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Medicine

Oncolytic वायरस के पूर्व नैदानिक ​​मूल्यांकन के लिए अध्ययन में कपास चूहा की हैंडलिंग

doi: 10.3791/52232 Published: November 24, 2014

Introduction

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Oncolytic वायरस (OV) चुनिंदा सामान्य और ट्यूमर कोशिकाओं 1,2 के बीच जैव रासायनिक मतभेद शोषण से ट्यूमर कोशिकाओं में पेश करता है। के रूप में स्वाभाविक रूप से जंगली प्रकार के वायरस के लिए भेजा चयनात्मक oncolysis प्राप्त करने के लिए एक परिवर्तन की आवश्यकता नहीं है कि उन लोगों के लिए, और चयनात्मक oncolysis को प्राप्त करने के लिए इंजीनियर किया जाना चाहिए जो उन: OVS के दो प्रकार के होते हैं। एक दिया ट्यूमर के प्रकार के भीतर म्यूटेशन का संग्रह एक OV 2 के लिए सामान्य कोशिकाओं से अधिक चयनात्मक विकास लाभ की प्रकृति को निर्धारित करता है। का उपयोग कर OVS की सुरक्षा और लाभ क्लिनिकल परीक्षण 3-7 में प्रदर्शन किया गया है। Oncolytic virotherapy के क्षेत्र में प्रगति के बावजूद बेहतर मॉडल OVS की अर्बुदरोधी प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने की जरूरत है, सुझाव है कि पूर्व नैदानिक ​​और नैदानिक ​​परिणामों के बीच अंतराल वहाँ मौजूद हैं।

गोजातीय दाद वायरस टाइप 1 (BHV-1) एक Herpesviridae परिवार के सदस्य है, और Alphaherpesviridae उपपरिवार है। BHV-एक initiates एक बुरा ठंड 8,9 जैसी लक्षणों की एक विस्तृत विविधता में प्रकट, पशुओं में सांस की बीमारी जटिल गोजातीय। BHV-एक ऐसे heparan सल्फेट और nectin-1 के रूप में 10 एचएसवी -1 द्वारा इस्तेमाल के लिए लगाव और प्रवेश रिसेप्टर्स, बांधता है। हालांकि, यह nectin-2 10 के स्थान पर CD155 बांधता है। BHV-1 यह कुशलता से प्रवेश करने और सामान्य और तब्दील murine कोशिकाओं 3,4,10 में प्रतिकृति आरंभ करने में असमर्थ है कि इस तरह के एक बहुत ही संकीर्ण मेजबान रेंज है। इस पारंपरिक murine मॉडल का उपयोग समस्याग्रस्त बनाता है। BHV-1 के oncolytic क्षमता विट्रो 11,12 में प्रदर्शन किया गया है। BHV-एक स्तन कैंसर की कोशिकाओं और स्तन कैंसर की शुरुआत कोशिकाओं 11,12 सहित ऊतकीय मूल की एक किस्म से मानव ट्यूमर कोशिकाओं में प्रतिकृति शुरू करने और मारने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, BHV-1 के अर्बुदरोधी क्षमता एक असुरक्षित मेजबान के संदर्भ में vivo में मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

मानव Adenovirus (विज्ञापन), जिसके लिए57 की पहचान की सीरमप्रकारों सबसे आम तौर पर मनुष्यों में सांस की बीमारी का कारण बनता है, वहाँ रहे हैं। Oncolytic विज्ञापन वैक्टर कई क्लिनिकल परीक्षण 13-15 में आगे बढ़ने के साथ उनके अर्बुदरोधी प्रभावकारिता के लिए मूल्यांकन किया गया है। होनहार पूर्व नैदानिक ​​डेटा के बावजूद, नैदानिक ​​परिणाम उम्मीदों से कम गिर गया है। वे वायरस 16,17 करने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया तनु एक्ज़िबिट हालांकि मानव ट्यूमर xenograft मॉडल आम तौर पर, विज्ञापन वैक्टर अर्बुदरोधी प्रभावकारिता अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इसके अलावा, syngeneic murine मॉडल, विज्ञापन संक्रमण के लिए गैर-अनुमोदक हैं 17,18 अव्यावहारिक इन मॉडलों का उपयोग करते हुए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मूल्यांकन कर रही है।

मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली OVS ट्यूमर कोशिका मृत्यु 19 बटोर जिसके द्वारा सबसे प्रभावशाली तंत्र के रूप में पहचान की गई है। Tolerized और गैर tolerized ट्यूमर जुड़े प्रतिजन के बीच अर्बुदरोधी प्रतिक्रियाओं (TAA) मॉडल भिन्न होते हैं और बहुत OV चिकित्सा की सफलता को प्रभावित कर सकते हैं। एचएसवी -1 OV KM100 (ICP0 n21220) 20,21 1814 में VP16 एक murine Polyoma मध्य टी प्रतिजन स्तन कैंसर मॉडल 22 में ट्यूमर असर चूहों के 80% में ट्यूमर प्रतिगमन हासिल। हालांकि, उसके-2 / Neu मॉडल में, KM100 की अर्बुदरोधी प्रभावकारिता ट्रांसजेनिक में syngeneic चूहों में 20% पूरा प्रतिगमन और ट्यूमर ठहराव के बीच विभिन्न चूहों HER2-tolerized। एक साथ इन डेटा पूरी तरह से सबसे अच्छा पूरी तरह से चिकित्सीय सफलता का निर्धारण क्या विशेषताएं समझने के लिए मानव प्रतिरक्षा परिदृश्य पुनरावृत्ति कि पशु मॉडल का उपयोग कर OVS के मूल्यांकन के महत्व पर प्रकाश डाला।

(5 में समीक्षा के रूप में) उत्तर और दक्षिण अमेरिका के लिए स्वदेशी कपास चूहा (Sigmodon hispidus), सबसे अधिक श्वसन syncytial वायरस के संक्रमण की एक मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है। वे 6,23 जटिल गोजातीय सांस की बीमारी के साथ जुड़े विकृति पुनरावृत्ति के रूप में कपास चूहों भी विरोधी BHV -1 टीकाकरण अनुसंधान में इस्तेमाल कर रहे हैं। कपास चूहों के अलावा, BHV -1 संक्रमण, immunogenic है निरंतर श्लैष्मिक और प्रणालीगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 6,23-25 ​​उत्प्रेरण। सेल लाइनों सहज fibrosarcoma और स्तन ग्रंथि (LCRT) और हड्डी (सीसीआरटी और VCRT) क्रमश: 26 की osteosarcomas से प्राप्त किया गया है। कपास चूहों वे विज्ञापन संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं के रूप में oncolytic विज्ञापन वैक्टर के vivo प्रभावकारिता का मूल्यांकन और मनुष्यों 27-29 के समान विकृति प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। OVS के पूर्व नैदानिक ​​मूल्यांकन के लिए प्रतिरक्षा अक्षमता मॉडल के उपयोग से न केवल उपचार के लिए नैदानिक ​​प्रतिक्रियाओं की कम संकेत कर रहे हैं, लेकिन वे oncolytic virotherapy 30,31 में खाते में प्रतिरक्षा प्रणाली की भूमिका को ले पाते। इसलिए, syngeneic और स्तन कार्सिनोमा और ऑस्टियो सार्कोमा के ट्यूमर tolerized कपास चूहे मॉडल पारंपरिक murine मॉडल का उपयोग कर अध्ययन नहीं किया जा सकता है, जो इस तरह के BHV-1 के रूप में OVS, और विज्ञापन के पूर्व नैदानिक ​​प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने में जो प्रासंगिक मॉडल हैं।

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Protocol

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नोट: इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल पशु की देखभाल के दिशा-निर्देशों पर कनाडा परिषद के अनुसार मैकमास्टर विश्वविद्यालय में हमारे संस्थागत पशु रिसर्च एथिक्स बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया है। प्रयोगों मैकमास्टर विश्वविद्यालय के केन्द्रीय जानवरों की सुविधा में प्रदर्शन किया गया।

1. संवर्धन LCRT प्रकोष्ठों

  1. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में संस्कृति LCRT कोशिकाओं 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 मिमी एल glutamine, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक। 37 डिग्री सेल्सियस पर टी-150 टिशू कल्चर बोतल में कोशिकाओं को बनाए रखने और 5% सीओ 2। बीतने कोशिकाओं वे एक 90% मिला हुआ monolayer (हर 2-3 दिन, चित्रा 1) के रूप में करते हैं।
  2. पूर्व गर्म 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), कोशिकाओं बंटवारे से पहले 10 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 1x trypsin और मध्यम।
  3. महाप्राण कुप्पी से मध्यम और 1x पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं कुल्ला।
  4. Rinsing के बाद, पीबीएस महाप्राण और सेतेकोशिकाओं तक 1x trypsin के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं कुप्पी (~ 2 मिनट) से अलग कर देना।
  5. धीरे और (10 मिलीलीटर सेल निलंबन की कुल के लिए) 8 मिलीलीटर माध्यम में Resuspend कोशिकाओं कोशिकाओं के clumps को तोड़ने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट और।
  6. पक्ष की धीरे तरफ से और रॉक कुप्पी (टी 150 प्रति 25 मिलीलीटर की कुल के लिए) 24 मिलीलीटर माध्यम में 1 मिलीलीटर सेल निलंबन बोने से एक टी 150 फ्लास्क में कोशिकाओं को बनाए रखने। अगले विभाजन तक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को बनाए रखने।

2. LCRT कोशिकाओं में वायरस नकल और cytotoxicity का आकलन

  1. वायरस नकल
    नोट: इस तरह के अंतर्जात वायरल प्रमोटरों के नियंत्रण में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के रूप में एक फ्लोरोसेंट टैग व्यक्त वायरस निर्माणों, वायरस के संक्रमण के दृश्य को सुविधाजनक बनाने और प्रतिदीप्ति प्लेट पाठकों का उपयोग कर फैल गया।
    1. गणना के लिए एक अच्छी तरह से छोड़ने संस्कृति प्लेटों में बीज LCRT कोशिकाओं,। बीज कोशिकाओं जैसे कि वे एक दिन बाद 80-90% मिला हुआ हो जाएगा। 10 5 सेल के एक एकाग्रता का प्रयोग करेंLS / एमएल (अच्छी तरह से प्रति 100 μl) 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेटों में एक दिन बाद वांछित confluency निर्माण करने के लिए।
    2. अगले दिन, पूर्व गर्म 1x पीबीएस, 1x ट्रिप्सिन, 10 मिनट के लिए पूर्व प्रयोग शुरू करने के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पूर्ण और सीरम मुक्त मध्यम।
    3. अच्छी तरह से की सतह पर यह कमाल द्वारा 1x पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से गिनती और कुल्ला कोशिकाओं से महाप्राण मध्यम।
    4. Rinsing के बाद, कोशिकाओं तक 1x trypsin के 2 मिलीलीटर के साथ महाप्राण पीबीएस और सेते कोशिकाओं कुप्पी (~ 2 मिनट) से अलग कर देना।
    5. एक hemocytometer का उपयोग गणनीय सीमा के भीतर एक सेल घनत्व उपज के लिए पूरा मध्यम की उचित मात्रा में कोशिकाओं Resuspend। एक सटीक सेल गिनती सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से पहले ऊपर और नीचे pipetting द्वारा hemocytometer का inoculating सेल निलंबन मिश्रण।
    6. संक्रमण के वांछित बहुलता (MOI) में संक्रमण के लिए आवश्यक वायरस शेयर की मात्रा निर्धारित करते हैं।
      इकाइयों के गठन आवश्यक Paque (pfu) = चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या * MOI(Pfu / सेल)
      वायरस शेयर की मात्रा की आवश्यकता = आवश्यक pfu / वायरस शेयर अनुमापांक (pfu / एमएल)
    7. ट्यूबों में सीरम मुक्त माध्यम में वायरस inoculum तैयार करें। कोशिकाओं को inoculum जोड़ने से पहले vortexing या pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
    8. जिसके बाद DMEM + 1% FBS की एक रखरखाव ओवरले लागू, 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को संक्रमित।
    9. स्कैन प्लेटें एक और दो दिनों के बाद संक्रमण (पीआई) GFP प्रतिदीप्ति कल्पना करने के लिए।
  2. वायरस cytotoxicity
    नोट: यौगिक सहज है के रूप में कम प्रकाश स्थितियों के तहत resazurin cytotoxicity परख प्रदर्शन करते हैं। एक अच्छी तरह से युक्त मध्यम केवल पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए सही करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए।
    1. 1x पीबीएस में resazurin के 5% (वी / वी) समाधान तैयार है। Pipetting द्वारा समाधान मिलाएं।
    2. कोशिकाओं से महाप्राण मध्यम और 5% resazurin समाधान लागू होते हैं। एक अच्छी तरह से युक्त मध्यम केवल पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए सही करने के लिए शामिल करें।
    3. 37 पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते डिग्री सेल्सियस, के बादजो एक प्रतिदीप्ति प्लेट पाठक (उत्तेजना 530 एनएम, उत्सर्जन 595 एनएम) का उपयोग कर प्रतिदीप्ति पढ़ें।
    4. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए संशोधन असंक्रमित नियंत्रण करने के लिए डेटा रिश्तेदार का विश्लेषण करें।

3. आवास और हैंडलिंग

  1. आवास और आहार
    1. हाउस कपास चूहों को व्यक्तिगत रूप से कृंतक बिस्तर (1/8 "corncob बिस्तर), अब संवर्धन के रूप में 8 इंच और nestlets से पीवीसी टयूबिंग (चित्रा 2) के एक वर्ग युक्त पॉली कार्बोनेट चूहे पिंजरों में में लड़ कम करने के लिए।
    2. ज़्यादा पिंजरे के बैठने के लिए और कृंतक भोजन और एक पानी की बोतल शामिल करने के लिए एक योग्य इस्पात टोकरी का प्रयोग करें।
      नोट: इस पिंजरे सेटअप अत्यंत महत्व के पिंजरे होने का अंत खिलाफ संवर्धन ट्यूब के स्थान के साथ, पशुओं के लिए सुरक्षित और आसान कब्जा करने के लिए अनुमति देगा।
  2. हैंडलिंग
    1. जानवरों की सुविधा तकनीशियनों द्वारा राउंड के लिए पहले से पहले रोमांचक बचने के लिए उन्हें सुबह में कपास चूहों संभालएक प्रक्रिया।
    2. सभी प्रक्रियाओं के दौरान सुरक्षा के लिए मोटी चमड़े के दस्ताने पहनते हैं।
    3. जानवरों के लिए मुख्य रूप से संवर्धन ट्यूबों में रहने के रूप में, नियमित सफाई के दौरान एक नए पिंजरे में चूहों स्थानांतरित करने के लिए उन्हें इस्तेमाल करते हैं। वैकल्पिक रूप से, हैंडलर में उनके हाथ तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए थोड़ा पिंजरे खुला, जानवर तो बस कंधे से ऊपर त्वचा scruffing और नीचे धकेलने के द्वारा रोका जा सकता है। पशु उनकी जीभ काट सकता है के रूप में अभ्यास देखभाल अत्यधिक बल का उपयोग करने के लिए नहीं।
    4. धीरज रखो और जानवरों के एक मजबूत उड़ान या लड़ाई प्रतिक्रिया है और चल रहा है और पिंजरे से बाहर कूद कर कब्जा से बचने की कोशिश करेंगे के रूप में एक स्थिर हाथ का उपयोग करें। Degloving हो जाएगा के रूप में महत्वपूर्ण, पूंछ द्वारा जानवरों को संभाल नहीं है।
    5. ट्रैप प्रत्यक्ष हैंडलिंग पर उनके संवर्धन के ट्यूब में पशुओं। यह काफी चोटों और भागने घट जाती है।

4. कैद और संज्ञाहरण

  1. कैद
    1. रक्षा के लिए मोटी चमड़े के दस्ताने पहनेंसभी प्रक्रियाओं के दौरान आयन।
    2. हवा और एक ढक्कन, कंटेनर और गैस उत्पादन नली (चित्रा 3) के लिए फिट एक नाक शंकु फिट करने के लिए काफी बड़े एक संवेदनाहारी प्रेरण कक्ष के लिए छेद के साथ एक बड़े स्पष्ट प्लास्टिक कंटेनर का प्रयोग करें।
    3. प्रक्रिया को और अधिक कुशल बनाने के लिए और isoflurane, एक साँस लेना संवेदनाहारी के लिए जानवरों का जोखिम समय को कम करने के जोड़े में काम करते हैं। यकीन है कि एक शोधकर्ता बनाओ (हैंडलर # उद्घाटन और पिंजरे पर स्टील कवर की जगह और प्रेरण चैम्बर के ढक्कन (1 हैंडलर #) के लिए जिम्मेदार है और उनके सहयोगी प्रेरण चैम्बर के लिए ट्यूब और परिवहन में पशुओं के कब्जा करने के लिए जिम्मेदार है 2)।
    4. एक सपाट सतह पर पिंजरे प्लेस और बाहरी ढक्कन हटा दें। थोड़ा इस्पात फ़ीड ट्रे उठा और उसे पिंजरे के पक्षों के साथ और पीछे के खिलाफ समानांतर है तो धीरे धीरे संवर्धन ट्यूब छल। यदि आवश्यक हो, पशु आंदोलन से बचने के लिए पिंजरे खोलने के बिना संवर्धन ट्यूब पैंतरेबाज़ी करने के लिए एक वस्तु का उपयोग करें (संभालR # 1)।
    5. जानवर उत्तेजित हो जाता है और ट्यूब छोड़ देता है, तो जानवर और आराम के लिए एक बार फिर ट्यूब (हैंडलर # 1) में बसने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति।
    6. धीरे धीरे और जानबूझकर पिंजरे के साथ संपर्क में दूसरे छोर रखते हुए, संवर्धन ट्यूब से स्टील कवर दूर के किनारे उठा। प्लास्टिक कंटेनर (2 हैंडलर #) के लिए पर्याप्त एक अंतरिक्ष बड़े बनाओ।
    7. एक चिकनी, त्वरित गति में, संवर्धन ट्यूब के ज़्यादा प्लास्टिक कंटेनर धक्का। ट्यूब में पशु फँसाने, पिंजरे के पक्ष के साथ कंटेनर के संपर्क बनाए रखें। संभव है (हैंडलर # 2) के रूप में जल्दी चरणों 4.1.6 और 4.1.7 प्रदर्शन करते हैं।
    8. इस्पात फ़ीड ट्रे निकालें और # 2 (हैंडलर # 1) हैंडलर के लिए प्लास्टिक कंटेनर ढक्कन दे। इस प्रक्रिया में फंस जानवर उपांग के प्रति जागरूक किया जा रहा है, पिंजरे और कंटेनर के पक्ष के बीच प्लास्टिक के ढक्कन स्लाइड। इस अगले कदम के लिए अधिक मुश्किल कर देगा के रूप में कंटेनर सील मत (हैंडलर # 2)।
  2. Anesthesआइए
    1. सुनिश्चित करें कि कंटेनर बंद रहता बनाओ और प्रेरण चैम्बर के लिए पशु परिवहन। जल्दी कक्ष में जानवरों की जगह और एक द्रव गति (हैंडलर # 2) में कंटेनर ढक्कन हटा दें। खोलें और तुरंत प्रेरण कक्ष ढक्कन की जगह (हैंडलर # 1)।
    2. प्रेरण कक्ष (/ मिनट 5 एल) के लिए isoflurane के प्रवाह पर मुड़ें और जल्दी से गैस परिसंचरण की सुविधा के लिए प्रेरण कक्ष से दोनों को हटाने ट्यूब और कंटेनर से पशु स्लाइड बात जिस पर सुस्ती के संकेत के लिए जानवरों की निगरानी।
    3. चूहा पूरी तरह anesthetized है, जब काम कर सतह के लिए यह कदम और नाक शंकु (चित्रा 3) में नाक और मुंह जगह है। चूहा पूरी तरह से यह एक सशक्त पैर के अंगूठे चुटकी करने के लिए अनुत्तरदायी है जब anesthetized है।
    4. सूखापन और abrasions रोकने के लिए पशु की आंखों पर पशु चिकित्सक वेसिलीन नेत्र मरहम रखें। इस कपास चूहों चोट होती है तो संक्रमण होने का खतरा हो सकता है कि बड़ी आँखें है के रूप में एक आवश्यक कदम है।
    5. <ली> ध्यान से नजर रखने और एक निरंतर श्वसन दर को बनाए रखने और जानवर की नाक प्रक्रिया के दौरान फिटिंग नाक शंकु में रहता है कि सुनिश्चित करते हैं। उचित isoflurane के प्रवाह दर को समायोजित करें। isoflurane की राशि प्रत्येक जानवर अलग अलग होंगे anesthetize करने की आवश्यकता है।
    6. बाद प्रक्रिया अपने पिंजरे में पशु लौटने और यह पूर्ण गतिशीलता और sternal अवलंबन आ जाता है।

चमड़े के नीचे ट्यूमर गठन के लिए LCRT प्रकोष्ठों के 5. तैयारी

नोट: LCRT में से एक टी-150 कुप्पी (90 confluency%) लगभग 2 10 x 7 कोशिकाओं पैदावार। जरूरत कोशिकाओं की कुल संख्या पर आवश्यक टी-150 बोतल की संख्या के आधार पर। प्राप्त की है आवश्यक कोशिकाओं की कुल संख्या सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त बोतल बीज और तैयारी और अतिरिक्त इंजेक्शन की जरूरत के लिए उन के दौरान खो कोशिकाओं को समायोजित करने के लिए। सेल व्यवहार्यता को लम्बा करने के लिए जब भी संभव बर्फ पर कोशिकाओं रखें।

  1. कुप्पी एक से कोशिकाओं, महाप्राण मध्यम फसल के लिए1x पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ डी कुल्ला कोशिकाओं।
  2. महाप्राण पीबीएस और कोशिकाओं कुप्पी (~ 2 मिनट) से अलग कर देना जब तक 1x trypsin के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
  3. धीरे और (10 मिलीलीटर सेल निलंबन की कुल के लिए) 8 मिलीलीटर माध्यम में Resuspend कोशिकाओं कोशिकाओं के clumps को तोड़ने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट और। अतिरिक्त बोतल से कोशिकाओं फसल के लिए आगे बढ़ें।
  4. एक शंक्वाकार ट्यूब, 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के अनुसार लगभग चार टी-150s में सभी सेल निलंबन पूल।
  5. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 160 x जी पर ट्यूब।
  6. महाप्राण मध्यम और एक hemocytometer का उपयोग गणनीय सीमा के भीतर एक सेल घनत्व उपज के लिए पीबीएस की उचित मात्रा (टी 150 प्रति 10 मिलीलीटर पीबीएस) में सेल गोली resuspend। एक सटीक सेल गिनती सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से पहले ऊपर और नीचे pipetting द्वारा hemocytometer का लोड करने के लिए सेल निलंबन मिश्रण।
  7. कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना:
    कोशिकाओं की कुल संख्या = सेल गिनती (कोशिकाओं / एमएल) काटा एक्स मेजबान मात्रा (एमएल)
  8. निर्धारित बनाने के लिएसभी इंजेक्शन के लिए आवश्यक सेल निलंबन की मात्रा। प्रयोग के प्रति 2-3 अतिरिक्त खुराक बनाओ। Subcutaneously इंजेक्शन के 5 एक्स 10 5 LCRT कोशिकाओं की कुल 3-4 दिनों के भीतर स्पष्ट ट्यूमर बनेगी।
    आवश्यक कोशिकाओं की कुल संख्या = 5 x 10 5 कोशिकाओं एक्स खुराक की कुल संख्या
    मात्रा सेल निलंबन की आवश्यकता (माले) = (* राशि इंजेक्शन संस्करणों के लिए आवश्यक कुल कोशिकाओं) / (काटा कोशिकाओं की कुल संख्या)
  9. Pipet आवश्यक पीबीएस युक्त एक शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन की मात्रा और मिश्रण अच्छी तरह से। Eppendorf ट्यूबों में विभाज्य व्यक्ति इंजेक्शन (100 μl)। इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर ट्यूबों बनाए रखें।

6. इंजेक्शन

नोट: एक, जबकि अन्य पर नज़र रखता है जानवर श्वसन दर और सामान्य हालत जबकि संज्ञाहरण के तहत इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए, दो शोधकर्ताओं के साथ प्रक्रियाओं का प्रदर्शन। सभी इंजेक्शन और एक नई सुई के लिए के लिए इंसुलिन सीरिंज (29 जी 0.3 मिलीलीटर, '1/2 x) का उपयोग करेंप्रत्येक जानवर।

  1. चमड़े के नीचे इंजेक्शन
    1. पर कब्जा है और पशु (धारा 4) anesthetize।
    2. क़ैंची का उपयोग इंजेक्शन साइट दाढ़ी। कपास चूहा फर मोटी है और इंजेक्शन के लिए एक चिकनी सतह प्राप्त करने के लिए एक तेज trimmer की आवश्यकता है। एक कपास झाड़ू का उपयोग कर 70% इथेनॉल के साथ इंजेक्शन साइट को साफ और इसे आगे बढ़ने से पहले पूरी तरह से लुप्त हो जाना करने की अनुमति।
    3. धीरे धीरे और लगातार ऊपर ड्राइंग द्वारा कोशिकाओं के साथ लोड सीरिंज (29 जी एक्स 1/2 ', 0.3 मिलीग्राम)। बुलबुले कुछ बल के साथ सिरिंज स्पष्ट झाड़ रहे हैं। बुलबुले शीर्ष धक्का पर कर रहे हैं एक बार तरल तक सवार सुई के शीर्ष पर है।
    4. (त्वचा tenting के रूप में करने के लिए कहा गया है) इंजेक्शन स्थल पर त्वचा लिफ्ट और सुई उठाव तरफ ऊपर डालें। सुनिश्चित करें कि सुई intramuscularly इंजेक्शन लगाने से बचने के लिए त्वचा के नीचे स्वतंत्र रूप से चलता रहता है बनाओ।
    5. समान रूप से और धीरे धीरे सिरिंज की सामग्री को निष्कासित। नीचे सुई उठाव की ओर वापस ले लें।
  2. Intratumoral इंजेक्शन
    1. कैप्चर एकजानवर (धारा 4) anesthetize चाहते हैं।
    2. एक कपास झाड़ू का उपयोग कर 70% इथेनॉल के साथ इंजेक्शन साइट को साफ और इसे आगे बढ़ने से पहले पूरी तरह से लुप्त हो जाना करने की अनुमति।
    3. एक ईमानदार स्थिति में सुई धारण करते हुए धीरे धीरे और लगातार ऊपर ड्राइंग द्वारा वायरस inoculum के साथ लोड सीरिंज (29 जी 0.3 मिलीलीटर, '1/2 x)। बुलबुले कुछ बल के साथ सिरिंज स्पष्ट झाड़ रहे हैं। बुलबुले शीर्ष धक्का पर कर रहे हैं एक बार तरल सुई के शीर्ष पर है तब तक सवार।
    4. ट्यूमर में सुई उठाव तरफ ऊपर डालें और आंशिक रूप से ट्यूमर के पंगु बनाना रोकने के लिए हर आंदोलन से पहले सुई वापस लेने, एक प्रशंसक की तरह पैटर्न में सुई घूम रहा है, जबकि समान रूप से और धीरे धीरे सिरिंज की सामग्री को निष्कासित। नीचे सुई उठाव की ओर वापस ले लें।
      नोट: चमड़े के नीचे LCRT ट्यूमर तेजी से बढ़ती 5-7 दिनों में लगभग 100 मिमी 3 तक पहुंच गया है। इसके अलावा, परिगलित और रक्तस्रावी केन्द्रों अक्सर कई दिनों के भीतर ट्यूमर की सतह पर फार्म और सीए की आवश्यकता होती हैREFUL निगरानी (चित्रा 4)।
  3. Intraperitoneal इंजेक्शन
    1. पर कब्जा है और पशु (धारा 4) anesthetize।
    2. कपास swabs का उपयोग कर 70% इथेनॉल के साथ इंजेक्शन साइट को साफ और इसे आगे बढ़ने से पहले पूरी तरह से लुप्त हो जाना करने की अनुमति।
    3. धीरे धीरे और लगातार ऊपर ड्राइंग द्वारा दवा के साथ लोड सीरिंज (29 जी 0.3 मिलीलीटर, '1/2 x)। बुलबुले कुछ बल के साथ सिरिंज स्पष्ट झाड़ रहे हैं। बुलबुले शीर्ष धक्का पर कर रहे हैं एक बार तरल सुई के शीर्ष पर है तब तक सवार।
    4. पेट के दाहिने कम वृत्त का चतुर्थ भाग में सुई डालें। रक्त या मल aspirated नहीं कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए वापस सवार पर खींचो, इस सुई की गलत नियुक्ति इंगित करता है। यदि ऐसा होता है, सुई को वापस लेने और एक नई सिरिंज तैयार करते हैं। सुई को सही ढंग से रखा जाता है, समान रूप से और धीरे धीरे सिरिंज की सामग्री को निष्कासित।

7. ट्यूमर छांटना और Necropsy

  1. इकट्ठा और अल साफ70% इथेनॉल से पहले जानवर की इच्छामृत्यु करने के साथ एल उपकरण।
  2. वांछित विधि द्वारा पशु euthanize, सीओ 2 साँस लेना (5-10 मिनट के लिए / मिनट 2 एल) की सिफारिश की है। शरीर की स्थिति में किसी भी असामान्यताओं के लिए जानवरों की जांच करते हैं।
  3. एक विच्छेदन बोर्ड पर पृष्ठीय लेटना में पशु प्लेस और 70% इथेनॉल के साथ पशु साफ।
  4. पेट के निचले हिस्से में त्वचा लिफ्ट करने के लिए चिमटी का प्रयोग करें। कैंची का उपयोग त्वचा और मांसपेशियों के माध्यम से कट और जानवर की लम्बाई (ठोड़ी को गुदा) चल रहा एक औसत दर्जे का चीरा बनाते हैं।
  5. दो में कटौती, पार्श्व ribcage के तरफ ऊपर एक और हृदय और फेफड़ों को बेनकाब करने के लिए उरोस्थि भर में एक करके रिब पिंजरे काटें। किसी भी मेटास्टेसिस 27,29 के लिए फेफड़ों की पालियों की जाँच करें।
  6. असामान्यताओं के लिए सभी अंगों की जांच करने और रंग, आकार, और स्थिरता में किसी भी बदलाव के रिकॉर्ड है। यदि आवश्यक हो, आंतरिक ऊतकों की जांच के लिए एक स्केलपेल के साथ अंगों काटकर अलग कर देना। विशेष रूप से, जिगर, गुर्दे, प्लीहा और जठरांत्र संबंधी मार्ग की जांच।
  7. मेटास्टेसिस के लिए लिम्फ नोड्स निरीक्षण करें और 27,29 वृद्धि।
  8. ट्यूमर को इकट्ठा करने के लिए, पार्श्व चीरों के ऊपर और त्वचा चिमटी के साथ शरीर से दूर खींच लिया जा सकता है कि इस तरह के ट्यूमर से नीचे बना। मजबूती से चिमटी के साथ त्वचा पकड़े, ध्यान से ट्यूमर और dermis (चित्रा 5) के बीच काटने से ट्यूमर को हटाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें।
  9. इसके तत्काल बाद 10% तटस्थ बफर formalin के एक लेबल कंटेनर में ट्यूमर जगह है।
  10. ट्यूमर के आकार पर निर्भर करता है, की अनुमति देने के 1-2 दिनों (≤ 2 मिमी, छोटे) या 5-6 दिनों ऊतकीय विश्लेषण (चित्रा 6) के लिए वर्गों की तैयारी से पहले फिक्सिंग के लिए (> 2 मिमी, बड़े)।

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कारण कपास चूहों के अत्यंत उत्तेजनीय प्रकृति से परिचित जा रहा है और एक पूर्व नैदानिक ​​पशु मॉडल के रूप में उनके उपयोग में आसानी होगी जानवरों के तनाव को कम करने के लिए अनुकूलित प्रक्रियाओं का उपयोग करने के लिए। समुचित से निपटने की तकनीक का उपयोग भी शोधकर्ता के जोखिम को कम कर देंगे।

कपास चूहों का उपयोग करते समय यह शांत रहने के लिए जरूरी है। चूहों अत्यधिक उत्तेजनीय कर रहे हैं और अपने पिंजरे से बचने के लिए प्रयास करेंगे। एक संवर्धन ट्यूब और भागने का प्रयास कम कर देंगे nestlets का प्रयोग करें। चित्रा 2 संवर्धन ट्यूब की नियुक्ति सहित कपास चूहों के कब्जे में सहायता करने के लिए इष्टतम पिंजरे सेटअप पता चलता है। पीछे हटा करने में सहायता करने के लिए यदि संभव हो तो इसके अलावा, एक छोटे से कमरे में काम करते हैं। भागने की होती है, तो स्पष्ट कब्जा कंटेनर के साथ कवर या अत्यधिक बल का प्रयोग नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा, दस्ताने हाथ के साथ कवर, शांत हो जाओ और स्थिर रहने के लिए पशुओं के लिए प्रतीक्षा करें।

एक माउस के विपरीत, कपास चूहे एक लम्बी थूथन w हैhich संवेदनाहारी गैस वितरित करने के लिए ढाले एक अलग नाक की आवश्यकता है। 3 ठीक से एक कपास चूहे फिट और isoflurane के वितरण को अधिकतम करने के लिए इंजीनियर एक नाक शंकु दर्शाया गया चित्र। एक फिटिंग के रूप में एक रबर झिल्ली का प्रयोग चूहे की नाक को आघात हो सकता है।

त्यागें जानवरों प्राप्त यदि संभव हो तो चूहों पर उन्हें का प्रयास करने से पहले इंजेक्शन तकनीक का अभ्यास करने के लिए (उन अन्यथा अन्य शोधकर्ताओं, कपास चूहों या द्वारा की जरूरत नहीं)। इस शोधकर्ता सुइयों और कैसे उन्हें सुरक्षित रूप से संभाल करने के साथ परिचय प्राप्त करने के लिए अनुमति देगा। उनकी त्वचा एक माउस की तुलना में मोटे और कठिन है के रूप में इंसुलिन सीरिंज कपास चूहों में इंजेक्शन के लिए सुझाव दिया है। हालांकि, एक बड़ा सुई (21 जी एक्स 1 ') की वजह से इंजेक्शन के दौरान सेल बाल काटना करने के लिए सेल व्यवहार्यता के नुकसान से बचने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सुरक्षा सावधानियों इस तरह के एक sharps कंटेनर में सुइयों और उचित निपटान recapping के रूप में नहीं, पालन किया जाना चाहिए।

injecव्यवहार्य ट्यूमर कोशिकाओं के tion के उचित ट्यूमर गठन के लिए महत्वपूर्ण है। चित्रा 1 ए कपास चूहों में इंजेक्शन के लिए तैयार किया जा सकता है, जो LCRT कोशिकाओं की एक स्वस्थ monolayer से पता चलता है। इसकी तुलना में चित्रा 1 बी कम व्यवहार्यता है और इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए जो LCRT कोशिकाओं से पता चलता है। यह इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं की गिनती जब इस तरह के Trypan नीले धुंधला के रूप में एक विधि का उपयोग कर ट्यूमर सेल व्यवहार्यता सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

LCRT कोशिकाओं से बनाई ट्यूमर तेजी से बढ़ रहे हैं और परिगलित केन्द्रों अक्सर चित्रा (4 ए) के रूप में। जैसे, ट्यूमर गठन छालों (4B चित्रा) से बचने के लिए सावधानी से नजर रखी जानी चाहिए। छालों होती है, तो जानवर पूति से संक्रमण और संभव मौत से बचने के लिए बलिदान किया जाना चाहिए।

विरोधी ट्यूमर के उपचार के प्रभाव अक्सर सबसे अच्छा ऊतकीय विश्लेषण के माध्यम से जांच कर रहे हैं। यह ट्यूमर पोस्टमार्टम के छांटना की आवश्यकता है। को बनाए रखने के ट्यूमर के ऊतक अखंडता रेस होगीvivo में ट्यूमर का एक और अधिक सटीक प्रतिनिधित्व है, जो एक नमूने में ULT। चित्रा 5 ट्यूमर ध्यान से एक स्केलपेल और चिमटी का उपयोग आसपास के ऊतकों से अलग किया जाता है जिसके द्वारा एक छांटना तकनीक से पता चलता है। उचित ऊतकीय विश्लेषण प्रभावित ट्यूमर टूटना या ट्यूमर के ऊतक अखंडता को बाधित कर सकते हैं चिमटी का उपयोग आसपास के ऊतकों से बल द्वारा इसे खींच कर ट्यूमर निकाला जा रहा है। चित्रा 6 में देखा के रूप में ट्यूमर के घने और अत्यधिक vascularized संरचना, इस छांटना तकनीक द्वारा बनाए रखा है। कई OVS के साथ मामला है, क्योंकि यह ट्यूमर वाहिका संरचना को प्रभावित जो उपचार के विश्लेषण में महत्वपूर्ण है।

चित्रा 1
चित्रा 1:। स्वस्थ की LCRT प्रकोष्ठों के उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी छवि (ए) phenotype (~ 90% व्यवहार्य) कपास चूहों में इंजेक्शन के लिए तैयार करने के लिए तैयार LCRT कोशिकाओं। LCRT कोशिकाओं (बी) अवांछनीय phenotype के इंजेक्शन के लिए फिट नहीं। गोल कोशिकाओं मृत अथवा (एक तीर द्वारा इंगित) मर रहे हैं। छवियाँ 10X बढ़ाई पर कब्जा कर लिया गया; पैमाने बार = 1 मिमी।

चित्रा 2
चित्रा 2: कपास चूहों का कब्जा की आसानी के लिए पिंजरे सेटअप का उदाहरण पिंजरे और जानवर को पकड़ने में nestlets एड्स के शामिल किए जाने के अंत के खिलाफ संवर्धन ट्यूब का इष्टतम स्थान।।

चित्रा 3
चित्रा 3:। Anesthetized कपास चूहों को isoflurane की डिलीवरी के लिए फिटिंग संज्ञाहरण नाक शंकु निर्मित नाक शंकु नाक को आघात के बिना isoflurane गैस का सही वितरण सुनिश्चित करने के लिए कपास चूहे की लम्बी थूथन फिट बैठता है।

चित्रा 4:। एक चमड़े के नीचे LCRT ट्यूमर पर परिगलित ऊतक (ए) के ट्यूमर के ऊतक के परिगलन के प्रारंभिक चरणों। पशु ध्यान से (बी) पूरी तरह से खुला छालों को प्रगति से बचने के लिए निगरानी की जानी चाहिए। संक्रमण और पूति के रूप में ट्यूमर ulcerates परिणाम कर सकते हैं अगर पशु का बलिदान किया जाना चाहिए।

चित्रा 5
चित्रा 5:। ऊतक विज्ञान के लिए एक चमड़े के नीचे LCRT ट्यूमर के छांटना एक कपास चूहे की दिशा पर चमड़े के नीचे ट्यूमर ध्यान से इस प्रकार ऊतकीय विश्लेषण के लिए ट्यूमर वास्तुकला का एक बेहतर प्रतिनिधित्व प्रदान करने, ट्यूमर के ऊतक अखंडता को बनाए रखने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग त्वचा से हटा दिया जाता है।

चित्रा 6 चित्रा 6:। एक चमड़े के नीचे LCRT ट्यूमर से Histological ऊतक अनुभाग LCRT ट्यूमर के ऊतक की आकृति विज्ञान hematoxylin और eosin (एच एंड ई) के साथ दाग आयल एम्बेडेड वर्गों का उपयोग कर जांच की। छवि 20X बढ़ाई पर कब्जा कर लिया था; पैमाने बार = 1 मिमी।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium  Gibco 11965-092 May use any brand 
1X Phosphate Buffered Saline  Can prepare in lab, filter to sterilize
200 mM L-glutamine Gibco 25030164 May use any brand
100x Antibiotic-Antimycotic  Gibco 15240-062 May use any brand
Fetal bovine serum Quality Biological Inc. 110-001-101HI May use any brand
T-150cm2 tissue culture flask Fisher Scientific 14-826-80 May use any brand
1X TypLE Express Life Technologies 12604-013
12-well cell culture plate, flat bottom Fisher Scientific 08-772-29 May use any brand, must be tissue culture treated
alamarBlue Life Technologies DAL1025 May use an alternative reagent for determination of cell viability
8640 Teklad 22/5 Rodent diet Harlan  8640
1/8” corncob rodent bedding Harlan 7092
Nestlets Ancare - Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable
50 mL Conical tubes Fisher Scientific 14-432-22 May use any brand, must be sterile
Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic Pharmaceutical Partners of Canada Inc. M60302
70% Ethanol Can prepare in lab
10 % Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich HT501128 May use any brand
NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood) NAPCO Model used not currently available May use any brand
Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath Fisher Scientific Model used not currently available  May use any brand
Name Company Catalog Number Comments
Reichert Bright-line Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629 May use any brand
Typhoon Trio BioAnalyzer  GE Healthcare Life Sciences Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader Tecan Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Allegra 6R benchtop centrifuge Beckman Coulter 366816 May use any brand
Table Top Anaesthesia machine VetEquip Model used not currently available  May use any brand, must be portable
Wahl Peanut Mini Clippers Wahl May use any brand of small clippers
Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL BD 329464 May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin. 
Cotton swabs MedPro 018-425 May use any brand
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 8940 May use any brand
Dissecting Tissue Forceps Fisher Scientific 13-812-41 May use any brand

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References

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Oncolytic वायरस के पूर्व नैदानिक ​​मूल्यांकन के लिए अध्ययन में कपास चूहा की हैंडलिंग
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Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).More

Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).

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