल्य में परिणाम से उत्पन्न झल्लाहट वितरण। इन परिणामों से भली भाँति DNAs और प्रोटीन पर मात्रात्मक smFRET अध्ययन के लिए क्षमता की स्थापना, और (T7 RNAP internalization के प्रयोगों द्वारा समर्थित के रूप में) प्रोटीन electroporation और internalization पर उनकी ईमानदारी और संरचना को बनाए रखने का सुझाव है कि।

पूरक मूवी 1:। सेल व्यवहार्यता वाम: व्हाइट प्रकाश छवियों। अधिकार: प्रतिदीप्ति छवियों। एनिमेटेड GIF 10 pmol Atto647 लेबल डीएनए के साथ भरी हुई बैक्टीरिया की electroporation (1.8 केवी / सेमी) के बाद विभाजन दिखा एनिमेटेड। प्रतिदीप्ति के समग्र स्पष्ट कमी आंशिक रूप से प्रत्येक के दौरान होता है जो photobleaching के लिए भी कोशिका विभाजन पर लेबल डीएनए के कमजोर पड़ने के कारण और हैमाप।

पूरक मूवी 2: सेल आधारित photobleaching से पढ़ाई ए। (> 100 Atto647N लेबल डीएनए अणु युक्त) एक भारी लोड सेल के प्रतिनिधि उदाहरण है। ऊपर छोड़ दिया, ब्याज (लाल आयत) के सेल की सफेद रोशनी छवि। शीर्ष सही, कई मिनट पर उनके प्रतिदीप्ति क्षय दिखा भरी हुई कोशिकाओं की फिल्म। ब्याज की सेल के समग्र प्रतिदीप्ति तीव्रता क्षय के नीचे, समय का पता लगाने। कार्बनिक fluorophores जन्मों एफपीएस की तुलना में अधिक परिमाण के दो आदेशों (यहाँ, ~ Atto647N के लिए 41 सेकंड) photobleaching प्रदर्शन कर सकते हैं। कम से कम 10 से लेबल अणुओं (इस मामले में 3) के साथ भरी हुई एक सेल के बी प्रतिनिधि उदाहरण है। पैनल ए नीचे, एक कदम विरंजन दिखा रहा है और / या एकल जैविक fluorophores के लिए इसी निमिष ब्याज की सेल के समग्र प्रतिदीप्ति तीव्रता के समय का पता लगाने के रूप में ही ऊपर। इन कदमों से औसत ऊंचाई ~ यहाँ (एकल अणु एकात्मक तीव्रता से मेल खाती है12 एयू) सेल प्रति भाँति अणुओं की प्रारंभिक संख्या का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया। 300 μW सत्ता में निरंतर लाल लेजर उत्तेजना के तहत सिनेमा और फ्रेम प्रति 100 मिसे।

पूरक मूवी 3:। मैं n एकल अणु झल्लाहट ऊपर vivo: प्रकोष्ठों लगातार nTIRF रोशनी के तहत फ्रेम प्रति 50 एमएस पर नजर रखी 0.25 pmol (चित्रा 6C के रूप में) उच्च झल्लाहट डीएनए 1 मेगावाट ग्रीन (532 एनएम) लेजर उपयोग करने के साथ भरा हुआ है। प्रत्येक फ्रेम प्रत्येक चैनल के एक हरी / लाल (झल्लाहट) प्रतिदीप्ति ओवरले है। Diffusing और स्थिर लाल (बरकरार) और हरी (एकल सक्रिय लेबल) डीएनए अणु मनाया जा सकता है। नीचे: पीले सर्कल में अणु को इसी समय का पता लगाने। झल्लाहट क्षमता, दाता उत्सर्जन तीव्रता, और स्वीकर्ता उत्सर्जन तीव्रता क्रमश: नीले, हरे, और लाल रंग में प्रदर्शित कर रहे हैं। विरोधी सहसंबद्ध स्वीकर्ता विरंजन घटना (लाल-टू-हरी संक्रमण) एकल अणु झल्लाहट के हस्ताक्षर से मेल खाती है।

Discussion

कई मापदंडों सेल electroporation और डाटा अधिग्रहण ब्याज की जैविक प्रणाली और प्रयोग (सेल-स्तर या एकल अणु विश्लेषण) की सटीक प्रकृति पर निर्भर करता है के दौरान अलग किया जा सकता है। बैक्टीरिया में डीएनए electroporating जब उदाहरण के लिए, लेबल dsDNA टुकड़े की 0.25-5 pmol (पहले से photobleaching के लिए आवश्यकता के बिना, अर्थात्।) डायरेक्ट एकल अणु का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, एक कम internalization के दक्षता की ओर जाता है। 5 pmol dsDNA ऊपर, कोशिकाओं भारी एकल कोशिका विश्लेषण के लिए एक व्यवस्था बेहतर अनुकूल, लोड करने के लिए करते हैं। सभी लेबल DNAs भी पहले जेल शुद्ध मुक्त डाई के किसी भी ट्रेस को दूर करने के क्रम में होना चाहिए डीएनए शेयर समाधान से (फ्लोरोफोरे गैर प्रतिक्रिया व्यक्त)। इसके अलावा, विशेष रूप से smFRET प्रयोगों के लिए डीएनए गिरावट के साथ संभावित मुद्दों, अप्राकृतिक न्यूक्लिक एसिड होता है, या इस तरह के बाल के लिये कांटा छोरों के रूप में exonuclease-सुलभ टर्मिनी कि रक्षा रूपांकनों के साथ DNAs का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है।

एक अन्य adjustablelectroporation में ई पैरामीटर electroporation के दौरान लागू क्षेत्र की ताकत है। कम क्षेत्र शक्ति (~ 1 केवी / सेमी) एकल अणु के अध्ययन के लिए उपयुक्त एक कम लोड हो रहा है दक्षता को बढ़ावा मिलेगा। (1.8 केवी / सेमी तक) हायर क्षेत्र ताकत लोड हो रहा है दक्षता में वृद्धि होगी; हालांकि, electroporation के बाद क्षेत्र शक्ति और सेल व्यवहार्यता के बीच एक व्युत्क्रम संबंध है (चित्रा 4 देखें)। संदर्भ के लिए, बैक्टीरिया और खमीर electroporation के लिए प्रयोग किया जाता है एक सामान्य क्षेत्र शक्ति ~ 1.5 केवी / सेमी है। समय लगातार बूंदों के रूप में जल्द ही किसी भी arcing को घटना क्युवेट में होता है के रूप में के बाद से इस क्षय की लंबाई का प्रतिनिधित्व लगातार समय, पालन करने के लिए एक सुविधाजनक पैरामीटर है। सामान्य सेटिंग्स के तहत, समय लगातार 4 एमएस से अधिक होना चाहिए; कम मूल्यों कम लोड हो रहा है दक्षता या यहां तक ​​कि गैर-भरी हुई क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को बढ़ावा मिलेगा। अधिकांश electroporators दोनों धुन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है (जैसे कि "पल्स ट्रंकेशन" या "आकार नाड़ी" के रूप में) स्वतंत्रता के अन्य डिग्री प्रदान करते हैंसेल लोडिंग और व्यवहार्यता। हम फिर भी इसी तरह की प्रक्रियाओं को भी अपने झिल्ली (एकल लिपिड bilayer) वास्तव में कम जटिल है और electroporation के बाद से पहले से ही इस तरह की कोशिकाओं के साथ प्रयोग किया गया है के बाद से उपयुक्त electroporator सेटिंग्स का उपयोग स्तनधारी कोशिकाओं में लेबल वाले biomolecules के internalization के लिए अनुमति चाहिए, दोनों बैक्टीरिया और खमीर के लिए इस पद्धति लागू 21।

लेबल प्रोटीन internalizing करते हैं तो सभी मुक्त डाई लेबल प्रोटीन शेयर समाधान से पहले electroporation से हटा दिया जाना चाहिए। नि: शुल्क डाई अणु, की वजह से उनके छोटे आकार के, ब्याज की प्रोटीन अधिक अधिमान्यतया भाँति, और (उनकी उम्मीद तेजी से प्रसार के बावजूद) डेटा विश्लेषण के दौरान भेदभाव करने के लिए मुश्किल हो जाता है हो सकता है। बवाल लेबल प्रोटीन का एक नमूना के लिए एक गाइड, electroporation के लिए उपयुक्त होने के लिए के रूप में, मुक्त डाई शेष की राशि 2% से नीचे होना चाहिए 22 (एक एसडीएस पृष्ठ के फ्लोरोसेंट स्कैनिंग का उपयोग कर पता चला)। इस प्रक्रिया में, विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैकुछ अणुओं electroporated बैक्टीरिया या खमीर की बाहरी झिल्ली को छड़ी सकता है। इस संबंध में, नकारात्मक नियंत्रण नमूना (किसी fluorescently लेबल के biomolecules के साथ incubated और न ही electroporated नहीं किया गया है, जो कोशिकाओं, चित्रा 2) खाली कोशिकाओं की autofluorescence स्तर के रूप में आदर्श के रूप में कम electroporated कोशिकाओं की तुलना में स्पष्ट रूप से कम सेल प्रति प्रतिदीप्ति तीव्रता, प्रदर्शन करना चाहिए।

DsDNA साथ के रूप में, लेबल प्रोटीन के internalization दक्षता electroporation के लिए पूर्व कोशिकाओं को जोड़ा biomolecules के राशि से जुड़ा हुआ है। हालांकि, इस तरह के आकार और प्रभारी के रूप में अन्य मानकों, internalization में एक भूमिका निभाते हैं। छोटे प्रोटीन बड़ा प्रोटीन जबकि (चित्रा 5) 26 (98 केडीए तक) सफलतापूर्वक भली भाँति किया जा सकता है, लेकिन कम क्षमता के साथ, उच्च internalization क्षमता दिखा रहे हैं। प्रोटीन की isolelectric बिंदु, कोशिका झिल्ली के साथ संभावित बातचीत और भी अन्य भौतिक मापदंडोंelectroporation के दौरान प्रभाव सेल लोड हो रहा है। नतीजतन, उपयोगकर्ताओं लेबल प्रोटीन (> 50 माइक्रोन) के एक उच्च प्रारंभिक एकाग्रता सफल लोड करने के लिए सबसे अच्छा मौका होगा, यह जानकर कि उनकी स्वयं की व्यवस्था के लिए प्रयोगों का अनुकूलन करने की जरूरत है। Electroporation भी उपद्रव और कोशिकाओं (या तो लेबल या लेबल हटाया गया) में प्रोटीन और अन्य biomolecules शुरू करने से सेलुलर समारोह का विश्लेषण करने के लिए एक नए उपकरण प्रदान करता है। वर्तमान T7 शाही सेना पोलीमरेज़ प्रयोगों (चित्रा 5C) हम electroporation का उपयोग vivo में जीन की अभिव्यक्ति को बदल सकते हैं कि एक बायोमोलिक्यूल लागू कर सकते हैं, जहां एक प्रयोग के ऐसे एक उदाहरण है।

एकल अणु प्रतिदीप्ति प्रयोगों प्रदर्शन जब यह coverslip सतह (~ 100 एनएम) के ऊपर एक पतली धारा के भीतर रोमांचक केवल fluorophores के द्वारा सबसे अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात प्रदान करता है, के रूप में TIR रोशनी आमतौर पर अन्य रोशनी मोड पर इष्ट है। हालांकि रहने वाले सूक्ष्मजीवों के अंदर diffusing इमेजिंग में लेबल के biomolecules फिर से हो सकता हैगायकगण गहरी रोशनी (अप कोलाई के लिए 0.8 माइक्रोन के लिए)। एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात जबकि संरक्षण और गहरा रोशनी, Hilo मोड में हासिल की है। दूसरी ओर, व्यापक क्षेत्र इमेजिंग उपयोगकर्ता उच्च शक्ति लेजर के साथ एक पूरी भरी हुई सेल photobleaching और उत्पादन एकात्मक तीव्रता से प्रारंभिक सेल प्रतिदीप्ति तीव्रता विभाजित करके भाँति अणुओं की संख्या का आकलन किया जाता है, जहां कदम-वार photobleaching के विश्लेषण के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है एक अणु (एकल photobleaching से कदम, चित्रा 3) से। उनके trajectories के पूरे सेल की मात्रा को कवर किया है, भले ही widefield इमेजिंग भी ब्याज की diffusing अणुओं स्थानीयकरण के क्रम में लंबी अवधि के अणु नज़र रखने के लिए आवश्यक है।

इस प्रोटोकॉल में, हम electroporation, कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड पहुंचाने के लिए जीव और जीव रसायन के लिए एक मानक तकनीक, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट जैवअणुओं देने के लिए एक सरल विधि का गठन कैसे प्रस्तुत करते हैं। गुउपन्यास, उच्च throughput तकनीक उनके पैतृक वातावरण में लेबल के अणुओं का निरीक्षण करने के लिए एक अनूठा उपकरण प्रदान करता है। Fluorophores के तरंग दैर्ध्य की एक विस्तृत रेंज को कवर के साथ लेबल अलावा biomolecules में, इस तरह के अप्राकृतिक न्यूक्लियोटाइड और अमीनो एसिड, धातु chelators, crosslinkers, और caging समूहों के रूप में कई रासायनिक समूहों के साथ संशोधित अणुओं वितरित कर सकते हैं इलेक्ट्रोपोरेशन। ब्याज की जैविक प्रणाली सेल के विकास के लिए आवश्यक नहीं है, तो internalization के बाद मनाया प्रोटीन के intracellular प्रोटीन पूल के सभी (या सबसे) का प्रतिनिधित्व करते हैं, यह सुनिश्चित करने का लक्ष्य है प्रोटीन के लिए जीन एन्कोडिंग भी नष्ट किया जा सकता है (या खटखटाया-डाउन) । संक्षेप में, electroporation के "प्रत्यारोपण" जीवित कोशिकाओं में इन विट्रो bioconjugates के लचीलेपन और इसलिए सिंथेटिक जीव विज्ञान, सिस्टम जीव विज्ञान में प्रयास, और इन विवो एकल अणु का पता लगाने में फायदा हो सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ElectroMax DH5-alpha Comptent cells Invitrogen 11319-019 or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast.
EZ Rich Defined Madia Teknova M2105 low fluorescence rich media
MicroPulser Electroporation Apparatus  Biorad 165-2100 or any classical electroporator for microorganism transformation
Certified Molecular Biology agarose Biorad 161-3100 low fluorescence agarose for agarose pad
Microscope coverslips No 1.5 thickness Menzel BB024060SC remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h
Single-molecule fluorescence microscope Home-built described in REFs
Localization software Custom-written, available online MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. 
Tracking software Available online MATLAB implementation by Blair and Dufresne. 

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References

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Electroporation के माध्यम से रहने का सूक्ष्मजीवों में internalization और फ्लोरोसेंट biomolecules का अवलोकन
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Aigrain, L., Sustarsic, M., Crawford, R., Plochowietz, A., Kapanidis, A. N. Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation. J. Vis. Exp. (96), e52208, doi:10.3791/52208 (2015).

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