Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.
깁슨 어셈블리 (GA) 복제는 기존의 DNA 복제 방법에 신속하고 안정적이며 유연한 대안을 제공합니다. 우리는 마우스 배아 줄기 세포에 외래 유전자 (mESCs)의 발현을위한 맞춤형 플라스미드를 만들 GA를 사용했다. SV40 인간 거대 세포 바이러스 프로모터의 통제하에 외래 유전자의 발현은 mESCs에 형질 전환 후 빠르게 감소한다. 이 감소 된 발현을위한 해결책은 유전자 발현을 구동하도록 인간 신장 인자 1 알파 (hEF1α) 프로모터를 사용하는 것이다. hEF1α를 포함하는 플라스미드 벡터는 SV40- 또는 CMV-포함하는 플라스미드, 특히도 포함 N- 말단 3xFLAG-태그 널리 사용할 수 없습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 hEF1α 프로모터의 표현력 규제에서 FLAG-태그 인 CstF-64 인 CstF-64 돌연변이 체를 발현하는 플라스미드를 제작하는 빠른 방법이다. GA 가능한 DNA 단편의 말단을 겹치는 클로닝을 할 DNA의 엑소 뉴 클레아 제, DNA 폴리머 라제 및 DNA 리가 아제를 사용하여 혼합.우리가 가능했다 템플리트 DNA를 바탕으로, 우리는 우리의 구조는 하나의 시퀀스로 조립 될 수 있도록 설계. 우리의 디자인은 네 개의 DNA 조각 사용 : pcDNA 벡터 3.1 벡터 백본, hEF1α 프로모터 1 부 (이중 가닥 합성 DNA 단편을 구입 3xFLAG 태그를 포함) 및 중 하나 인 CstF-64 또는 특정 인 CstF-64 돌연변이 hEF1α 프로모터 2 부. 이 단편의 서열은 DNA 단편을 생성하기위한 적절한 PCR 프라이머를 설계하기 프라이머 생성 도구에 업로드 하였다. PCR 후, DNA 단편을 선택 마커 및 복제 GA 반응을 포함하는 벡터가 조립 된 혼합 하였다. 개별 변형 박테리아 식민지에서 플라스미드를 분리 하였다. 플라스미드의 초기 화면은 순서 다음에, 제한 효소에 의해 수행되었다. 결론적으로, GA은 우리가 화면 및 검증을 구성 포함 5 일에서 유전자 발현을위한 맞춤형 플라스미드를 만들 수있었습니다.
통상적 인 DNA 클로닝 절차 함께 DNA 단편 가입 DNA 및 DNA 리가 아제를 절단하는 제한 효소의 사용에 의존한다. 다른 DNA 단편을 포함하는 발현 정의 구조는 하나의 생성 및 / 또는 다수의 제한 엔도 뉴 클레아 및 라이 게이션을 통해 DNA 단편의 후속 삽입에 DNA의 절단을 포함하는 순차적 인 절차이다. 이 절차의 주요 단점은 불가 관심 전장 단백질의 성공적인 DNA 클로닝 렌더링 (즉, 여러 절단 부위가있을 수) DNA 단편의 하나에 대한 적당한 제한 효소를 식별하기 어려울 수도 있다는 것이다. 따라서, 사용자 정의 표현의 생성을 사용자 정의 단백질 태그 효율적으로 세포의 종류 – 특이 적 프로모터의 전사 조절하에 구축은 매우 세심한 설계가 필요합니다. 또한 시간과 노동력이 소요되는 기술이다. 최근 여러 보고서 multip를 조립하는 방법을 설명제한없이 사용할 1 또는 2 단계 반응의 어느 하나를 동시에 연속 시퀀스 르 다른 합성 DNA 단편 1-3 효소. 클로닝 한 단계 반응 (모든 준비 작업 단계가 제외), 엑소 뉴 클레아 제의 DNA, DNA 중합 효소, DNA 리가 제 3 및 DNA 단편의 중첩 단부 (도 1)의 블렌드의 사용에 의존한다. 제한 효소의 사용은 전혀 존재하지 않기 때문에, 임의의 크기 및 (고도로 반복적 서열 제외) 시퀀스 조성물의 DNA 단편 원활한 구조에 융합 될 수있다. 최근 상용 키트 (깁슨 어셈블리; GA) 한 단계 복제 반응에 대한이 가능하게되었다. 이 키트는 사용자 정의 발기인 및 단백질 태그와 하나의 벡터의 모든 DNA 조각의 신속하고 비용 효율적으로 조립을 할 수 있습니다.
포유 동물 세포 배양 모델에서 외래 단백질을 발현하는 데 널리 사용되는 플라스미드 발현 벡터는 전사 레지 하에서 종종바이러스 성 거대 세포 바이러스 (CMV) 또는 유인원 바이러스 40 (SV40) 발기인의 위험률. 이러한 바이러스 성 프로모터는 포유 동물 세포 배양 계 대부분 모델에서 외인성 단백질의 강력한 일시적 발현을 제공한다. 그러나, 외래 단백질을 안정하게 발현하는 세포주의 생성으로 인해 확립 처리 4,5 중에 CMV 또는 SV40 프로모터의 전사의 침묵 종종 실패. 또한, SV40 프로모터 및 CMV 바이러스 충분히 림프 혈통 또는 배아 줄기 세포로부터의 세포에서 -6,7- 외인성 단백질의 발현을 촉진하지 않을 것이다. 바이러스 성 프로모터의 본질적인 제한에 대한 해결책은 강한 구성 적 프로모터 비 바이러스 8-10를 사용하는 것이다. 인간의 기원 중 하나는 잘 특성화 구조적으로 강하게 비 바이러스 성 프로모터 (hEF1α 리보솜 11 아미노 아실 tRNA에의 GTP 의존 관계의 촉매 작용에 관여) 신장 인자 1α (hEF1α) 프로모터이다. 그러나,hEF1α 프로모터를 함유하는 발현 벡터가 특히 것들 또한 관심 단백질의 아미노 말단 단부에서 3 × FLAG를 함유하는 플라스미드를 포함하는 바이러스 성 촉진제로서 널리 사용할 수 없습니다.
64,000 MW 절단 자극 인자 단백질 (인 CstF-64)는 복제 의존 히스톤의 mRNA 14,15 12,13 mRNA를 포함한 대부분의 3 '말단 처리에 관여한다. 인 CstF-64은 모든 신체 조직 (12)로 표현된다. 그 RNA 인식 모티브 절단 및 폴리아 데 닐화 사이트 (16)의 하류 초기 성적에 GU 풍부한 RNA 서열에 결합한다. 인 CstF-64 미리의 mRNA에 결합이 초기 성적 증명서를 효율적으로 endonucleolytic 분열을 촉진한다.
여기서, 프로토콜은 DNA 단편의 PCR 증폭을 사용하는 것이 기재되어있다 (화학적 유능한 박테리아 세포를 포함) 깁슨 어셈블리 클로닝 키트 3xFLAG 태깅 m 벡터의 정의를 생성하는 단계여러개 인 CstF-64 또는 돌연변이 인 CstF-64 hEF1α 프로모터 1의 발현에 따라 자신의 아미노 말단에.
GA 복제의 성공적인 사용은 항상 전체 구조 (그림 2와 그림 3)의 세심한 설계가 선행되어야한다.
프라이머 생성 도구를 설계 프라이머 서열주의 깊게 확인도 좋습니다. GA 프라이머는 프라이머 생성 도구를 사용하지 않고 생성 될 수있다. 그러나, 공구의 사용은 공정을 단순화하기 때문에 고도로 권장된다. 일반적으로, GA 복제에 대한 프라이머는 두 개의 기능적으로 서로 다른 시퀀스가 있어야합니다. 제 1 시퀀스는 DNA 단편을 특정하고, PCR을 사용하여 단편의 증폭을 허용한다. 두 번째 순서는 GA 조립에 필요한 인접 단편과 겹칩니다. 일반적인 DNA 단편 특정 시퀀스의 길이는 18-22 nt의 것이다. 동일한 DNA를 증폭하기 위해 사용되는 DNA 단편 특이 서열은 유사한 용융 온도와 GC 함량을 가져야한다. 중복 순서는해야 15 이상NT 적어도 48 ℃의 융해 온도와 길이. 4 개 이상의 DNA 단편의 조립체는 적어도 20 NT로 중첩 시퀀스를 필요로 할 것이다. 긴 중복 더 제대로 조립 된 DNA 조각의 결과로 어닐링의 증가 특이성을 수 있습니다. 그것은 왜곡 된 시퀀스가 적절한 DNA 어셈블리를 손상시킬 수 있기 때문에, 자신의 GC 또는 중복 시퀀스를 개발 콘텐츠 AT 왜곡되는 시퀀스를 방지하는 것이 좋습니다.
또한 어떠한 약물 내성 박테리아 콜로니, GA 반응에서 벡터 골격에 대응하는 단지 DNA 단편을 생성하지 않아야 음성 대조군으로 사용하여 제시한다. 대안 적으로, "삽입"을 포함하는 DNA 단편 중 하나도없는 약제 내성 세균 콜로니를 초래한다 GA 반응에서 생략 될 수있다. COMPL의 어셈블리를 렌더링 더 식민지가 인접한 DNA 조각의 중복 끝의 부족 될 것입니다 성장하지 않습니다 이유,죽어 야지 플라스미드.
프로토콜 설명에서 사용 때문에 DNA 단편의 수 (도 3)로, NT 프라이머 세트를 생성하기 위해 사용 하였다 (25)의 서열을 중첩. 6 DNA 단편 – 프라이머 생성 도구 웹 사이트의 추천 4 조립 적어도 20 NT 겹치는 서열을 사용하는 것 (장비 표 참조). 또한, 긴 DNA 가닥의 적절한 보완을 보장 시퀀스 겹치는 정확하게 조립 제품의 수를 증가 (도 1 참조).
현재, 원활한 복제에 대한 여러 시스템을 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 시스템의 일부는 여전히 (즉, 골든 게이트 18 복제) 제한 효소를 사용합니다. 다른 사람들은 같은 생물학적 소스 (19)에서 우두 바이러스 DNA 중합 효소 및 단일 가닥 DNA 결합 단백질에 따라 효소의 독점적 인 혼합을 사용합니다. 두 시스템은 쇼어 GA와 비교하여 제한되어시퀀스를 중첩 터 길이. 짧은 중첩 서열은 23 개 이상의 문제 DNA 단편의 적절한 어셈블리 렌더링 인접하는 DNA 단편을 어닐링 단계, 충분한 특이성을 제공 할 수 있기 때문에. 이러한 단점은 GA 시스템에 존재하지 않습니다.
(길이 즉, 8 미만 KBP) PCR에 의해 증폭 확실 크기를 초과하지 않도록 증폭되는 DNA 단편의 크기 역시 고려되어야한다. 심지어 지난 10 년의 DNA 중합 효소의 기능의 개선, 큰 DNA 조각은 덜 정확하고 효과적으로 증폭 될 것이다. 필요한 경우, 큰 DNA 단편을 플라스미드 단리 및 제한 효소 소화 적절한 DNA에 의해, 예를 들면 PCR 대안 다른 소스로부터 얻어 질 수있다. 구체적으로는, 현재의 원고에 기재된 프로토콜을 위해, 우리는 PCR을 사용하는 것이보다 합리적 모든 덜이었다 가능한 DNA 단편의 크기에 근거했다5 KBP. 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 식별되는 하나 이상의 PCR 생성물이 존재하는 경우, 바람직한 단편 크기의 겔 정제 가능한 분자 생물학 기술 또는 적합한 키트 중 하나를 사용하여 추천합니다. 현재 프로토콜에서 내열성 DNA 중합 효소 (재료의 표 참조)에 사용됩니다. 그러나 높은 충실도 및 수율을 제공하는 임의의 DNA 중합 효소는이 프로토콜에서 사용하기에 적합 할 것이다. 프로토콜에 설명 된 것과 다른 고성능 DNA 중합 효소를 사용할 수있는 경우 각각의 매뉴얼에 설명 된대로 설정 조건을 사용합니다. 현재 프로토콜에서 화학적으로 유능한 E. 콜라이 세포 GA 키트와 함께 제공되는 사용된다. 또한, 화학적 또는 전기 관할 E. 이러한 DH5α 또는 DH10B 대장균 균주로서 사용할 수있다.
배 마스터 믹스를 복제 어셈블리는 최소한의 실습 시간 사용이 편리합니다. 그러나 정확한 피펫은 북동 때문에 작은 볼륨으로 필요합니다eded 함께 혼합한다. 굿 분자 생물학 기법뿐만 아니라 항상 행사 될 필요가있다.
GA 복제는 더 이상 크기가 3 KBP보다 DNA 조각, 플라스미드 및 벡터의 건설을위한 무한한 가능성을 제공합니다. 그것은 예를 들면, 합성 및 조립을 허용하기 때문에 또한 그것은, 전체 세균 (미코 mycoides) 게놈 또는 효모 (사카로 미세스 세 레비 시아) 염색체 (20, 21), 합성 생물학의 분야에서 광범위한 영향을 미친다. 종래의 클로닝 원활한 구조를 생성하기 위해 필요에 기술도 적용 가능하다.
결론적으로, GA 복제는 기존의 DNA 복제 과정에 신속하고 안정적이고 유연한 대안을 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 관대하게 제공하여 pcDNA 3.1 myc의-그의 (A) 및 hEF1α 프로모터 포함하는 플라스미드를 들어, 텍사스 테크 대학 건강 과학 센터, 러벅, 텍사스와 믈라덴 Yovchev 피츠버그 의료 센터의 대학, 피츠버그에서 PA를 미카엘라 젠슨에게 감사의 말씀을 전합니다 . 이 책에서보고 된 연구는 보너스 번호 (CCM에) R01HD037109에서 아동 건강과 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 인간 개발의 유니스 케네디 슈라이버 국립 연구소에 의해 지원되었다. 추가 지원은 여성의 건강에 대한 (CCM 및 PNG에) 로라 부시 연구소했다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA) | Integrated DNA Technologies | We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available. | |
DNA purification magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | Agencourt AMPure XP – PCR Purification system |
Plasmid Isolation Mini Kit | Omega Bio-Tek Inc | D6942-01 | E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I |
Gibson Assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5510S | |
DNA polymerase | New England BioLabs | M0494S | Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix |
DpnI | New England BioLabs | R0176S | |
NheI | New England BioLabs | R3131S | |
NotI | New England BioLabs | R3189S | |
HindIII | New England BioLabs | R3104S | |
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop device | |
EditSeq | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
SeqBuilder | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
Word | Microsoft | Part of Microsoft Office | |
NEBuilder | New England BioLabs | primer generation tool: http://nebuilder.neb.com | |
NEBioCalculator | New England BioLabs | ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation |