Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.
The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation.
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiæ, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.
살아있는 세포 내부의 대부분의 형광 연구는 GFP 1 형광 단백질 (FPS)와 단백질의 융합에 따라 달라집니다. 이러한 형광 태그는 유전자 발현 또는 2-7 수송 막 등의 처리에 관여하는 단백질의 카피 수, 확산 패턴 또는 지역화 연구를 허용한다. FPS는 높은 라벨 특이성, 쉬운 구현을 제공하며, 다양한 광 물리, 화학적 특성 1 변종의 큰 목록에서 사용할 수 있습니다. 그러나, 유기 형광가 큰 광 안정성에 의한 시험 관내 실험에 대한 주요 선택을 유지 (최대 FPS보다 안정적 100 배) 8, 9, 작은 크기 (더 작은 FPS보다 볼륨 100 배에) 및 분자 표지의 용이성 (주로 시스테인 잔기의 사용을 통해). 이러한 모든 요소는 단일 분자 형광에 특히 중요하며, FRET (10)을 연구합니다.
여러 국제화 메소드 COMBIN유기 라벨링 및 생체 검출 장점을 보내고 것은 지난 10 년 동안 소개되었다; 그러나, 이러한 방법은 비 천연 아미노산 (15)의 사용을 필요로하거나, 예를 들면 (대형 단일 막 진핵 세포로 제한되어, 비교적 큰 폴리펩티드 태그 (예를 들어, TMP, 할로, 또는 20 kDa의 SNAP 태그) 11-14을 사용 하나. 로드, 주사기 로딩, 미세 주입) 16 ~ 19를 긁어.
이 프로토콜은 그 생체 내 관찰과 커플 유기 형광의 새로운 장점을 간단하고 높은 처리량 내재화 방법을 설명한다. 이 기술을 개발하기 위해, 우리는 일반적으로 예컨대 E. 같은 미생물을로드하기 위해 플라스미드 DNA (20, 21)와 함께 세포를 형질 전환하는 데 사용되는 전기 천공 절차를 채택 대장균 또는 S. 유기적 표시 생체 분자와 사카로 마이 세스 세레 비시 애. 이 프로토콜은 4 간단한 단계로 구성 세포의 배양을 표시 생체 분자와,전기, 세포 복구, 세포 세척이 아닌 내면화 된 생체 분자를 제거합니다. 여기서, 우리는이 전기 프로토콜뿐만 아니라, 셀 기반 및 단일 분자의 형광을 연구하고 신호를 안달 세포 이미징 데이터 분석 및 처리를 제시한다.
전기 천공은 생체 분자 (도 1) 셀 (20, 21)를 입력 할 수있는 과도 멤브레인 기공을 형성하기 위해 낮은 이온 강도 세포 현탁액을 가로 질러 고전압 전기장 방전에 의존한다. 다만 플라스미드 DNA로 형질 전환 박테리아 또는 효모와 같은 세포는 electrocompetency을 보장하기 위해 전기 천공 전에 제조되어야한다. 이 절차는, 물과 여러 세척 단계로 이루어지는, 막 투과성을 증가시키고, 전기 천공 큐벳 내의 아킹을 피하기 위해 세포 용액의 이온 강도를 낮춘다. 이 프로토콜에서, 세포 (PROTOCOL 참조 : 1.1)을 후술하는 바와 같이 제조 될 수 있거나 또는 상업적 공급자로부터 구입의.
그림 1 : 국제화 프로토콜의 도식 표현 왼쪽에서 오른쪽으로 :. electrocompetent 세포 (이중 표지 DNA 단편이 예에서 박테리아)의 나누어지는 레이블 된 생체 분자의 몇 마이크로 리터를 추가; 얼음에 1 분 10 품어과 미리 냉장 전기의 베트로 전송; electroporate 다음 직후 세포에 0.5 ml의 다양한 매체를 추가; 세포가 복구 할 수 있도록 37 ° C (또는 유기체에 필요한 온도, 예를 들어, 효모 29 ° C)에서 배양; 임의의 과량의 비 표지 된 내면화 분자를 제거하는 세척 단계 5를 수행; PBS 버퍼와 피펫 아가로 오스 패드에 10 μL의 100 ~ 200 μL의 최종 펠렛을 재현 탁; (와이드 필드 모드 또는 힐로 모드) 형광 현미경 커버 슬립 세정 및 이미지 패드 커버.
DNA 내재화 (그림 2) 간단하지만,주의 사항은 전기를 사용하여 표지 단백질을 내면화 할 때 수행해야. 첫째, 유기적 표지 단백질의 주식 샘플은 여전히 무료 염료의 작은 비율을 포함 할 수 있습니다. 무료 염료 분자는 단백질보다 훨씬 작고, 따라서 우선적으로 내면화 될 수 있습니다. 관찰 된 내면화 형광 분자의 대다수가 관심의 단백질에 대응되도록하려면 초기 단백질 샘플은 적은 2 ~ % 이상에게 무료 염료 (그림 5) (22)를 포함해야합니다. 비 표지 된 단백질의 내재화 과량 또한 일렉트로 후 세포 외막에 찌를 수있다; 이러한 현상은 특정 단백질이며, 각 새로운 단백질에 대해 확인을받을 필요가있다. 우리는 (: PROTOCOL 3.3.3 참조)로드 셀의 샘플 비 단백질의 내재화를 제거 할 수있는 여러 옵션을 제시한다.
마지막으로, 세포를 인산 완충액의 작은 부피에 재현 탁하고 형광 현미경에 자신의 이미징을 허용 아가 패드 상으로 피펫 팅한다. 아가로 오스 패드에 고정화는 간체입니다전자 및 무결성을 해치지 않고 커버 슬립에 세포 이미징의 효율적인 방법. 패드는 낮은 형광 문화 매체를 포함해야합니다.
셀 이미징은 하나 위드의 총 내부 반사 형광 (TIRF) 또는 HILO를 사용하여 (높은 경사와 적층 광학 시트) 현미경을 수행 할 수 있습니다. 힐로 구성에서, 레이저 빔은 큰 신호 대 잡음비 (23)을 허용 위드로서는 전체 샘플을 아직 조명하지 않는,보다 TIRF 시험편 깊숙히. 사용되는 레이저 파워 및 시간 해상도에 따라, 바이오 분자 내재화는 (도 3을 단계적-photobleaching에 분석을 사용하여) 계산 국소 또는 24-28를 추적 할 수있다. 형광의 FRET 쌍으로 이중 라벨 구조의 내면화는 단일 셀 또는 단일 분자 수준 (그림 6)에서 FRET 모두의 정량화 할 수 있습니다.
다른 파라미터는 변경 될 수있다원하는 출력과 연구 생물학적 시스템에 따라 다릅니다. 첫째, 셀당 내재화 물질의 양은 종래 전기 세포 (도 2)에 첨가 표지 된 생체 분자의 농도를 변경하여 조정될 수있다. 전기 천공 전계 강도는 적재 효율 및 세포 생존 둘 다에 영향을 미친다; 예상대로 증가 전계 강도 적재 효율이 증가하면서, 일렉트로 세포의 생존율 (도 4A)을 감소시킨다. 두 매개 변수는로드의 비율을 기록 및 일렉트로 후 세포 분할함으로써 정량화 할 수있다. 형광 이미징과 함께이 생존 분석은 또한 살아있는 세포에 내재화 된 생체 분자의 관찰을 확인하고 여러 세대 (그림 4B)를 통해 지속적으로 관찰 할 수 있습니다.
요약하면,이 프로토콜은 형광 표지 된 DNA와 단백질 분자의 내면화로 할 수 있습니다대장균 또는 S. 사카로 마이 세스 세레 비시 애 (26). 유기 형광으로 표지 개별 분자 크기의 순서 이상 FPS보다 시간 척도에 대한 높은 시공간 해상도로 추적 할 수 있습니다. 마지막으로,이 방법은 위드, TIRF 및 공 초점 검출뿐만 아니라 ALEX (레이저 여기 교번 28,29)와 같은 펄스 음원 방식과 호환 가능하다.
많은 매개 변수는 셀 전기 및 데이터 수집 관심 생물학적 시스템 및 실험 (셀 레벨 또는 단일 분자 분석)의 정확한 성질에 따라 동안 변화 될 수있다. 세균 내로 DNA를 electroporating 때 예를 들어, 표지 된 dsDNA 단편의 0.25-5 pmol의이 (미리 photobleaching에 대한 필요없이, 즉.) 직접 단일 분자 검출을 허용하는 내재화 낮은 효율에 이르게. 5 pmol의 dsDNA보다도 무겁게 단일 세포 – 세포 분석을위한 체계가 더 적합로드되는 경향이있다. 표지 된 DNA는 모든 이전에 겔 – 정제 된 자유 염료의 흔적을 제거하기 위해 있어야 DNA 스톡 용액으로부터 (형광 비 반응). 게다가, 특히 smFRET 실험에 대한 DNA 저하, 잠재적 인 문제, 부 자연스러운 핵산, 또는 머리 핀의 자형 루프로 엑소 뉴 클레아 접근 말단을 보호 모티브의 DNA를 사용하여 해결할 수 있습니다.
또 다른 adjustabl일렉트로 목록 매개 변수는 E 일렉트로 동안인가 전계 강도이다. 낮은 전계 강도 (~ 1 kV의 / cm)는 단일 분자 연구에 적합한 낮은 부하 효율로 이어질 것입니다. (1.8 kV로 / cm까지) 더 높은 전기장 세기가 적재 효율을 증가시킬 것이다; 그러나, 전기 천공 후 전기장 세기 및 세포 생존율 사이의 역 상관 관계가있다 (도 4 참조). 참고로, 박테리아, 효모 및 전기 천공에 사용되는 통상의 전계 강도는 ~ 1.5 kV로 / cm이다. 시정 방울 즉시 임의의 아킹 현상이 발생 큐벳으로 보낸이 붕괴의 길이를 나타내는 시간 상수는, 따를 편리한 파라미터이다. 정상 설정에서 시간 상수는 4 밀리 초보다 커야한다; 낮은 값은 낮은 부하 효율 또는 비로드 손상된 세포로 이어질 것입니다. 대부분의 electroporators 모두 조정 수정할 수 있습니다 (예 : "펄스 절단"또는 "펄스 모양"등의) 자유의 다른 학위를 제공셀 로딩과 생존. 그러나 우리는 유사한 절차 또한 멤브레인 (단일 지질 이중층) 실제로는 덜 복잡하고 전기부터 이미 세포와 함께 사용되어 있기 때문에 적절한 electroporator 설정을 사용하여 포유 동물 세포에 표지 된 생체 분자의 내면화를 허용해야합니다, 모두 박테리아와 효모에이 방법을 적용 (21).
표지 단백질을 내면화 할 때, 모두 무료 염료 표지 단백질 원액 이전 전기에서 제거해야합니다. 자유 염료 분자가, 그들의 더 작은 크기에, 관심있는 단백질의 내재화를 통해 우선적으로, 그리고 (자신의 확산에도 불구하고 예상 빠른) 데이타 분석에서 구별하는 것이 어려울 수있다. 유기적 표지 단백질의 샘플에 대한 설명서는, 전기 천공에 적합하도록, 자유 염료 잔량이 2 % 미만이어야 22 (SDS-PAGE의 형광 주사를 사용하여 검출). 이 프로세스는 특히 중요일부 분자는 일렉트로 세균이나 효모의 외막에 충실 할 수있다. 이러한 관점에서, 음성 대조군 샘플 (임의 형광 표지 된 생체 분자와 함께 배양이나 전기 천공되지 않은 세포도 2) 빈 셀의 자기 형광도 수준 이상적으로 낮은 전기 천공 세포보다 분명히 낮은 셀당 형광 강도를 표시한다.
dsDNA와 마찬가지로, 표지 단백질의 내재화 효율 일렉트로 이전 세포에 첨가 된 생체 분자의 양에 연결된다. 그러나, 이러한 크기 및 전하와 같은 다른 파라미터들은, 내재화의 역할을한다. 작은 단백질은 더 큰 단백질 반면 (그림 5) (26) (98 kDa의까지) 성공적으로 내면화 될 수 있지만, 낮은 효율, 높은 국제화 효율을 나타낸다. 단백질 isolelectric 점, 세포막 전위와의 상호 작용 또는 다른 물리 화학적 및 파라미터전기 동안 영향 셀 로딩. 그 결과, 사용자는 표지 단백질 (> 50 μM)의 높은 초기 농도가 성공적으로 로딩을위한 최고의 기회를 줄 것이다 것을 알고, 자신의 시스템에 대한 실험을 최적화해야합니다. 전기도 교란 및 세포 (중 레이블 또는 레이블)에 단백질 등의 생체 분자를 도입하여 세포의 기능을 분석 할 수있는 새로운 도구를 제공합니다. 본 T7 RNA 폴리머 라제의 실험 (도 5C) 우리는 전기를 이용하여 생체 내에서 유전자 발현을 변경 생체 분자를 도입 할 수있다 등의 실험 예.
단일 분자 형광 실험 수행 때 커버 슬립면 (~ 100 ㎚) 상기 얇은 섹션 내 흥분 만 형광 의해 최상의 신호 대 잡음비를 제공하는 것처럼, TIR 조명은 일반적으로 다른 조명 모드를 통해 선호된다. 그러나 살아있는 미생물의 내부 확산 영상 표시 생체 분자는 다시 수첩 깊은 조도 (최대 E. 콜라이 0.8 ㎛이다). 높은 신호 대 잡음비를 유지하면서 깊은 조명은, 힐로 모드에서 달성된다. 한편, 넓은 시야의 촬상은 사용자가 높은 레이저 파워와 전체로드 셀 photobleaching에 및 생산 단위의 강도에 의해 초기 셀 형광 강도로 나누어 내재화 분자의 수를 예상된다 단계적 광표백 분석에 특히 중요 단일 분자 (단일 광표백 단계, 그림 3)에 의해. 그 궤적이 셀 전체 볼륨을 커버해도 위드 촬상 또한 관심 분자 확산 지역화하기 위하여 장기간 추적 분자 요구된다.
이 프로토콜에서, 우리는 전기, 세포에서 핵산을 전달하기위한 생물학 및 생화학의 표준 기법은 다양한 세포 유형에서 형광 생체 분자를 전달하기위한 간단한 방법을 구성하는 방법을 제시한다. 목소설, 높은 처리량 기술은 그 나라의 환경 표지 분자를 관찰 할 수있는 독특한 도구를 제공합니다. 형광 물질은 넓은 파장 범위를 포함 표지 또한 생체 분자에있어서, 이러한 비 천연 뉴클레오타이드 및 아미노산, 금속 킬레이트 제, 가교제, 및 caging 기 등 많은 화학 기, 변성 분자를 제공 할 수있는 전기. 관심있는 생물학적 시스템 세포 발달에 필수적이지 않으면 내재화 후 관찰 된 단백질은 세포 내 단백질 풀의 모든 (또는 대부분의) 표현을 보장, 표적 단백질을 코딩하는 유전자는 또한 삭제 될 수있다 (또는 노크 다운) . 본질적으로, 전기는 "이식"살아있는 세포로 체외 bioconjugates의 유연성 때문에 합성 생물학, 시스템 생물학에 노력하고, 생체 내 단일 분자 검출을 혜택을 누릴 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
We thank Stephan Uphoff for discussions.
R.C. was supported by Linacre College, Oxford University. A.P. was supported by the German Academic Exchange Service (DAAD), the German National Academic Foundation and EPSRC. M.S. was supported by the Wellcome Trust. A.N.K. was supported by a UK BBSRC grant (BB/H01795X/1), and a European Research Council Starter grant (261227).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
ElectroMax DH5-alpha Comptent cells | Invitrogen | 11319-019 | or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast. |
EZ Rich Defined Madia | Teknova | M2105 | low fluorescence rich media |
MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | or any classical electroporator for microorganism transformation |
Certified Molecular Biology agarose | Biorad | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
Microscope coverslips No 1.5 thickness | Menzel | BB024060SC | remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h |
Single-molecule fluorescence microscope | Home-built | described in REFs | |
Localization software | Custom-written, available online | MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. | |
Tracking software | Available online | MATLAB implementation by Blair and Dufresne. |